3種方法對發(fā)熱伴血小板減少綜合征檢測結(jié)果比較

劉 蕓，孫婷婷，張 潔，王子江，姚文清，趙 卓

2010年5月，中國疾病預(yù)防控制中心在湖北、河南兩省的部分地區(qū)啟動了發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例的監(jiān)測工作，發(fā)現(xiàn)了一種屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬的新型病毒。目前，該病毒被命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus, SFTSV)簡稱新布尼亞病毒，該病毒是引起發(fā)熱伴血小板減少病例的致病因子[1-2]。

遼寧省自2009年從VERO-E6細胞中分離出陽性病毒株[3]，經(jīng)過國家疾控中心確定為SFTSV后，經(jīng)過5年的努力，實驗室對該新發(fā)傳染病的病原微生物的檢測方法日臻成熟，已建立了完整的檢測手段。下面就將2013.1-2013.12收集到的180份疑似發(fā)熱伴血小板減少病例樣本采用實時熒光PCR(Real time-PCR)法、酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法及VERO-E6細胞分離培養(yǎng)病毒的方法進行檢測比較。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本來源 樣本來自2013年遼寧省發(fā)熱伴血小板減少綜合征專項監(jiān)測系統(tǒng)收集的符合病例要求的180份病例。每個樣本均有臨床診治結(jié)果和流行病學(xué)調(diào)查資料，同時采集患者急性期血液3 mL×3管。一管分離血清，-20 ℃保存留作抗體檢測使用；余下兩管均-70 ℃保存其中一管留作核酸檢測及細胞分離病毒使用，另一管保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試驗試劑與儀器 RNA提取試劑盒 EZ1 virus Mini Kit v2.0 購置德國QIAGEN公司，Cat.No.955134。新布尼亞病毒RNA檢測試劑盒來自中山大學(xué)達安基因股份有限公司，Cat.#DN-BN196。ELISA抗體檢測試劑盒來自萬泰生物藥業(yè)，生產(chǎn)批號為：20120601-1。細胞培養(yǎng)所用試劑均由GIBCO公司提供，VERO-E6第25代細胞由中國疾病預(yù)防控制中心病毒所提供。熒光定量PCR儀(MJ)由美國生產(chǎn)；酶標(biāo)儀，型號SUNRISE由澳大利亞生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1實時熒光PCR法對發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例的檢測[4-5]取SFTSV感染的患者急性期血液200 μL，用RNA提取試劑盒參照試劑盒說明書提取RNA。將提取的RNA取5 μL作為模板，用新布尼亞病毒RNA檢測試劑盒采用FAM通道，按下列條件進行PCR擴增：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min;95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，35個循環(huán)。檢測結(jié)果：Ct值≤35.00為陽性；無Ct值為陰性，Ct值在35～40之間為可疑陽性:需要從新檢測或增加另外兩種方法協(xié)助檢測。

1.2.2采用ELISA法對SFTSV感染者的血清進行抗體檢測[6]取待檢血清10 μL按操作說明書要求進行。設(shè)陰性和陽性對照及空白對照。臨界值(CUTOFF)計算：臨界值=0.10 +陰性對照孔A均值。當(dāng)陰性對照孔低于0.02時按0.02計算。樣品A值≥臨界值者為新布尼亞病毒抗體(IgM或IgG)陽性，<臨界值者為陰性。

1.2. 采用細胞培養(yǎng)的方法將180例疑似SFTSV感染者的血液提取RNA做核酸檢測，篩選Ct值≤35.00的樣本77例全部感染VERO-E6細胞，盲傳3代。SFTSV可致VERO-E6細胞產(chǎn)生病變(CPE)時間為9～12 d[7]。將CPE陽性的培養(yǎng)液取出200 μL做SFTSV核酸檢測。

2 結(jié) 果

2.13種方法檢測結(jié)果比較 180例樣本采用實時熒光PCR法檢測，陽性77例，陽性率42.78%(77/180)；將77例感染SFTSV的樣本應(yīng)用ELISA法檢測，能產(chǎn)生抗體陽性的占34例，陽性率44.16%(34/77)；77例核酸陽性的樣本經(jīng)細胞培養(yǎng)后獲得CPE陽性分離株32株，陽性率41.56%(32/77)。

2.2不同方法檢出率同發(fā)病時間、取樣時間的關(guān)系 3種方法檢測77例新布尼亞病毒感染者的血液樣本，發(fā)現(xiàn)陽性檢出率與發(fā)病時間及采血時間有密切的聯(lián)系，見表1。

因樣本例數(shù)少，只能采用Fisher確切概率法對男、女感染SFTSV的幾率進行統(tǒng)計，結(jié)果如下：雙側(cè)P值是1.000，單側(cè)P值是0.667，無統(tǒng)計學(xué)差異。

3 討 論

發(fā)熱伴血小板減少綜合征(SFTS)是一種新發(fā)傳染病[8-9]，檢測方法很多，但我們省級實驗室最常使用的檢測方法有3種，即實時熒光PCR法、ELISA法及細胞培養(yǎng)的方法。通過對我省2013年1-12月收集的180例臨床疑似發(fā)熱伴出血、伴血小板減少的病例樣本檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)以下幾個方面的問題現(xiàn)闡述如下：

表1 3種方法檢測不同月份感染病例陽性結(jié)果比對

表2 不同的采血時間對檢測方法的影響

表3 77份SFTSV陽性檢測結(jié)果的人群分布

我省SFTSV流行特點：年齡為40～60歲青壯年為主，男女不限。從首發(fā)病例2013年5月17日起至最后一例為10月24日可見，春、冬兩季無病例，夏、秋季節(jié)為流行高峰。該季節(jié)空氣濕潤草木茂盛，節(jié)肢動物(如：蜱)[10]繁殖密度大，人和動物被感染的幾率較高。寒冷季節(jié)蜱蟲等節(jié)肢動物處于冬眠狀態(tài)或隨宿主轉(zhuǎn)入洞穴生存，對人和家畜感染的機會小。其二，9-10月份樣本SFTSV核酸檢測陽性32例，感染細胞后陽性分離率為15.63%(5/32)較7-8月份核酸檢測陽性36例，感染細胞后陽性分離率為55.56%(20/36)降低了許多，樣本保存不當(dāng)或試驗操作誤差等因素除外，自2010起至2013年止對此現(xiàn)象我們一直在觀注。分析原因可能是伴隨SFTSV感染的同時，還有一種致病因子協(xié)同存在，基因型與之相似或者還有一種新的SFTSV血清型存在，該病原微生物可能存在于我們已經(jīng)了解的蜱蟲之外的其它節(jié)肢動物，同時對VERO-E6細胞不敏感；或者SFTSV對感染VERO-E6細胞而言有兩種情況，一種是嗜VERO-E6細胞型，令一種是對VERO-E6細胞不敏感型這一結(jié)果有待于我們今后工作中進一步證實。

3種檢測方法各有優(yōu)缺點，細胞培養(yǎng)的方法雖然是金標(biāo)準，但費時、費力適用于科研及疫苗研制，不適用于臨床診斷。ELISA試驗是檢測患者被SFTSV感染后機體產(chǎn)生抗體水平的。從我們檢測的結(jié)果來看，IgM抗體最早產(chǎn)生的時間是病后1 d；最晚1例是病后第28 d采血時，IgM仍陰性，核酸檢測陽性(Ct=30.10)，細胞培養(yǎng)陰性。在發(fā)病第15天時采血還能分離出病毒者僅1例。3種方法同時檢測結(jié)果均為陽性時的最佳采血時間是病后4～7 d。根據(jù)這一結(jié)果推斷SFTSV感染機體后，病毒血癥期維持時間較長可能與個體免疫水平有關(guān)。采用ELISA方法作為該病毒早期感染的確證試驗不合適，容易造成假陰性；而實時熒光PCR法靈敏度高，操作簡單快速，結(jié)果觀察直觀應(yīng)該成為臨床診斷和病毒株分離前篩選樣本的首選方法。病毒株的陽性分離率與樣本的采集時間、保存狀態(tài)、敏感細胞的選擇等因素有關(guān)，與感染者的年齡、性別因素?zé)o關(guān)。

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