細胞焦亡在急性肺損傷小鼠肺巨噬細胞中的調控機制研究

牛毓茜 李桂云 楊麗秋 張嶸耀 代 穎 （貴陽市第二人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，貴陽550081）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是臨床常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一，多見于ICU患者，且發(fā)病原因以膿毒血癥為主［1］。ALI病情發(fā)展較快，其主要臨床表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征。體外膜肺氧合和機械通氣是治療ALI 較常見的方法，但由于ALI 發(fā)病率和死亡率較高，且缺少良好的治療藥物，其治療效果仍然不夠理想。因此，探究ALI的發(fā)病機制，尋找可用的生物標志物和治療靶點，對提高ALI 的治療效果和預后具有重要意義。細胞焦亡作為一種促炎的細胞程序性死亡方式，與凋亡或壞死不同的是，細胞焦亡介導的細胞死亡必須要caspase-1 或caspase-11 通過剪切 GSDMD 蛋白來發(fā)揮作用［2-3］。其可誘導炎癥細胞腫脹、裂解，胞內促炎物質會大量釋放，使機體迅速產(chǎn)生強勁的炎癥反應。近年研究發(fā)現(xiàn)，阻滯促炎因子和TLR4對膿毒癥患者ALI的預后并無明顯改善作用。提示除促炎因子和TLR4外，可能還有其他介質影響ALI 的發(fā)生發(fā)展［4］。最新研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠細胞焦亡相關caspase-1 和NLRP-3基因可減少LPS介導的膿毒癥小鼠肺損傷，表明細胞焦亡在膿毒癥ALI 發(fā)病中具有重要作用［5］。但細胞焦亡在ALI 中作用的具體機制尚缺少文獻報道。為進一步考察細胞焦亡在ALI中的作用機制，本研究擬采用與細胞焦亡關系密切的NF-κB信號通路，考察其對ALI 小鼠肺巨噬細胞焦亡的影響；同時對NF-κB、p65、NLRP3和caspase-1等NF-κB通路相關信號分子水平進行檢測，以期獲得引起ALI的部分可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取24 只健康C57BL/6J 雄性小鼠，4~6周齡，體重18~22 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2018-0003，適應性飼養(yǎng)1 周，期間給予自由飲水和飲食，光照白天和黑夜各12 h。

1.1.2 主要試劑 脂多糖（生產(chǎn)批號：M3148-25ML，美國Sigma 公司）；IL-6、IL-1β、TNF-α 和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）ELISA 試劑盒（產(chǎn)品貨號分別為：E-EL-R0355c、E-EL-R0047c、E-EL-R0054c、E-EL-R0013c，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；抗NF-κB（單克隆兔抗）、抗p65（單克隆鼠抗）、抗NLRP3（單克隆兔抗）、抗caspase-1 抗體（單克隆兔抗）（產(chǎn)品貨號分別為：43966S、14472S、8480S、13667S，Cell Signaling Technology）；DAPI 染色試劑盒（產(chǎn)品貨號：BB-4133-100T，南京立喬生物科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器 SSW-3型顯微外科手術器械包，上海手術器械廠；纖維素濾膜（0.22μm）、混合纖維素濾膜（0.45 μm），德國 BM；-80℃超低溫冰箱，青島海爾集團；4℃、-20℃冰箱，合肥美菱股份有限公司；H1650-W 離心機，湖南湘儀實驗室儀器有限公司；TGL-20M 高速臺式冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器有限公司；CKX41倒置顯微鏡、IX-71熒光倒置顯微鏡，日本Olympus 光學工業(yè)株式會社；Infinite M1000 Pro 全波長酶標儀，TECAN 公司；TANK?PE060高純水機，美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型建立［6］24 只小鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，稱取體重，根據(jù)體重分層隨機分為正常對照組、模型組和干預組，8 只/組。模型組小鼠腹腔注射LPS（劑量：15 mg/1 000 g體重，1 m/l 100 g體重），尾靜脈注射生理鹽水（劑量：1 m/l 100 g 體重）建造ALI 模型，干預組在模型組的基礎上尾靜脈注射 NF-κB 抑制劑PDTC（劑量：100 mg/1 000 g 體重，1 m/l 100 g 體重），對照組僅腹腔注射和尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.2.2 取材 依照實驗設計方案，稱重，造模24 h后，采用7%水合氯醛麻醉小鼠，眼眥取血處死小鼠，血液靜置 30 min 后，4℃ 1 500/r min 離心 5 min，取上清液保存?zhèn)溆??？焖匍_腹，分離結扎左肺，右肺穿刺盥洗，收集支氣管肺泡盥洗液（BALF，約4 ml），切取左肺上葉保存于-70℃液氮備用，剩余肺組織保存于4%多聚甲醛溶液，備用。

1.2.3 巨噬細胞分離 將收集的BALF以1 000/r min離心5 min，棄上清，用含10%胎牛血清的RP?MI1640 培養(yǎng)液洗滌沉淀的細胞2 次，重懸后，得到細胞懸液，調整細胞濃度為2×105個/ml 后，接種于12孔板，1 m/l 孔，37℃、5%CO2孵育1.5 h，待細胞貼壁后，PBS 洗去未貼壁的細胞，即獲得肺巨噬細胞（alveolar macrophages，AM）。

1.2.4 HE 染色 ①固定：將取得的肺組織標本置于4%的甲醛溶液中充分浸泡30~50 min；②脫水：分別用70%、80%、90%、95%、100%的乙醇進行梯度脫水；③透明：二甲苯將標本透明2 次，以替換標本組織內乙醇，直至標本透明似琥珀；④浸蠟：將透明標本組織置于融化好的石蠟中，于65℃溶蠟箱中保溫2 h；⑤包埋：待石蠟完全浸入組織中后包埋，待其冷卻凝固為蠟塊后備用；⑥編號：記錄為標本來源小鼠編號；⑦切片：將組織蠟塊切為4μm厚的薄片；⑧貼片：將切片在熱水中燙平，然后貼在玻片上，置于烤箱58℃恒溫保持4 h；⑨染色：在脫蠟和水洗后，蘇木素染色，保持3 min，繼續(xù)水洗之后再藍化，保持10 min，使用1%的鹽酸乙醇分化20 s，最后伊紅染色，保持5 min；⑩封片：梯度乙醇脫水，各自保持3 min，使用二甲苯進行透明，保持5 min，最后使用中性樹脂膠完成封片。

1.2.5 ELISA 法測定血清和 BALF 中 IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1水平 嚴格按照ELISA 試劑盒說明書要求進行操作。

1.2.6 Western blot 定量檢測腸黏膜組織中NF-κB、p65、NLRP3和caspase-1的表達 取小鼠腸黏膜組織，冰上研磨30 min，將混合液小心吸入離心管中，11 000 r/min 4℃離心15 min，棄沉淀，取上清，于110 mV 下SDS-PAGE 分離蛋白質，并轉至硝酸纖維膜；以20∶1的比例在PBST 溶液中加脫脂奶粉，室溫條件下封閉1 h。依照一抗的推薦濃度和用量，加入奶粉對一抗進行稀釋。將硝酸纖維膜置于雜交袋，加入一抗工作液，封口，4℃條件下孵育過夜。加入 HRP 標記好的二抗（抗兔 IgG 抗體，1∶2 000 稀釋）工作液，再封口，37℃孵育1 h。凝膠成像分析儀掃描并分析結果。繪制標準曲線，并計算濃度，結果用相對灰度值表示。

1.2.7 DAPI染色檢測巨噬細胞焦亡 巨噬細胞懸液于固定液中固定，將細胞滴加在載玻片上，干燥。固定完畢后，用免疫染色洗滌液洗滌2 次，5 min/次。加入免疫染色封閉液，封閉1 h。按照1∶1 000比例用免疫染色一抗稀釋液稀釋一抗。用微型臺式真空泵吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫在側擺搖床上緩慢搖動孵育1 h。加入免疫染色洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5 min，共洗滌3 次。 孵育二抗，用免疫染色二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1 h。于熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料數(shù)據(jù)均以表示，多組數(shù)據(jù)的比較采用ANOVA 分析，采用 Bonferroni 校正的t檢驗進行多重比較，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肺濕重/干重（W/D）的影響 如表1所示，與正常組相比，模型組小鼠W/D明顯提高，而干預組小鼠較模型組W/D明顯降低（P<0.05）。

表1 各組小鼠肺濕重/ 干重（W/ D）的影響（）Tab.1 Effect of lung wet/ dry（W/ D）of mice in each group（）

表1 各組小鼠肺濕重/ 干重（W/ D）的影響（）Tab.1 Effect of lung wet/ dry（W/ D）of mice in each group（）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

W/ D 4.12±0.21 7.12±0.341）5.24±0.261）2）Groups Normal Model Treatment n8 8 8 Weight（g）22.76±2.42 22.51±34.28 23.06±20.32

2.2 各組小鼠血清 IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 水平 由表2可知，與正常組相比，模型組小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 和 MCP-1 含量均明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，干預組IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1含量均明顯降低（P<0.05）。

表2 各組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平（，n=8，pg/ ml）Tab.2 Serum IL-6，IL-1β，TNF-α and MCP-1 levels of mice in each group（，n=8，pg/ ml）

表2 各組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平（，n=8，pg/ ml）Tab.2 Serum IL-6，IL-1β，TNF-α and MCP-1 levels of mice in each group（，n=8，pg/ ml）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

MCP-1 326.2±88.6 814.5±147.21）479.3±102.31）2）Groups Normal Model Treatment IL-6 120.2±46.1 678.3±112.31）274.3±75.21）2）IL-1β 62.8±6.3 155.3±52.01）76.8±18.21）2）TNF-α 44.2±10.1 112.3±32.31）56.9±11.81）2）

2.3 各組小鼠 BALF 中 IL-6、IL-1β、TNF-α 和 MCP-1 水平 與正常組相比，模型組小鼠BALF 中IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 含量均明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，干預組IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1含量均明顯降低（P<0.05），詳見表3。

表3 各組小鼠BALF中IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平（，n=8，pg/ ml）Tab.3 IL-6，IL-1β，TNF-α，and MCP-1 levels in BALF of each group of mice（，n=8，pg/ ml）

表3 各組小鼠BALF中IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平（，n=8，pg/ ml）Tab.3 IL-6，IL-1β，TNF-α，and MCP-1 levels in BALF of each group of mice（，n=8，pg/ ml）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

MCP-1 384.2±77.9 908.5±164.71）497.1±99.61）2）Groups Normal Model Treatment IL-6 200.2±35.3 823.5±111.61）326.3±82.41）2）IL-1β 161.2±53.1 560.7±82.31）268.0±52.81）2）TNF-α 53.2±9.8 174.6±36.51）72.5±13.21）2）

2.4 各組小鼠肺組織病理學的影響 HE 染色結果如圖1 所示，正常組小鼠肺泡結構完整且排列整齊，無變性壞死。模型組小鼠肺泡結構被破壞，存在大量炎癥細胞浸潤。干預組小鼠可見肺泡結構改變和炎癥細胞浸潤，但較模型組明顯減輕。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色（×200）Fig.1 HE staining of lung tissue of mice in each group（×200）

2.5 各組小鼠肺巨噬細胞焦亡 DAPI染色結果顯示，正常組PI紅色熒光弱，無明顯細胞焦亡；模型組紅色熒光明顯增強，提示肺巨噬細胞存在明顯焦亡。干預組小鼠肺巨噬細胞紅色熒光較模型組明顯減弱，與正常組差異較小，細胞焦亡現(xiàn)象不明顯。見圖2。

圖2 各組小鼠巨噬細胞染色（×100）Fig.2 Macrophage staining of mice in each group（×100）

2.6 小鼠肺組織中NF-κB、p65、NLRP3和caspase-1蛋白表達 Western blot 結果表明，模型組小鼠肺組織中NF-κB、p65、NLRP3 和 caspase-1 表達較正常組明顯增加，而干預組NF-κB、p65、NLRP3和caspase-1表達量較模型組明顯減少（圖3）。由此可推斷，ALI小鼠可誘導NF-κB 通路激活，使NF-κB、p65、NLRP3和caspase-1蛋白表達增加，促進巨噬細胞焦亡。

圖3 肺組織NF-κB、p65、NLRP3和caspase-1蛋白表達Fig. 3 NF-κB，p65，NLRP3 and caspase-1 protein expressions in lung tissue

3 討論

AM與ALI的發(fā)生關系密切，是調節(jié)肺部微環(huán)境和炎癥反應最重要的細胞。其主要包括肺泡、肺間充質及支氣管巨噬細胞3 種，其中AM 比例最高，占90%以上［7-8］。當肺部遭受外源性致病因素刺激時，肺巨噬細胞會利用模式識別受體（包括Toll樣受體、NR4A1 受體、NOD 樣受體及由 PYHIN 樣蛋白家族、適配器蛋白和caspase-1 三種蛋白組成的經(jīng)典炎性體等）進行識別，開啟機體第一道免疫防御，釋放大量炎癥介質［9-11］。經(jīng)典炎癥體 NLRP3 在各種 ALI 中均演重要角色，NLRP3 被激活時，會促進caspase-1前體活化，活化的caspase-1 可通過剪切促使無活性的白介素蛋白（如proIL-1β、proIL-6 等）變成有活性的IL-1β、IL-6 誘發(fā)炎癥反應［12］。本研究利用LPS 建立ALI 小鼠模型后發(fā)現(xiàn)，ALI 小鼠肺組織中NLRP3表達及血清和 BALF 中 IL-6、IL-1β、TNF-α 和 MCP-1水平均較正常組小鼠明顯升高，提示LPS 可激活NLRP3 炎癥小體，誘導 IL-6、IL-1β、TNF-α 和 MCP-1促炎物質的釋放，使機體迅速產(chǎn)生炎癥反應，導致ALI。

4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phe?nylindole，DAPI）能與雙鏈 DNA 小槽，特別是 AT 堿基結合，使熒光強度增強20 倍，而與單鏈DNA 則無熒光增強現(xiàn)象，是一種簡單、快速且靈敏的DNA 檢測方法，被廣泛用于細胞凋亡或焦亡實驗［13-14］。NL?RP3 一旦被激活還會導致下游細胞（如肺巨噬細胞等）焦亡，焦亡的細胞存在DNA 的片段化，因而可被DAPI 染成陽性［15］。本研究顯示，在 LPS 介導的 ALI小鼠中，DAPI染色可見焦亡的肺巨噬細胞被染成紅色，提示LPS 介導的ALI 中存在明顯的肺巨噬細胞焦亡現(xiàn)象。

目前，已發(fā)現(xiàn)的引起AM 焦亡的通路包括自噬、線粒體 DNA、TNF-α 等。王振霞等［16］研究發(fā)現(xiàn)，利用雷帕霉素激活膿毒癥小鼠自噬，可顯著降低巨噬細胞焦亡和小鼠死亡率。趙寧等［17］在LPS刺激的大鼠AM 細胞中加入線粒體DNA 后發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA可明顯放大AM 誘導的炎癥反應，促進AM 細胞焦亡。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)NF-κB 在細胞凋亡和炎癥反應中也具有重要作用。NICOLAY 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB 信號通路激活會誘導T 淋巴細胞凋亡，抑制NF-κB 的激活對治療T 淋巴細胞瘤具有重要價值。XIA 等［19］研究也表明，NF-κB 途徑可誘導細胞凋亡，并抑制RA-HFLS 的增殖和血管生成，可能是 RA 治療的新靶點。CHOI 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，敵草快導致的神經(jīng)退行性疾病可能與其通過NF-κB介導的p53 信號傳導的炎癥反應誘導細胞損傷有關。但NF-κB 在AM 焦亡的機制研究尚缺少報道。本研究結果表明，ALI 小鼠肺組織中 NF-κB、p65、NLRP3 和caspase-1 表達水平較正常組明顯升高，而NF-κB 抑制劑干預組小鼠 NF-κB、p65、NLRP3 和caspase-1 均較模型組明顯降低，提示ALI 的發(fā)生機制可能與激活NF-κB 信號通路，促進巨噬細胞焦亡有關。

綜上所述，LPS 介導的ALI 與肺巨噬細胞焦亡密切相關，其通過激活NF-κB 信號通路增加AM 細胞中NLRP3的表達，誘導細胞焦亡的發(fā)生，抑制NF-κB 信號通路的激活，降低AM 細胞焦亡，從而改善LPS 介導的ALI。但由于樣本量有限，實驗方法單一，且ALI 發(fā)病復雜，仍需更大的樣本量、更豐富的實驗方法進行驗證。