TWIST1基因通過調節(jié)mTOR信號通路對口腔鱗癌Tca8113細胞增殖凋亡的影響

程 玨 辛鵬飛 程 琳 莊潤濤 劉志榮 （北京交通大學社區(qū)衛(wèi)生服務中心，北京100044）

口腔頜面鱗狀細胞癌（oral cavity squamous cell carcinoma，OSCC），被簡稱口腔鱗癌，多發(fā)生于40~60 歲中老年人群，是一種最為常見的口腔惡性腫瘤，占口腔癌的90%［1-2］。世界范圍內口腔癌發(fā)病率相對較高的地域包括巴西、巴基斯坦和法國等。雖然醫(yī)學技術不斷提高，但統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，頭頸部鱗狀細胞癌患者五年生存率在過去的幾十年里并沒有得到明顯改善［3］。因此，研究口腔癌的治療方法對于口腔鱗癌的臨床治療具有重要意義。

人TWIST相關蛋白（twist-related protein，TWIST）最早發(fā)現(xiàn)于果蠅中，主要包括TWIST1 和TWIST2兩種不同蛋白結構［4］。在不同物種之間，TWIST1 是高度保守的，研究發(fā)現(xiàn)TWIST1 異常表達，與肺癌、胃癌、三陰性乳腺癌、直腸腺癌等發(fā)生有密切關系，有文獻證實TWIST1 可能調節(jié)下游因子的轉錄，或者調節(jié)蛋白的修飾，從而調節(jié)腫瘤細胞的侵襲、增殖和凋亡等生物學過程，但是TWIST1 如何影響口腔頜面鱗狀細胞癌細胞的生物學過程以及具體機制尚不明確。

大量文獻證實，細胞自噬在維持細胞存活、分化和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了關鍵作用，最近研究發(fā)現(xiàn)自噬與多種腫瘤細胞的侵襲、惡性轉化均密切相關［5-6］。參與自噬過程中的兩個重要調控因子分別為Beclin1和LC3。自噬相關基因Beclin1 是自噬啟動的關鍵基因，也是自噬通路的關鍵調節(jié)器［7］。同樣，在自噬過程中還有一個重要的調控因子，即微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3），它也是哺乳動物中了解最為透徹的一種蛋白［8］。文獻證實 Beclin1 和 LC3 的表達異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，若能有效調控自噬反應，則是治療腫瘤的一種新途徑。

雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamy?cin，mTOR）信號通路是研究最多的一種致癌途徑，該信號通路的異常激活與許多癌癥的發(fā)生有關［9］。目前研究顯示，mTOR 信號通路的過度激活與肺癌、膀胱癌、食道癌等的發(fā)生相關，但是關于TWIST1 是否可以通過mTOR 信號通路對口腔鱗癌細胞增殖、凋亡發(fā)揮調控作用的研究少有報道［10-11］。因此，本研究探討TWIST1對口腔鱗癌Tca8113細胞增殖、凋亡的影響以及其可能的調控機制，為口腔鱗癌的發(fā)病和治療提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗購自美國HyClone 公司；CCK-8 試劑購自大連美侖生物技術有限公司；Lipofectamine 3000 轉染試劑、培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶購自美國Thermo 公司；TWIST1 shRNA、陰性對照序列購自漢恒生物科技（上海）有限公司；Edu、TUNEL 染色試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；Beclin1 和LC3 ELISA 試劑盒購自上海邦奕商貿有限公司；SYBR Primer Ex Taq 熒光定量PCR 試劑盒購自美國 TaKaRa 公司；TWIST1、U6 引物購自南京金斯瑞生物科技有限公司；p-mTOR（#2971）、p-P70S6K（#9204）、GAPDH（#5174）和兔抗二抗（#14708）購自美國CST公司。

1.1.2 儀器 超純水系統(tǒng)購自美國Millipore公司；酶標儀購自美國Bio-Tek 公司；CO2培養(yǎng)箱、低溫冰箱購自美國Thermo 公司；熒光定量PCR 儀、電泳儀購自美國Bio-Rad 公司；電子天平購自北京海天友誠科技有限公司；高溫滅菌鍋購自上海吉盛醫(yī)學科技有限公司。

1.1.3 細胞 人口腔鱗癌細胞系（Tca8113）購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，完全培養(yǎng)基為1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 Tca8113 細胞的培養(yǎng)及轉染 Tca8113 細胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基內，2~3 d 后傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。以 1×106個/ml 密度接種于 6 孔板內，利用Lipofectamine 3000 轉染試劑將sh-TWIST1 和陰性對照序列轉染至Tca8113 細胞，以只加入Lipo?fectamine 3000 轉染試劑的Tca8113 細胞作為對照組。

1.2.2 QRT-PCR 法檢測Tca8113 細胞中TWIST1 mRNA 水平 收集3組Tca8113細胞，向含有細胞沉淀的EP 管內加入Trizol，將細胞裂解。根據(jù)第一鏈反轉錄試劑盒說明書，將RNA 反轉錄為cDNA，向管內加入上、下游引物，以 U6 作為內標，用 2?ΔΔCt計算TWIST1 mRNA相對表達水平。

1.2.3 CCK-8 法測定Tca8113 細胞存活率 以5×103個/孔密度接種于 96 板，在 3 組細胞培養(yǎng) 24 h、48 h 后，重復3 孔，每孔加入10 μl CCK-8 試劑，孵育4 h后，在490 nm 波長下檢測細胞的吸光度（A）。細胞活力百分比（%）=（A樣品?A空白）/（A標準品?A空白）×100%。

1.2.4 Edu 法測定Tca8113 細胞增殖能力 使用4%多聚甲醛固定各組細胞，加入0.3%Triton X-100溶液透化15 min，加入100 μl× Click-iT EdU 染色液至每個孔，簡短搖晃培養(yǎng)板以確保反應物可以均勻覆蓋細胞，避光孵育30 min，除去洗滌液，在顯微鏡下觀察綠色熒光細胞數(shù)目。

表1 TWIST1和U6引物序列信息Tab.1 TWIST1 and U6 primer sequence information

1.2.5 TUNEL 染色法檢測Tca8113 細胞凋亡情況 將細胞涂片浸入4%多聚甲醛固定液的染缸中，室溫固定 20 min，用 PBS 清洗 3 次，每次 5 min。每孔內滴加100μl Proteinase K工作液，反應15 min，再滴加 100 μl DNaseⅠ Buffer，處理 30 min，滴加50 μl TdT 反應液，避光孵育60 min，再加入DAPI 染色液復染細胞核，室溫避光10 min。在熒光顯微鏡下檢測細胞凋亡情況。

1.2.6 Western blot法檢測Tca8113細胞中Beclin1、LC3、p-mTOR和p-P70S6K蛋白表達水平 收集3組細胞，加入蛋白裂解液將細胞冰上裂解，收集蛋白上清液。加入5 倍SDS 上樣緩沖液，煮沸10 min。電泳后用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF 膜，5%BSA 液封閉 1.5 h，洗膜，加入 Beclin1、LC3、p-mTOR 和 p-P70S6K一抗，4℃孵育過夜，加入二抗，孵育1 h。向PVDF膜滴加發(fā)光液，分析條帶光密度。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)采用t檢驗，計量資料以表示，并用Prism 6.0 軟件作圖，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TWIST1 在 sh-TWIST1 組表達 下 降 qRT-PCR和Western blot 的結果如圖1A、B 所示，與空白對照組和陰性對照組相比，TWIST1 mRNA 和蛋白在sh-TWIST1 組Tca8113 細胞中的表達水平下降（P<0.05），而空白對照組與陰性對照組無差異。

圖1 TWIST1 mRNA的表達水平Fig.1 Expression of TWIST1 mRNA

2.2 TWIST1 沉默后提高Tca8113 細胞的活力 CCK-8 法檢測了 TWIST1 對 Tca8113 細胞活力的影響，結果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，24 h、48 h 后 sh-TWIST1 組的 Tca8113 細胞活力均明顯升高（P<0.05），且空白對照組與陰性組無差異（圖2）。

圖2 Tca8113細胞活力的比較Fig.2 Comparison of cell viability in Tca8113 cells

2.3 TWIST1 沉默后提高Tca8113 細胞的增殖能力 Edu 染色結果如圖3A 所示，發(fā)現(xiàn)與空白對照組和陰性序列對照組相比，sh-TWIST1組的Tca8113細胞增殖能力明顯提高（P<0.05），且空白對照組與陰性對照組無差異（圖3B）。

圖3 Tca8113細胞增殖能力的比較（×20）Fig.3 Comparison of cell proliferation ability of Tca8113 cells（×20）

2.4 TWIST1 沉默后抑制Tca8113 細胞的凋亡 TUNEL 染色結果如圖4A 所示，與空白對照組和陰性對照組相比，sh-TWIST1組的Tca8113細胞凋亡數(shù)目明顯降低（P<0.05），且空白對照組與陰性對照組無差異（圖4B）。

圖4 TUNEL法檢測細胞凋亡情況（×20）Fig.4 Apoptotic rate was detected by TUNEL staining（×20）

2.5 TWIST1 沉默后 Tca8113 細胞中 Beclin1 和 LC3水平變化情況 Western blot 結果如圖5A、B 所示，與空白對照組和陰性對照組相比，sh-TWIST1 組的Tca8113 細胞中 Beclin1 水平下降（P<0.05），LC3 水平明顯提高（P<0.05），且空白對照組與陰性對照組無差異。

圖5 Beclin1和LC3表達水平Fig.5 Expression levels of Beclin1 and LC3

2.6 TWIST1 沉默后促進Tca8113 細胞中p-mTOR和p-P70S6K 蛋白的表達 Western blot 結果如圖6A所示，與空白對照組和陰性對照組相比，sh-TWIST1組的 Tca8113 細胞中 p-mTOR 和 p-P70S6K 蛋白水平升高（P<0.05），給予 mTOR 信 號通路 激 動劑（MHY1485、MCE、HY-B0795）后，Tca8113 細胞中p-mTOR 和p-P70S6K 蛋白水平升高更為顯著（P<0.05），且空白對照組與陰性對照組無差異（圖6B）。

圖6 p-mTOR和p-P70S6K蛋白表達情況Fig.6 Expressions of p-mTOR and p-P70S6K proteins

3 討論

鱗狀細胞癌多發(fā)生在鱗狀上皮覆蓋的部位，如皮膚、口腔和食管等?？谇击[癌占口腔頜面部惡性腫瘤90%以上，世界衛(wèi)生組織預計在未來十幾年口腔鱗癌的發(fā)病率會持續(xù)上升，已然成為世界公共衛(wèi)生問題［12］。盡管手術方式在臨床上已經(jīng)取得了一定進展，但對于晚期失去手術機會的口腔鱗癌患者來說，目前尚無安全有效的治療藥物［13］。所以，為了提高口腔鱗癌的治療效果，大量研究應該關注新藥的開發(fā)和新機制的發(fā)現(xiàn)，以便于發(fā)現(xiàn)和尋找更有潛在治療價值的方案或者手段。

研究發(fā)現(xiàn)人TWIST1 在口腔鱗癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，它位于7p21.2，隨著對其生物學功能的深入研究，TWIST1 是近些年來備受關注的原癌基因之一［14］。DUAN 等［15］發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)下可以促進口腔鱗癌細胞的侵襲和遷移，其機制可能與調控Bcl-2/TWIST1信號通路有關。另外，KONG 等［16］發(fā)現(xiàn)調節(jié)TWIST1 和ZEB2 復合物對口腔鱗癌細胞的存活具有重要作用。但是TWIST1 對口腔鱗癌細胞增殖、凋亡的調控作用卻尚不明確。所以，本研究首先利用Lipofectamine 3000轉染試劑將sh-TWIST1和陰性對照序列轉染至Tca8113 細胞，然后利用QRTPCR 法檢測 48 h 后 TWIST1 mRNA 的表達情況，結果如圖1 所示，sh-TWIST1 組細胞中TWIST1 mRNA表達水平明顯下降。接下來通過CCK-8和Edu染色法檢測TWIST 基因對口腔鱗癌細胞增殖和活力的影響，發(fā)現(xiàn)與空白對照組和陰性對照組相比，sh-TWIST1 組細胞的活力和增殖能力明顯提高。隨后，利用TUNEL 染色方法檢測了TWIST1 基因對Tca8113 細胞凋亡的影響，結果如圖4 所示，sh-TWIST1 組細胞凋亡數(shù)目明顯下降，說明TWIST1 沉默后，顯著抑制了Tca8113細胞的凋亡。

已有大量文獻表明細胞的自噬反應在增殖、凋亡和分化等生物過程中發(fā)揮了關鍵的調控作用，自噬是一種細胞降解受損細胞器和異常胞內蛋白的生理過程，也是一種高度保守的細胞行為，即細胞質蛋白通過自噬作用被包裹進入囊泡中，與溶酶體形成自噬溶酶體［17］。自噬相關基因對生物體的存在十分重要，自噬相關基因的缺失不僅會導致細胞的快速死亡，研究還發(fā)現(xiàn)自噬功能缺失的小鼠會出現(xiàn)神經(jīng)、肝臟的損傷。其中Beclin1 和LC3 是兩個重要的調控因子，研究顯示Beclin1 位于人染色體17q21 上，可以形成復合體調節(jié)自噬活性；而LC3 與磷脂酰乙醇胺結合形成復合物，且其含量與自噬的發(fā)生呈現(xiàn)正相關［18-19］。本研究利用ELISA 試劑盒檢測了TWIST1 基因對Beclin1 和LC3 表達的影響，結果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)TWIST1沉默后，Tca8113細胞中Beclin1 水平降低，LC3 水平升高，說明此時伴有異常激活的自噬反應發(fā)生。為了探究TWIST1 基因的調控機制，本研究鎖定了mTOR 信號通路。人mTOR 位于1p36.2，編碼蛋白由2 549 個氨基酸組成 ，mTOR 包 括 mTORC1 和 mTORC2 兩 種 蛋 白 。mTOR 可刺激下游靶點核糖體40S小亞基S6蛋白激酶（p-P70S6K），p-P70S6K 含有一個高度保守的氨基端，它本身不具有生物功能活性，但被mTOR磷酸化激活后進而磷酸化S6 蛋白，導致P-P70S6K 蛋白結構發(fā)生變化，促進蛋白質的合成［20］。因此，本研究利用 Western blot 法檢測了 p-mTOR 和 p-P70S6K 蛋白表達水平，結果顯示當TWIST1 沉默后，p-mTOR和p-P70S6K 的表達水平均顯著提高，說明mTOR 信號通路被激活。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)當TWIST1 基因沉默后，可促進口腔鱗癌Tca8113 細胞的存活和增殖，并抑制其凋亡，說明TWIST1基因可能是通過激活mTOR信號通路調節(jié)自噬反應而發(fā)揮作用。今后，本課題組可能通過構建TWIST1 過表達質粒，進一步探究TWIST1對口腔鱗癌細胞增殖凋亡的調控機制。