肺孢子菌感染或定植與呼吸系統(tǒng)疾病的相關(guān)性探討

張 楠，譚麗思，秦 錚，馬素麗，國九英，樊 華，安春麗

肺孢子菌(Pneumosystis)是一種機會性感染真菌，由其導(dǎo)致的肺孢子菌肺炎(Pneumosystisjiroveciipneumonia, PJP，過去稱卡氏肺孢子蟲肺炎Pneumosystispneumonia，PCP)是AIDS、器官移植受者、抗腫瘤放、化療等各類繼發(fā)或原發(fā)性免疫機能低下人群最常見的機會感染性疾病[1-2]。對免疫機能低下人群的生命和生存質(zhì)量構(gòu)成嚴重威脅。國外學(xué)者還發(fā)現(xiàn)肺孢子菌的感染或定殖(colonization)與慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD)、肺囊性纖維變以及間質(zhì)性肺炎等多種嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此，如何監(jiān)測肺孢子菌的感染或定殖被認為是當前的一項重要研究課題[3-5]。已有諸如PCR等多種基因檢測方法被研究用于肺孢子菌定殖的檢測研究中。其中，巢式PCR和Real time PCR等被認為是檢測肺孢子菌基因的較好手段。但是，前者需要兩次PCR過程，大大增加了反應(yīng)時間。后者雖然具有快速、靈敏和容易標準化等優(yōu)點，但是其復(fù)雜的操作程序和昂貴的試劑和設(shè)備限制了其臨床應(yīng)用[6]。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是2000年由日本學(xué)者創(chuàng)建的一種新的基因檢測方法。因其具有高效、敏感、特異和簡捷等優(yōu)點而備受青睞,目前已被用于多種感染性疾病的基因診斷[7]。本研究依據(jù)GeneBank發(fā)布的肺孢子菌基因序列，設(shè)計了3對特異性引物，構(gòu)建了檢測肺孢子菌16S rRNA基因的LAMP反應(yīng)體系。在對感染動物模型檢測，證明其敏感性強、特異性好的基礎(chǔ)上，對臨床肺疾病患者進行了肺孢子菌基因檢測，研究分析呼吸系統(tǒng)疾病與肺孢子菌定殖或感染的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本收集 自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收集臨床疑似病例，如艾滋病、腎移植、癌癥等基礎(chǔ)疾病合并肺感染者以及COPD、間質(zhì)性肺疾病等慢性呼吸系統(tǒng)疾病急性發(fā)作期患者的痰液共98例樣本。患者有發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難等臨床癥狀，胸片或CT顯示：肺紋理增多、增粗、條索樣陰影或磨玻璃狀陰影等肺間質(zhì)改變。其中男56例，女42例，年齡22～91歲，平均年齡62歲。收集痰標本時，囑患者留取清晨清潔口腔后用力咳出的深部痰液，連續(xù)收集24 h，置無菌痰盒中備檢。

本研究遵循的程序符合倫理學(xué)標準并得到人體試驗委員會的批準，取得受試對象的知情同意。

1.1.2儀器與試劑 儀器：恒溫水浴鍋，ABI7500Real Time PCR儀。試劑：Tris 平衡酚和氯仿分別為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程醫(yī)學(xué)研究所和北京化工廠產(chǎn)品，蛋白酶K、dNTP、MgSO4、DNA相對分子質(zhì)量標志物(DL2000)、PMD18-T Vector試劑盒購自上海寶生物有限公司，Betaine購自Sigma生物公司、Bst DNA聚合酶購自NEB生物公司，SYBR GREENⅠ顯色液，SYBR GREENⅠ，瓊脂糖購自上海生物技術(shù)有限公司，瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒(普通離心柱型)和小提質(zhì)粒試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1LAMP檢測

1.2.1.1引物設(shè)計與合成 從GeneBank獲得肺孢子菌核內(nèi)核糖體小亞基16s rRNA的基因序列(X12708)，并與耶氏肺孢子菌(AB266392)、小鼠肺孢子菌(AY532651)、酵母菌屬(Z75578)和念株菌屬(E15168)等的16s rRNA在DNA man軟件上進行比對，選取保守性好的一段基因。利用在線軟件(primer explorer V4 http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計的16s rRNA特異性LAMP引物，見表1。

表1 LAMP 引物及其堿基序列

1.2.1.2臨床痰液標本DNA的提取 向痰液中加入4倍體積的1 mol/L氫氧化鈉, 混合振蕩液化30 min。12 000 r/min離心5 min, 棄上清，沉淀用T10E10緩沖液洗3次, 12 000 r/min離心5 min, 取沉淀，向離心管中加入40 μL雙蒸水并與沉淀充分混勻，100 ℃煮沸15 min，然后至于冰上10 min。最后，將離心管12 000 r/min離心10 min，收集上清液備用。

1.2.1.3LAMP反應(yīng)體系及條件 F3、B3 5 pmol/L，BIP、FIP 40 pmol/L，LoopB、LoopF 20 pmol/L，5 mol/L Betaine 2 μL，dNTP 0.2 mmol/L，10xBuffer 2.5 μL，8 U/μL Bst DNA聚合酶(NEB公司)，SYBR GREENⅠ0.5μL，模板2 μL，加雙蒸水至 25 μL；63°水浴60 min或者使用ABI7500Q-PCR儀進行擴增。

1.2.1.4LAMP產(chǎn)物的檢測 水浴后取5 μL PCR擴增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為120 mV,時間為40 min。電泳后在UVP紫外凝膠成像分析儀中觀察結(jié)果并記錄。在反應(yīng)管中入SYBR GREENⅠ顯色液觀察顏色變化結(jié)果，或者使用ABI 7500儀器 60 min，觀察熒光信號收集曲線。

1.2.2特異性檢驗 分別取100 ng的肺孢子菌、白色念珠菌、熱帶假絲念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、支原體FH株、溶血性鏈球菌以及金黃色葡萄球菌MRSA株基因組DNA作為LAMP擴增的模板(菌株DNA由中國醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室提供)。按照上述反應(yīng)體系進行LAMP擴增，并加入SYBR GREENⅠ熒光顯色液，觀察顏色反應(yīng)。

1.2.3敏感性檢驗 從感染大鼠模型提取肺孢子菌基因組DNA，構(gòu)建重組質(zhì)粒PMD18-T-16s rRNA，將重組質(zhì)粒PMD18-T-16s rRNA，稀釋出一系列的拷貝量(1012，1011，1010，109，108，107，106，105，104，103，102，50，10)，以稀釋的質(zhì)粒DNA作為模版，分別應(yīng)用上述反應(yīng)體系，進行普通LAMP 、普通PCR反應(yīng)。并觀察LAMP反應(yīng)產(chǎn)物熒光信號收集量，同時用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴增產(chǎn)物。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，臨床標本采用多樣本率的χ2檢驗。P小于0.05為差異有關(guān)統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1特異性 特異性檢測結(jié)果如圖1所示，綠色熒光為陽性反應(yīng)，棕黃色為陰性反應(yīng)。

2.2敏感性 LAMP檢測肺孢子菌基因最低檢出拷貝數(shù)為50 copies/mL，見圖2a，普通PCR最低檢出率為104copies/mL，見圖3b。

圖1LAMP檢測肺孢子菌特異性結(jié)果

1：肺孢子菌，2：白色念珠菌，3：熱帶假絲念珠菌，4：近平滑念珠菌，5：光滑念珠，6：支原體FH株，7：溶血性鏈球菌，8：金黃色葡萄球菌MRSA株。

Fig.1SpecificityoftheLAMPassaysforthedetectionofPneumocystis

圖2比較LAMP和PCR方法檢測肺孢子菌的敏感性

Fig.2A 1: 109copies/mL; 2: 108copies/mL; 3: 107copies/mL; 4: 106copies/mL; 5: 105copies/mL; 6: 104copies/mL; 7: 103copies/mL; 8: 102copies/mL; 9: 50 copies/mL; 10: 10 copies/mL; X軸: 時間; Y軸: 熒光收集量。

Fig.2ComparativesensitivityoftheLAMPandPCRassaysforthedetectionofPneumocystis

Fig.2A 1: 109copies/mL; 2: 108copies/mL; 3: 107copies/mL; 4: 106copies/mL; 5: 105copies/mL; 6: 104copies/mL; 7: 103copies/mL; 8: 102copies/mL; 9: 50 copies/mL; 10: 10 copies/mL; X-axis: time; Y-axis: fluorescence collection

Fig.2B 1: 1012copies/mL; 2: 1011copies/mL; 3: 1010copies/mL; 4: 109copies/mL; 5: 108copies/mL; 6: 107copies/mL; 7: 106copies/mL; 8: 105copies/mL; 9: 104copies/mL; 10: 103copies/mL.

2.3臨床標本檢測結(jié)果 應(yīng)用LAMP和普通PCR檢測方法分別檢測98例臨床疑似病例痰液標本。LAMP方法檢測結(jié)果通過熒光信號收集(圖3)、顯色反應(yīng)(圖4)、以及電泳方法(圖5)判定。經(jīng)LAMP方法檢測的陽性樣本62例，PCR方法檢測陽性樣本為22例，陽性率分別為63.27%、22.45%。其中PCR檢測出陽性的標本，LAMP方法檢測也均為陽性。檢測結(jié)果通過對16s rRNA測序確定為肺孢子菌基因。

圖3LAMP檢測臨床樣本熒光信號結(jié)果

1：陽性對照，2：臨床樣本，3：陰性對照，X軸：時間，Y軸：熒光收集量

Fig.3FluorescenceoftheLAMPassayforthedetectionofclinicalsamples

1: positive control； 2: sample； 3: negative control； X-axis: time; Y-axis: fluorescence collection.

結(jié)果顯示，98例臨床患者中，合并感染患者有63例，感染的細菌種類分析以及檢測結(jié)果分別見(表2、3)。

圖4LAMP檢測臨床樣本熒光顯色結(jié)果

1：陽性對照，2：臨床樣本，3：陰性對照

Fig.4ChromomericreactionoftheLAMPassayforthedetectionofclinicalsamples

1: positive control, 2: sample, 3: negative control.

圖5LAMP檢測臨床樣本電泳結(jié)果

M：Marker DL2000，1：陽性對照，2、3：臨床樣本，4：陰性對照

Fig.5ElectrophoresisoftheLAMPassayforthedetectionofclinicalsamples

M: Marker DL2000; 1: positive control, 2, 3: sample, 4: negative control.

表2 合并感染患者與非合并感染者肺孢子菌基因檢出率

*：與合并感染患者相比，χ2檢驗，χ2=6.902,p>0.05

Note: *Compared with patients infected, χ2= 6.902,P>0.05.

收集臨床的樣本中，慢性肺部慢性疾病患者59例，其中慢性支氣管炎患者1例，COPD患者47例，哮喘1例，支氣管擴張4例。47例COPD患者中有32例患者處于穩(wěn)定期，15例處于急性加重期，非COPD患者有51例。

在檢測的98例樣本中CT和肺部X光顯示肺部影像學(xué)有改變的51例，其中小斑片影及磨玻璃密度影的24例，網(wǎng)狀索條影的9例，肺間質(zhì)病變10例，肺紋理增強23例。LAMP檢測結(jié)果見表5。

CD4+T淋巴細胞計數(shù)和肺孢子菌基因檢出率結(jié)果(表6)，對CD4+T淋巴細胞計數(shù)<410(個/μL)和CD4+T淋巴細胞計數(shù)>410(個/μL)兩組病人肺孢子菌基因檢出率進行χ2檢驗，χ2=4.044，P=0.044<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

用LAMP技術(shù)，分別對1,3-β-D-葡聚糖血含量升高和1,3-β-D-葡聚糖血含量正常的患者進行肺孢子菌基因?qū)Ρ葯z測，結(jié)果如表7所示。

3 討 論

伴隨著艾滋病、器官移植受者、抗腫瘤放、化療等各類繼發(fā)或原發(fā)性免疫機能低下人群的日趨增多，PJP/PCP在臨床上逐步成為“常見病”。而有關(guān)肺孢子菌定殖與一些重要的呼吸系統(tǒng)疾病的相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)更加引起醫(yī)學(xué)界廣泛重視。本研究建立了檢測肺孢子菌定殖的LAMP 方法，通過構(gòu)建的質(zhì)粒，在同等條件下分別用LAMP和PCR方法對質(zhì)粒模版進行擴增，對比其敏感性，結(jié)果表明LAMP檢測肺孢子菌的敏感性比PCR高出100倍以上。而且，LAMP反應(yīng)僅需要通過水浴鍋等恒溫設(shè)備保溫1h就可以針對目的片段完成109～1010拷貝數(shù)的擴增。檢測時間比 PCR 縮短了2 h，具有明顯縮短時間的優(yōu)勢。LAMP檢測對DNA的純度要求不高，因此不需要耗時的DNA純化步驟，針對臨床樣本，僅需要收集疑似病例24 h深部痰液，通過煮沸方法提取基因組DNA就可以完成檢測，樣本獲得相對容易，患者耐受性好。更重要的是實驗結(jié)果可以直接肉眼觀察，不需要經(jīng)驗豐富的研究人員進行分析。根據(jù)熒光顯色液在反應(yīng)管中的顏色變化便可以讀出結(jié)果，減少開蓋次數(shù)從而避免污染，保證檢測的可靠性。

表3 合并感染病原體的種類與肺孢子菌基因檢出率

χ2檢驗，χ2=7.808，p> 0.05

Note:χ2= 7.808,P> 0.05.

表4 COPD患者肺孢子菌基因檢出率

*：與非COPD患者相比，χ2檢驗，χ2=5.549，p>0.05;**：與COPD 穩(wěn)定期相比χ2檢驗，χ2=7.198，p>0.05;

***：COPD 急性期與非COPD相比χ2檢驗，χ2=3.175，p>0.05

Note: *Compared with non-COPD, χ2=5.549,P> 0.05;**Compared with stable COPD, χ2=7.198,P>0.05;

***COPD acute phase compared with non-COPD, χ2=3 .175,P> 0.05.

表5 肺孢子菌基因檢測與肺影像學(xué)分析

*：與肺部無影響學(xué)改變者相比，χ2檢驗，χ2=3.944，P<0.05

Note: *Compared with no change in lung,χ2= 3.944,P<0.05.

表6 CD4+ T淋巴細胞數(shù)與肺孢子菌基因檢出率

*：與CD4+T淋巴細胞計數(shù)>410(個/μL)患者相比P<0.05

Note: *Compared with CD4+T lymphocyte counts> 410 (a/μL) patients,P<0.05.

表7 1,3-β-D-葡聚糖含量與肺孢子菌基因檢出率

*：與1,3-β-D-葡聚糖血含量正常者相比，P>0.05

Note: *Compared with glucan 1,3-β-D-normal amount,P> 0.05.

本研究中，合并感染患者有63例，非合并感染35例。合并感染和非合并感染兩組患者肺孢子菌基因檢出率分別為60.3%和75.0%。合并感染者肺孢子菌基因陽性率明顯低于非合并感染者，其原因可能是合并其他細菌感染抑制了肺孢子菌的定殖或感染。對比合并不同菌種感染與肺孢子菌基因檢出率的高低，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)意義的差別，認為肺孢子菌感染與合并感染菌種無關(guān)。

收集臨床的樣本中，慢性肺部慢性疾病患者59例，其中COPD患者47例。 47例COPD患者中有31例處于穩(wěn)定期，15例處于急性加重期。肺孢子菌檢測結(jié)果表明急性期與穩(wěn)定期無明顯差異，與前人[8,9]報道的COPD患者肺孢子菌檢出率較高并與COPD嚴重程度相關(guān)的結(jié)果不一致。分析原因如下，收集的這些臨床樣本中除了有慢性肺部慢性疾病患者，還有間質(zhì)性肺炎、嚴重肺部感染、惡性腫瘤、腎移植術(shù)后、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等患者，這些患者都屬于PCP的高危人群，一定程度上屬于人為的控制樣本質(zhì)量。最近一篇研究報道COPD患者痰標本肺孢子菌檢出率為55%[11]，本研究中PDCO的PCP檢出率為53.19%，與報道中基本一致。

近些年來，臨床上常用肺部影像學(xué)改變、血液中CD4+T細胞數(shù)量[10-13]等指標輔助診斷或預(yù)測PCP。本研究在國內(nèi)首次采用改良的LAMP方法檢測呼吸道標本中肺孢子菌基因，對比觀察上述兩個指標。在檢測的98例樣本中CT和肺部X光顯示肺部有影像學(xué)改變的有51例，其中小斑片影及磨玻璃密度影改變的24例，網(wǎng)狀索條影改變的9例，肺間質(zhì)病變10例，肺紋理增強23例。LAMP檢測結(jié)果，肺部影像學(xué)有改變者肺孢子菌基因檢出率為72.5%，肺部影像學(xué)無改變者的檢出率為53.2%，χ2檢驗表明兩者差異顯著。這一結(jié)果符合相關(guān)報道[11]稱肺孢子菌作為機會性感染病原體侵入患者肺部主要停留在肺泡間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)引起肺泡性炎肺間質(zhì)炎以及小葉間隔增厚，在影像學(xué)上表現(xiàn)為磨玻璃樣改變及網(wǎng)狀影的影像學(xué)改變的解釋。

作為機會感染性疾病，PCP發(fā)生與CD4+T淋巴細胞數(shù)密切相關(guān)。因此，臨床上將CD4+T淋巴細胞數(shù)用作預(yù)測免疫功能低下者是否合并PCP的重要指標[12-13]。當CD4+T淋巴細胞計數(shù)<200(個/μL)時患PCP可能性幾乎為100%。目前，臨床把CD4+T淋巴細胞計數(shù)正常值界定為410～1 590(個/μL)。本文根據(jù)這一界線對比LAMP對CD4+T淋巴細胞計數(shù)<410(個/μL)和CD4+T淋巴細胞計數(shù)>410(個/μL)兩組人群肺孢子菌基因檢出率。結(jié)果表明CD4+T淋巴細胞數(shù)降低患者檢出率80.0%；CD4+T 淋巴細胞數(shù)正常者的檢出率為60.27%，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。進一步說明CD4+T淋巴細胞數(shù)與PCP的相關(guān)性。

1,3-β-D-葡聚糖真菌細胞壁的一種表面糖蛋白,增高可作為真菌感染的指標[14]。臨床規(guī)定1,3-β-D-葡聚糖正常值范圍是<10 pg/mL。根據(jù)此標準，本研究對比了1,3-β-D-葡聚糖血升高和正常者肺孢子菌基因的檢出率。結(jié)果顯示兩組病人的肺孢子菌基因檢出率并無顯著差異。這一結(jié)果可以解釋為1,3-β-D-葡聚糖血升高患者可能有其他真菌感染，并非是肺孢子菌感染所致。

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