ICOS轉(zhuǎn)基因小鼠感染日本血吸蟲后HSCs活化效應及對肝纖維化的影響

梁 松，王 波，許 靜，董蘭蘭，王言言，趙 波，夏超明

血吸蟲病是以蟲卵誘發(fā)宿主肉芽腫反應及繼發(fā)纖維化為特征的免疫病理性疾病。血吸蟲病肝纖維化是一個機體纖維合成和基質(zhì)降解失衡的動態(tài)變化過程，可導致門靜脈高壓、肝硬化、腹水等并發(fā)癥[1-2]。HSCs的活化已被認為是肝纖維化發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，其活化、增殖以致發(fā)生表型和功能的改變，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，并大量合成以Ⅰ型、Ⅲ型膠原為主的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),超過了機體的降解能力，使ECM在肝內(nèi)過量沉積導致纖維化形成[3-4]。課題組前期研究已表明，ICOSL/ICOS信號介導的Th2極化與感染日本血吸蟲導致的肝纖維化有關[5-6]。在此基礎上，本實驗通過觀察ICOS-Tg小鼠原代HSCs活化及其對肝纖維化形成的影響，進一步探討ICOSL/ICOS信號在血吸蟲病肝纖維化中的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 由揚州大學比較醫(yī)學中心提供遺產(chǎn)背景品系為FVB/NJ的ICOS-Tg小鼠，所有實驗小鼠均置于蘇州大學實驗動物中心SPF實驗動物大樓中飼養(yǎng)，采用自動溫度控制(22±1)℃，自動光控(12 h明/12 h暗)，自由進食及飲用潔凈水。日本血吸蟲尾蚴陽性釘螺購自江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1.1.2試劑 Collagenase Type Ⅰ(Gibco)、Pronase E(Roche)、DNase Ⅰ(Sigma)、Optiprep細胞分離液(Axis-shield)、RPMI-1640培養(yǎng)基和低糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)、胎牛血清(Gibco)、Triton X-100(Amresco)、Hepes和EGTA(Solarbio)、GFAP抗體和SABC-CY3(武漢博士德)、Trizol(Invitrogen)、DEPC水(上海生工生物)、PrimeScriptTMRT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)、TGF-β1，Ⅰ、Ⅲ型膠原、α-SMA mRNA和內(nèi)參基因β-actin mRNA(華大基因)等。

1.1.3主要儀器 津騰容劑過濾器和津騰隔膜真空泵GM-0.33A(天津津騰實驗設備有限公司)；BT-100型蠕動(恒流)泵YZ9901(上海青浦滬西儀器廠)；恒溫混勻儀TZL-200(蘇州帕西瓦爾實驗設備有限公司)；Olympus CX31顯微鏡(日本Olympus)；Olympus C-7070照相機(日本Olympus)；Eppendorf PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)；Step One Plus Real-Time PCR Systerm (美國ABI)；活細胞工作站(德國Leica)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus)；Nanodrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo)。

1.1.4主要試劑 灌注液Ⅰ：氯化鈉8.0 g，氯化鉀0.402 g，二水磷酸二氫鈉0.093 6 g，十二水磷酸氫二鈉0.286 5 g，HEPES 2.383 g， EGTA 0.190 g，碳酸氫鈉0.352 8 g，葡萄糖0.901 g，pH7.2～7.4。灌注液Ⅱ：0.04% CollagenaseⅠ，加 RPMI-1640至100 mL，pH7.2～7.4。振蕩消化液： 0.08% CollagenaseⅠ，0.08% Pronase E， 5U/mL DNaseⅠ，加RPMI-1640至100 mL，pH7.2～7.4。所有溶液均需0.22 μm過濾除菌，并且在37℃培養(yǎng)箱中預熱后使用。

1.2方法

1.2.1實驗動物模型的建立 將釘螺置于潔凈的去氯水中，25 ℃，光照下逸出日本血吸蟲尾蚴，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚感染15±1條尾蚴，實驗小鼠均在SPF級動物房飼養(yǎng)。

1.2.2HSCs的分離 腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，待小鼠麻醉后，將其浸泡于75%酒精15 s，將其固定于解剖臺上，打開腹腔，暴露肝門靜脈，從門靜脈插管，灌注灌注液Ⅰ，同時剪短下腔靜脈，待肝臟變成土黃色后，更換灌注液Ⅱ進行灌注5～7 min，將肝臟游離至事先加入5 mL RPMI-1640培養(yǎng)基的平皿中；繼續(xù)灌注，直至肝臟呈糜爛狀后停止灌注，撕除肝包膜，盡量撕碎肝組織，去除結締組織，將肝組織倒入裝有20 mL振蕩消化液的50 mL離心管中，37 ℃振蕩消化20～30 min；終止消化，200目尼龍篩網(wǎng)過濾，收集細胞懸液，400 r/min×6 min，取上清；2 000 r/min×6 min，棄上清，5 mL RPMI-1640洗滌兩次，之后加入1.5 mL RPMI-1640重新懸浮細胞，待用；于50 mL離心管中分別緩慢加入4 mL 16%梯度分離液、4mL 12%梯度分離液，最后小心加入上述細胞懸液；離心，4 000 r/min×20 min；吸取目的層細胞，加入RPMI-1640離心洗滌2次后重懸計數(shù)。

1.2.3HSCs的培養(yǎng) RPMI-1640重懸細胞后，然后以1×106個細胞接種于25 cm2透氣培養(yǎng)瓶中，含15%低糖DMEM完全培養(yǎng)基，37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后第1次換液，以后每48 h換培養(yǎng)液1次。

1.2.4分離細胞的鑒定

1.2.4.1臺盼藍計數(shù) 將適量洗滌好的細胞懸液用臺盼藍染色后，置于顯微鏡下觀察計數(shù)，計算細胞的成活率。

1.2.4.2小鼠原代HSCs自發(fā)熒光檢測 將分離出的新鮮小鼠HSCs置于培養(yǎng)皿中，應用倒置熒光顯微鏡相差模式觀察其細胞形態(tài)，并在波長為328nm的紫外激發(fā)光下觀察細胞藍綠色自發(fā)熒光。

1.2.4.3神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞化學實驗 將培養(yǎng)5 d的HSCs用兔抗小鼠GFAP(Glial fibrillary acidic protein )一抗、生物素化羊抗兔IgG二抗和SABC-Cy3進行免疫熒光染色，檢測GFAP表達，計算細胞的純度。

1.2.4.4原代HSCs總RNA抽提及cDNA的合成 將小鼠不同病期原代HSCs以1×106個/mL的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，15%低糖DMEM完全培養(yǎng)基，37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后收集細胞。細胞總RNA的抽提：參照MIQE法則確保實時熒光定量PCR檢測結果的準確[7]。將原代培養(yǎng)7 d HSCs培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基倒凈，用預冷的PBS 5 mL洗滌3 min，2次，加入1 mL預冷的TRIzol試劑，室溫靜置10 min，充分吹打至無明顯細胞團塊，使細胞充分裂解；將細胞裂解液轉(zhuǎn)入滅菌的無Rnase的帶蓋1.5 mL Ep管中，室溫靜置15 min；加入200 μL的氯仿，劇烈振蕩30 s后，室溫靜置5～10 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，使Ep管中液體分為3層，上層為含RNA水相，中間為DNA，下層為含蛋白質(zhì)的有機相，轉(zhuǎn)移上層水相至另一個新的滅菌無Rnase的帶蓋1.5 mL Ep管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒充分混勻，室溫靜置10 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min。棄上清，沉淀中加入1mL -20 ℃預冷的75%酒精(DEPC水配制)洗滌除鹽，振蕩30 s，4℃、7 000 r/min離心5 min，2次。小心棄上清，再離心數(shù)秒，用滅菌無Rnase的槍頭吸去多余液體，空氣干燥10 min，用20 μL DEPC水溶解RNA沉淀。所有RNA樣品在Nanodrop 2000超微量分光光度計下測定其OD260/OD280的比值，范圍在1.8～2.0，以保證待測RNA濃度、純度及完整性。

每組取RNA 1μL進行逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA，按PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒說明書操作步驟進行，制備足夠的cDNA用作熒光定量PCR的模板。反應體系20：5×PrimeScript Buffer(for Real Time) 4 μL；PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ1 μL；Oligo dT Primer(50 μm) 1μL；Random 6 mers(100 μm) 1 μL；RNA模板2 μL；RNase Free dH2O 11 μL；總體積20 μL。反轉(zhuǎn)錄后cDNA在Nanodrop 2000超微量分光光度計下測定其OD260/OD280的比值，然后每個樣本濃度稀釋成300 ng/μL作為定量模板，-80 ℃儲存。

1.2.4.5實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR, qRT-PCR) qRT-PCR法采用SYBR染料在ABI Step One Plus Real-Time PCR Systerm上進行。PCR反應體系20 μL；體系內(nèi)含cDNA模板2 μL，SYBR Premis Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL,上、下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL,dH2O 6.8 μL, 95 ℃，10 min;40個循環(huán)(95 ℃，15 s；60℃，1 min)。為了建立PCR產(chǎn)物的溶解曲線，擴增反應結束后，95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s 。每個樣本重復測定3次。實驗所用的引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR檢測基因和內(nèi)參基因的引物

1.2.6標準曲線制作 將任意一感染周期原代HSCs的cDNA，進行5倍梯度稀釋，設定cDNA濃度300 ng/μL時為1，分別稀釋為1×5-1，1×5-2，1×5-3，1×5-4，1×5-5，1×5-6這幾個梯度濃度的cDNA樣本，每個濃度梯度設置三個復孔，qRT-PCR測定各基因的Ct值，繪制得到標準曲線。各基因的標準曲線方程見表2。

表2 基因標準曲線方程

2 結 果

2.1ICOS-Tg小鼠HSCs分離、鑒定及培養(yǎng)

2.1.1ICOS-Tg小鼠HSCs分離與鑒定 見1-A，為活細胞工作站下觀察HSCs形態(tài)(×400)。根據(jù)HSCs具有自發(fā)熒光的特性，倒置熒光顯微鏡在波長為328 nm的紫外激發(fā)光下觀察HSCs并拍照(圖1-B)，臺盼藍拒染法鑒定HSCs成活率在95%以上。小鼠原代HSCs培養(yǎng)至第5 d，進行HSCs特異性表達蛋白GFAP免疫熒光細胞化學染色，結果表明：HSCs細胞漿中呈現(xiàn)紅色熒光(圖1-D)，鑒定其分離純度為90%以上(顯微鏡下隨機取10個視野，計算所有GFAP陽性的細胞占所有細胞的比例，然后取平均值)。

2.1.2ICOS-Tg小鼠HSCs培養(yǎng) 如圖2，為倒置顯微鏡下分別于培養(yǎng)1 d、3 d、7 d后觀察新鮮分離的HSCs形態(tài)(光鏡×400)。剛分離的HSCs呈圓形，1 d后大多數(shù)細胞貼壁，呈圓形或橢圓形(圖2-A)；3 d后細胞體積增大，細胞開始伸展伸出偽足呈星形，并且細胞開始增殖(圖2-B)；7 d后細胞繼續(xù)伸展并增殖，絕大部分細胞呈星形，并且達到50%聚集(圖2-C)。

2.2ICOS-Tg小鼠感染日本血吸蟲不同病期與HSCs活化相關基因α-SMA的表達 感染日本血吸蟲后，小鼠原代HSCs中α-SMA基因的表達水平自感染后4 w開始上升(0.706±0.012，gene/β-actin)，感染后6 w(0.954±0.010，gene/β-actin)、9 w(1.078±0.009，gene/β-actin)仍處于逐漸升高趨勢。ICOS-Tg小鼠HSCs中α-SMA基因的表達水平在感染后6 w(0.954±0.010vs0.843±0.011, gene/β-actin,▼P<0.01)、9 w(1.078±0.009vs0.947±0.011, gene/β-actin,▼P<0.01)顯著高于同時期野生型小鼠HSCs中的水平, 見圖3。

圖1肝星狀細胞(HSCs)的純度和活率鑒定

Fig.1Identificationoffreshlyisolatedhepaticstellatecells(HSCs)

A: Virtually all cells examined under light microscopy;

B: Immediately after cell isolation, exhibited characteristic autofluorescence under ultraviolet excitation at 328-nm wavelength;

C: Merge A and B;

D: Immunocytochemical staining demonstrates expression of GFAP, which was a specific marker of HSC not expressed in other liver cell types

Original magnification×400

圖2培養(yǎng)的原代肝星狀細胞(HSCs)于倒置顯微鏡下觀察(×400)

Fig.2PrimaryHSCsculturedonplasticfor1day(A),3days(B)or7days(C)

At each time point, cells were examined under phase contrast photomicrograph (Original magnification, ×400).

圖3ICOS-Tg小鼠感染不同病期HSCs中α-SMA基因的表達水平

(注：ICOS-Tg vs FVB/NJ,▼P<0.01。)

Fig.3Expressionofα-SMAgeneonHSCsofICOS-Tgmiceindifferentinfectionstages

ICOS-Tg vs FVB/NJ,▼P<0.01.

2.3ICOS-Tg小鼠感染日本血吸蟲不同病期HSCs中與肝纖維化相關基因的表達

2.3.1ICOS-Tg小鼠感染不同病期HSCs中TGF-β1基因的表達 日本血吸蟲感染后，隨著病程的遷移，小鼠原代HSCs中TGF-β1基因的表達自感染后4 w、6 w、9 w呈逐漸升高趨勢(0.760±0.067～1.138±0.101，gene/β-actin)。ICOS-Tg小鼠原代HSCs中TGF-β1基因表達水平(0.724±0.009～1.138±0.101vs0.709±0.019～0.919±0.019, gene/β-actin)均高于同時期野生型小鼠的水平，且在感染后6 w(0.940±0.011vs0.795±0.008, gene/β-actin,▼P<0.01)、9 w(1.138±0.101vs0.919±0.019, gene/β-actin,●P<0.05)顯著升高，見圖4。

圖4ICOS-Tg小鼠感染不同病期HSCs中TGF-β1基因的表達水平

(注：ICOS-Tg vs FVB/NJ,●P<0.05，▼P<0.01。)

Fig.4ExpressionofTGF-β1geneonHSCsofICOS-Tgmiceindifferentinfectionstages

ICOS-Tg vs FVB/NJ,●P<0.05,▼P<0.01.

2.3.2ICOS-Tg小鼠感染不同病期HSCs中Collagen-Ⅰ基因的表達 日本血吸蟲感染后，隨著病程的遷移，小鼠原代HSCs中Collagen-Ⅰ基因的表達自感染后4 w、6 w、9 w呈逐漸升高趨勢(0.621±0.106～1.093±0.027，gene/β-actin)。ICOS-Tg小鼠原代HSCs中Collagen-Ⅰ基因表達水平(0.593±0.005～1.093±0.027 vs 0.551±0.007～0.832±0.013, gene/β-actin)均高于同時期野生型小鼠的水平，且在感染后6 w(0.931±0.018vs0.731±0.003, gene/β-actin,▼P<0.01)、9 w(1.093±0.027vs0.832±0.013, gene/β-actin,▼P<0.01)顯著升高, 見圖5。

2.3.3ICOS-Tg小鼠感染不同病期HSCs中Collagen-Ⅲ基因的表達 日本血吸蟲感染后，隨著病程的遷移，小鼠原代HSCs中Collagen-Ⅲ基因的表達自感染后4 w、6 w、9 w呈逐漸升高趨勢(0.312±0.004～0.576±0.002，gene/β-actin)。ICOS-Tg小鼠原代HSCs中Collagen-Ⅲ基因表達水平自感染后6 w(0.444±0.008vs0.347±0.003, gene/β-actin,▼P<0.01)、9 w(0.576±0.002vs0.446±0.013, gene/β-actin,▼P<0.01)顯著高于同時期野生型小鼠的水平, 見圖6。

3 討 論

血吸蟲導致的主要免疫病理病變是肝臟蟲卵肉ICOS-Tg vs FVB/NJ,▼P<0.01.

芽腫和肝纖維化[3,8]。急性期患者伴有發(fā)熱，腹瀉，血液中嗜酸性粒細胞增多等癥狀；慢性期患者以肝、脾腫大為主；晚期則以肝纖維化為主，可發(fā)展成為門靜脈高壓癥，巨脾和肝硬化。血吸蟲感染宿主后，所引發(fā)的免疫應答反應既有Th1型應答又有Th2型應答，但在感染的不同階段會引起宿主Th1/Th2亞群的免疫偏移，即由Th1型應答向Th2型應答轉(zhuǎn)變[9]。在血吸蟲感染早期，此時宿主體內(nèi)的免疫應答以Th1型應答為主，Th1型應答有利于殺傷侵入宿主體內(nèi)的血吸蟲童蟲，并對組織內(nèi)蟲卵肉芽腫的形成和發(fā)展具有抑制作用；而在血吸蟲產(chǎn)卵后，蟲卵抗原引起Th1型細胞凋亡，因此，Th2型免疫應答逐漸占據(jù)了優(yōu)勢，宿主的免疫應答逐漸由Th1型向Th2型極化偏移[10]。已有研究表明在血吸蟲感染小鼠慢性病變過程中共刺激分子ICOS高表達與宿主Th2極化密切相關[11-12,5]。目前研究認為，HSCs不僅是肝臟炎癥反應的靶細胞，同時也是關鍵的效應細胞，并且HSCs在肝臟的免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制中起到重要作用，HSCs可由特異性的T淋巴細胞亞群激活，同時HSCs還表現(xiàn)出抗原遞呈細胞刺激淋巴細胞增生與激活T細胞反應[13]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)促進HSCs活化增殖并促進其分泌HA[14]。提示Th亞群的極化可介導HSCs活化效應，影響纖維化的形成。

圖5ICOS-Tg小鼠感染不同病期HSCs中Collagen-Ⅰ基因的表達水平

(注：ICOS-Tg vs FVB/NJ,▼P<0.01。)

Fig.5Expressionofcollagen-ⅠgeneonHSCsofICOS-Tgmiceindifferentinfectionstages

ICOS-Tg vs FVB/NJ,▼P<0.01.

圖6ICOS-Tg小鼠感染不同病期HSCs中Collagen-Ⅲ基因的表達水平

(注：ICOS-Tg vs FVB/NJ,▼P<0.01。)

Fig.6Expressionofcollagen-ⅢgeneonHSCsofICOS-Tgmiceindifferentinfectionstages

本研究結果發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲感染小鼠HSCs中α-SMA基因表達水平自感染后4 w開始上升，感染后6 w、9 w仍處于上升趨勢且表達維持在較高水平。 有研究表明，運用基因芯片技術檢測日本血吸蟲感染小鼠HSCs的活化標記α-SMA在感染后3 w時就顯著升高，且持續(xù)高表達，說明HSCs在蟲卵沉積前即已開始活化[15]。類似研究證明，肝HSCs中α-SMA在感染后4周即表達開始上調(diào)[16]。HSCs的活化、增殖是肝纖維化的關鍵環(huán)節(jié)。α-SMA為HSCs活化的特征性標志其表達水平可一定程度反映HSCs的活化程度。本研究結果顯示，ICOS-Tg小鼠原代肝HSCs中與其活化相關的α-SMA基因的表達水平在感染后6w、9w顯著高于同時期野生型小鼠原代HSCs中水平(P<0.01)，提示上調(diào)共刺激信號ICOSL/ICOS促進肝HSCs的活化。

轉(zhuǎn)化生長因子β在脊椎動物體內(nèi)存在3種亞型：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。其中TGF-β1是最強的致纖維化因子，在纖維化的起始和持續(xù)發(fā)展階段均發(fā)揮關鍵作用[17]。體內(nèi)和體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1對肝纖維化發(fā)展的中心環(huán)節(jié)—肝星狀細胞(HSCs)的活化起著關鍵的調(diào)節(jié)作用[18]。在HSCs活化過程中，TGF-β1觸發(fā)多個信號通路，包括：Smad通路[18]，ERK1/2通路[19]和p38 MAPK通路[20]，也有研究表明，TGF-β1通過β-catenin途徑下調(diào)PPAR-γ的表達，從而增加膠原和TIMPS的表達，最終促進肝纖維化發(fā)生[21]。本研究運用qRT-PCR法檢測感染日本血吸蟲小鼠原代肝HSCs中Th2型細胞因子TGF-β1表達水平表明，隨著病程的遷移，ICOS-Tg小鼠原代HSCs中TGF-β1表達水平在感染后6 w、9 w顯著高于同時期野生型小鼠原代HSCs中水平(P<0.01～0.05)，同時，檢測ICOS-Tg小鼠原代HSCs中Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ基因表達水平在感染后6 w、9 w也顯著高于同時期野生型小鼠原代HSCs的水平(P<0.01)。提示上調(diào)ICOSL/ICOS信號可增強HSCs中TGF-β1基因的表達，促進HSCs的活化及纖維化相關因子的上調(diào)表達，導致纖維化形成。

本研究應用ICOS-Tg小鼠血吸蟲病模型，初步證明，ICOSL/ICOS信號可上調(diào)HSCs活化效應介導肝纖維化的形成，為深入闡明日本血吸蟲感染宿主纖維化形成的機制，尋找下調(diào)或抑制血吸蟲病肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的有效途徑提供科學依據(jù)。

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