旋毛蟲ES抗原對DC2.4細(xì)胞TLR4、NF-κB和AP-1 mRNA表達(dá)的影響

劉 暢，韓彩霞，李 巍，李曉云，路義鑫，王 澤，唐 穎，宋銘忻

旋毛蟲病(trichinellosis)是一種重要食源性人畜共患線蟲病[1]。旋毛蟲的排泄分泌抗原(excretory-secretory antigen, ES)在其對宿主的入侵和持續(xù)感染中起著關(guān)鍵的作用[2]，而持續(xù)感染機(jī)制包括逃避和耐受宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[3]。ES抗原通過與免疫活性細(xì)胞持續(xù)相互作用，不斷刺激、調(diào)控免疫系統(tǒng)來適應(yīng)宿主環(huán)境，其中樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)扮演著重要的角色[4]。

病原體∕病原體產(chǎn)物可能與DCs通過模式識別受體(pathogen recognition receptors, PRRs)家族中Toll 樣受體(toll-like receptors, TLRs)相互作用，刺激DCs釋放不同信號和細(xì)胞因子，啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答[5]。近年來，有少量研究涉及到ES抗原誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞[6-7]和DCs[8-9]等來調(diào)控獲得性免疫，這種調(diào)控作用取決于DCs處于促炎性還是免疫耐受狀態(tài)。ES抗原刺激未成熟的骨髓源性樹突狀細(xì)胞(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs)后使其獲得半成熟狀態(tài)[9]，而經(jīng)LPS預(yù)刺激再接受ES抗原刺激的DCs 通過與TLR4(LPS配體)的結(jié)合獲得免疫耐受[8]，這與LPS的反復(fù)刺激誘導(dǎo)DCs免疫耐受[10]相似。

鑒于免疫耐受受抗原性質(zhì)，PRRs和環(huán)境中細(xì)胞因子和信號分子機(jī)制的影響[10-11]，ES抗原反復(fù)刺激或者經(jīng)ES抗原預(yù)刺激后接受LPS/ES抗原的刺激是否也可以獲得相似的免疫效果不得而知，本實(shí)驗(yàn)從mRNA水平通過研究ES抗原和LPS的聯(lián)合作用對DC2.4細(xì)胞表面受體TLR4、髓樣分化蛋白88(MyD88)依賴信號通路的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探究旋毛蟲誘導(dǎo)免疫細(xì)胞免疫耐受狀態(tài)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株、旋毛蟲蟲種及抗原制備 DC2.4細(xì)胞系購自上海霖研生物技術(shù)有限公司。黑龍江豬旋毛蟲，由東北農(nóng)業(yè)大動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院獸醫(yī)寄生蟲學(xué)教研室保種。旋毛蟲的肌幼蟲ES抗原制備依照胃蛋白酶消化法進(jìn)行[12]，內(nèi)毒素水平經(jīng)測試低于0.2 EU/mL，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

1.2主要試劑和器材 LPS為Sigma公司產(chǎn)品。RPMI1640培養(yǎng)基為美國Hyclone公司產(chǎn)品。特級胎牛血清(FBS)，100 000 IU/mL青霉素/鏈霉素為天津?yàn)笊锕井a(chǎn)品。rTaq聚合酶、PMD18-T載體，Trizol，SYBR Premix ExTaqII為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。E.coil DH5α為全式金公司產(chǎn)品。Forma Scientific型超凈臺為上海博遜實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。PCR儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品。DHP-9082型恒溫培養(yǎng)箱為上海一恒科技有限公司產(chǎn)品。島津UV-120-02型紫外分光光度計(jì)為日本島津公司產(chǎn)品。7500Fast型熒光定量PCR儀為ABI公司產(chǎn)品。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及處理 DC2.4用1640培養(yǎng)基(包含10%胎牛血清，2 mmol/L L-谷胱氨酸，100 U/mL青霉素，100 μg /mL雙鏈霉素)，在37 ℃，5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)。

ES抗原按濃度梯度(0，5，10，15，20，25 μg/ml)，時(shí)間梯度(0，4，8，12，16，20，24 h)刺激DC2.4(濃度為106個(gè)/mL)，設(shè)置陽性對照組(LPS組)。實(shí)驗(yàn)組設(shè)置如下：空白對照組(PBS組)；LPS組；ES抗原組；LPS預(yù)刺激12 h后更換新鮮1640培養(yǎng)基，再分別添加LPS和ES抗原再次刺激12 h (ES抗原+LPS/ES抗原組)；ES抗原預(yù)刺激12 h后更換新鮮1 640培養(yǎng)基，分別添加LPS和ES抗原再次刺激12 h(LPS+ LPS/ES抗原組)。以上刺激物L(fēng)PS、ES抗原濃度分別為100 ng/mL、10 μg/mL，每組設(shè)置重復(fù)孔。終止細(xì)胞培養(yǎng)，離心，細(xì)胞沉淀用PBS洗滌，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4熒光定量PCR方法建立

1.4.1熒光定量和標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增引物PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank登陸的小鼠Gapdh( NM_008084.2)，TLR4 (NM_021297.2)，NF-κB( AY521462.1)，AP-1 (NM_010591.2)基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0和oligo 6.0設(shè)計(jì)和分析引物，BLAST驗(yàn)證引物特異性。Gapdh基因熒光定量上游引物5′-GTGAAGGTCGGTGTGAACGG-3′，下游引物 5′-TCCTGGAAGATGGTGATGGG-3′，擴(kuò)增長度為227 bp；標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增上游引物5′-CCAGCCTCGTCCCGTAGACA-3′，下游引物5′-ATACTCAGCACCGGCCTCACCC-3′，擴(kuò)增長度為298 bp。TLR4 基因熒光定量上游引物5′-AGTCCCTGATGACATTCCTTCTT-3′，下游引物5′-AAGTTTGAGAGGTGGTGTAAGCC-3′，擴(kuò)增長度為180 bp；標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增上游引物5′-CACTGTTCTTCTCCTGCCTGA-3′，下游引物5′-TTCCCTGAAAGGCTTGGTCT-3′，擴(kuò)增長度為633 bp。NF-κB 基因熒光定量上游引物5′-AGCCTCCAGCCCCGTGA-3′，下游引物5′-CAATAGGTCCTTCCTGCCCATA-3′，擴(kuò)增長度為221 bp ；標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增上游引物5′-CCACCTATGATGGGACTAC-3′， 下游引物5′-GATTCTCCAGCACCTTTG-3′，擴(kuò)增長度為887 bp。AP-1基因熒光定量上游引物 5′-GTGCCAACTCATGCTAACGC-3′，下游引物5′-GGTCGCAACCCAGTCCATC-3′，擴(kuò)增長度為181 bp；標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增上游引物5′-GCATCCACGGCCAACAT-3′，下游引物5′-CCTTCCCACTCCAGCACA-3′，擴(kuò)增長度為288 bp。所有引物均由上海英駿生物工程有限公司合成。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建 以步驟1.5所得cDNA為模板，用標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增引物通過PCR的方法擴(kuò)增小鼠Gapdh，TLR4，NF-κB和AP-1基因片段。目的片段產(chǎn)物純化，PMD18-T載體連接，E.coil DH5α轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒提取，PCR鑒定，利用紫外分光光度儀測量質(zhì)粒濃度，再根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)換算公式計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)，用ddH2O進(jìn)行10倍倍比稀釋(100～104共5個(gè)梯度)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 通過SYBR Green染料法，分別對Gapdh，TLR4，NF-κB和AP-1熒光定量PCR反應(yīng)過程中的退火溫度及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃變性3 s，56 ℃～62 ℃退火20 s～30 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。

1.4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以起始模板質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度(lg)為X軸，獲得的Ct值為Y軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過溶解曲線情況分析引物特異性，并計(jì)算擴(kuò)增效率。

1.5TLR4，NF-κB和AP-1基因 mRNA表達(dá)水平檢測 根據(jù)步驟1.4建立的熒光定量檢測體系，對各組樣品中的相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行定量檢測，得到檢測樣品的Ct值。根據(jù)建立好的標(biāo)準(zhǔn)曲線代入Ct值得到樣品濃度值，△△Ct法計(jì)算相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1熒光定量PCR 檢測TLR4，NF-κB和AP-1 mRNA表達(dá)水平方法建立

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)品目的片段擴(kuò)增與構(gòu)建 標(biāo)準(zhǔn)品目的片段(Gapdh，TLR4，NF-κB和AP-1)經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后，菌液由北京華大基因公司進(jìn)行測序，結(jié)果用DNAMAN序列比對分析，將與GeneBank報(bào)道序列100%一致的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示各目的條帶與預(yù)期大小相符(圖1)。紫外分光光度計(jì)檢測質(zhì)粒濃度。

2.1.2Gapdh，TLR4，NF-κB和AP-1 mRNA熒光定量PCR檢測方法的建立 經(jīng)過優(yōu)化，確定熒光定量PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃變性3 s，退火溫度60 ℃，退火時(shí)間30 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。結(jié)果Gapdh，TLR4，NF-κB和AP-1融解曲線峰值單一(圖略)，說明引物特異性良好。以ABI 7500Fast熒光定量PCR儀進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以起始模板質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度(lg)為X軸，Ct值為Y軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)(R2)都在0.99～1之間，擴(kuò)增效率都在0.8～1.2之間，符合△△Ct相對定量分析方法的標(biāo)準(zhǔn)，可以用△△Ct法進(jìn)行表達(dá)差異分析。

2.2ES抗原誘導(dǎo)DC2.4 TLR4 mRNA 表達(dá)的劑量效應(yīng) 圖2顯示，空白對照組有少量TLR4 mRNA表達(dá)，隨著ES抗原濃度增加(0～15 μg /mL)，TLR4 mRNA表達(dá)量逐漸升高，濃度繼續(xù)增加TLR4 mRNA表達(dá)量有減少的趨勢。ES抗原濃度在5～15 μg /mL范圍內(nèi)，TLR4 mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；20、25μg /mL與15μg /mL相較，TLR4 mRNA表達(dá)量差異顯著。

圖1GAPDH，TLR4，NF-κB和AP-1重組質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) ；1,3,5,7：GAPDH，TLR4，NF-κB和AP-1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2,4,6,8：GAPDH，TLR4，NF-κB和AP-1雙酶切鑒定

Fig.1PCRandrestrictionenzymedigestionanalysisoftherecombinantplasmid

M: DL5000 DNA maker; 1,3,5,7: Product of PCR for GAPDH, TLR4, NF-κB and AP-1; 2,4,6,8: Product from GAPDH, TLR4, NF-κB and AP-1 digested by recombinant plasmid.

圖2ES抗原誘導(dǎo)DC2.4TLR4mRNA表達(dá)的劑量效應(yīng)

*與空白對照組相較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，n=3)；

**與空白對照組相較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，n=3)

Fig.2EffectofESantigenontheexpressionofTLR4inDC2.4stimulatedfordifferentdosages

N=3 independent experiments. *P<0.05 and **P<0.01 versus the control group.

2.3ES抗原誘導(dǎo)DC2.4 TLR4 mRNA 表達(dá)的時(shí)間效應(yīng) 圖3顯示，用終濃度10 μg /mL的ES抗原作用DC2.4，隨時(shí)間增加TLR4 mRNA表達(dá)量逐漸升高。作用12 h后，與空白對照組對比，TLR4 mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨時(shí)間繼續(xù)增加，TLR4 mRNA表達(dá)量減少，作用20 h組與作用12 h組對比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3ES抗原誘導(dǎo)DC2.4TLR4mRNA表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)

*與空白對照組相較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=3)；

**與空白對照組相較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，n=3)

Fig.3EffectofESantigenontheexpressionofTLR4inDC2.4stimulatedfordifferentdosages

N = 3 independent experiments. *P<0.05 and **P<0.01 versus the control group

2.4ES抗原和LPS聯(lián)合誘導(dǎo)DC2.4 TLR4、NF-κB和AP-1 mRNA表達(dá)變化 圖4顯示，陽性對照組和ES抗原組分別與空白對照組對比，TLR4、NF-κB和AP-1 mRNA表達(dá)量增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；分別經(jīng)過LPS和ES抗原預(yù)作用后再經(jīng)過ES抗原和LPS作用，TLR4、NF-κB和AP-1 mRNA表達(dá)量分別較相應(yīng)的陽性對照組均較少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖4ES抗原和LPS聯(lián)合誘導(dǎo)DC2.4TLR4、NF-κB和AP-1mRNA表達(dá)

*與空白對照組相較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=3)；

**與空白對照組相較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，n=3)

Fig.4EffectofESantigenandLPSontheexpressionofTLR4,NF-κBandAP-1inDC2.4

N=3 independent experiments. *P<0.05 and **P<0.01 versus the control group.

3 討 論

寄生蟲可以通過分泌物誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活化從而發(fā)揮免疫耐受效應(yīng)，以利于蟲體在宿主體內(nèi)的長期存活[13]。例如，某些蠕蟲分泌物通過識別DCs 上的 TLRs，如曼氏血吸蟲產(chǎn)生的乳酸菌 N-fucopentaose III和棘唇線蟲(Acanthocheilonema viteae)分泌物ES-62通過識別TLR4誘導(dǎo)Th2 反應(yīng)[14-15]，血吸蟲特異性磷脂酰絲氨酸脂質(zhì)通過識別TLR2誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生Treg[16]，實(shí)現(xiàn)對機(jī)體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)。樹突狀細(xì)胞(DCs)是架接天然免疫和獲得性免疫的橋梁，是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞。DC2.4是來源于C57BL/6小鼠骨髓不成熟樹突狀細(xì)胞系，常用作腫瘤、免疫和器官移植方面的研究模型[17]，因而本研究選擇DC2.4做體外研究。熒光定量PCR因其具有的操作簡單，迅速快捷，結(jié)果靈敏度高，特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、基因檢測等前沿臨床和科研領(lǐng)域。

Aranzamendi[8]等報(bào)道，旋毛蟲ES抗原通過與DCs 上的TLR4結(jié)合誘導(dǎo)DCs成熟。本研究首次發(fā)現(xiàn)ES抗原對DCs刺激后TLR4 mRNA表達(dá)水平在一定范圍內(nèi)具有劑量和時(shí)間依賴性，隨著濃度的升高和時(shí)間的增加對TLR4則有抑制趨勢的結(jié)果。ES抗原取濃度為10 μg /mL，時(shí)間為12 h時(shí)作用于DC2.4 TLR4表達(dá)水平較空白組顯著，以此作為后續(xù)研究的ES抗原作用最佳劑量和時(shí)間。

除TLR3外，所有的TLRs均能啟動(dòng)髓樣分化蛋白88(MyD88)依賴信號通路，通過兩種途徑分別活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1，最終促進(jìn)IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α等炎性細(xì)胞因子的分泌[18-19]。本研究首次模擬體內(nèi)ES抗原和LPS的相互復(fù)雜作用對宿主免疫系統(tǒng)的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1與TLR4的mRNA表達(dá)水平變化成正比，證實(shí)旋毛蟲ES抗原可與TLR4配體LPS一樣從基因水平上啟動(dòng)MyD88信號通路。分別與ES抗原和LPS單獨(dú)刺激組相較，ES抗原+ ES抗原組和LPS+ LPS組TLR4、 NF-κB和AP-1的mRNA表達(dá)水平降低；ES抗原組+ LPS與ES+ ES抗原組，LPS+ ES抗原組與LPS+ LPS組兩兩對比，發(fā)現(xiàn)ES抗原或LPS預(yù)刺激后再經(jīng)ES抗原或LPS刺激，TLR4、NF-κB和AP-1的mRNA表達(dá)水平較ES抗原和LPS單獨(dú)刺激組降低，表明ES抗原持續(xù)刺激或者與LPS交叉刺激，可能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生類似于LPS持續(xù)刺激誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞獲得免疫耐受的效果。

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