PI3K 抑制劑聯(lián)合地塞米松改善氧化應(yīng)激細胞模型對激素的敏感性及其分子機制①

曾瑜真 杜開鋒 金建軍 閔智慧 毛若琳 陳智鴻

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，上海200032）

糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GC）是治療哮喘、慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）等慢性氣道炎癥最常用的藥物，尤其在控制輕中度哮喘中效果最佳，然而重癥哮喘、吸煙哮喘患者以及部分COPD 患者對激素治療效果卻不理想［1-2］。盡管重癥哮喘占比較少，但其對GC 敏感性降低，由此導(dǎo)致的病死率較高，據(jù)報道每年因哮喘死亡的人數(shù)高達 25 萬［3-4］。在 COPD 管理中，越來越多的研究提示目前推薦的高劑量ICS 獲益不足［5］。因此，針對慢性氣道炎癥疾病開發(fā)更為有效的治療方案，對于減輕患者和社會經(jīng)濟負擔(dān)尤為重要。

氧化應(yīng)激是哮喘、COPD 等慢性氣道炎癥的主要發(fā)病機制之一，它可使組蛋白去乙?；福╤is?tone deacetylase，HDAC）-2 活力降低、轉(zhuǎn)錄因子過表達和促炎信號通路增加等，這些可能導(dǎo)致激素不敏感［5-6］。氧化應(yīng)激同時激活 PI3Kδ/Akt 信號通路，PI3Kδ 作為潛在的抗炎靶點可引起中性粒細胞活化，與哮喘和COPD對激素不敏感密切相關(guān)［7-8］。IL-8在中性粒細胞趨化過程中起關(guān)鍵作用，是COPD、哮喘等慢性氣道炎癥的促炎標(biāo)志物，同時也可能是預(yù)測疾病嚴重程度的標(biāo)志［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)COPD 患者支氣管上皮IL-8 表達的基線水平較高，可誘導(dǎo)黏蛋白基因表達導(dǎo)致氣道黏液高分泌［11］。重癥哮喘患者誘導(dǎo)痰上清中IL-8 濃度高于輕度哮喘患者，預(yù)示其炎癥控制較差，預(yù)后不佳［3］。

本研究通過H2O2刺激人巨噬細胞系U937 細胞建立H2O2-TNFα-U937 細胞模型，模擬重癥哮喘、吸煙哮喘患者外周血單個核細胞（PBMCs）的氧化應(yīng)激-激素耐受效應(yīng)?；?IL-8 需在 TNF-α、LPS 等誘導(dǎo)劑作用下合成釋放，本研究選取TNF-α 作為炎癥誘導(dǎo)劑，單用PI3K抑制劑或PI3K抑制劑聯(lián)合Dex干預(yù)細胞模型，探討PI3K通路在慢性氣道炎癥中的作用機制，為臨床治療慢性氣道炎癥開辟新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 人巨噬細胞系U937由中科院上海細胞生物學(xué)研究所提供。

1.1.2 主要試劑 Dex、TNF-α、H2O2購自美國Sigma公司；PI3K 抑制劑 BZE235、LY294002 購自 Selleck公司；IL-8 ELISA 試劑盒購自 R&D 公司；NF-κB、Jun、FOS 磷酸化抗體購自 CST 公司；TRIzol 購自Invitrogen 公司；熒光定量PCR 試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 TaKaRa 公司；HDAC2 Assay Kit 購自 Abnova公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與分組方案 ①H2O2-TNFα-U937細胞模型建立：U937 細胞分為未處理組與H2O2（400 μmol/L）刺激組，培養(yǎng) 4 h 后，分別加入0.1 μmol/L Dex 作用 45 min，各孔給予 20 ng/ml TNF-α 培養(yǎng)24 h，取上清，按照說明書采用ELISA 檢測IL-8 的表達。各組設(shè)3 個復(fù)孔。②運用H2O2-TNFα-U937細胞模型篩選小分子抑制劑：U937細胞經(jīng)400 μmol/L H2O2刺激4 h 后，分別與0.1 μmol/L Dex、1 μmol/L BEZ235/LY294002 單獨作用45 min，各孔給予20 ng/ml TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取上清，按照說明書采用ELISA 檢測IL-8 的表達。各組設(shè)3 個復(fù)孔。③小分子抑制劑BEZ235/LY294002 聯(lián)合Dex：U937 細胞經(jīng)400 μmol/L H2O2刺激4 h 后，分別與 0.1 μmol/L Dex、1 μmol/L BEZ235/1 μmol/L LY294002 聯(lián)合作用45 min，各孔給予20 ng/ml TNF-α 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取上清，提取細胞RNA，ELI?SA 及實時熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測各組IL-8 表達；提取細胞核蛋白和總蛋白，檢測核蛋白HDAC2活力及NF-κB、AP-1蛋白磷酸化水平。各組設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.2 Real-time PCR 檢測各組細胞 IL-8 mRNA 表達水平 用TRIzol 法提取各組細胞RNA，按照TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照PCR 試劑盒說明書進行操作，最后計算各組細胞IL-8 mRNA 表達水平。所需引物序列如下：IL-8：（F）5'-TTGCCAAGGAGTGCTAAAGAA-3'，（R）5'-GCCCTCTTCAAAAACTTCTCC-3'；GAPDH：（F）5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3'，（R）5'-TCTACACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'。

1.2.3 HDAC2活力的檢測 用碧云天核蛋白提取試劑盒提取細胞核蛋白，然后按照HDAC2 Assay Kit說明書進行操作。

1.2.4 Western blot 檢測各組細胞 NF-κB、AP-1 蛋白表達水平 以RIPA 裂解細胞提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度以保證蛋白質(zhì)量相同。SDS-PAGE電泳后，65 V 恒壓電轉(zhuǎn)蛋白至 PVDF 膜，BSA 封閉，滴加Jun、FOS 磷素化一抗（1∶1 000）、NF-κB 磷酸化一抗（1∶1 000）、GAPDH 一抗（1∶1 000）4℃ 孵育過夜，TBS 緩沖液漂洗后加HRP 二抗，室溫孵育1 h 后發(fā)光系統(tǒng)進行檢測。采用Quantity One 軟件進行相對定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所得數(shù)據(jù)結(jié)果以表示。兩組間比較采用Studentt檢驗，多組間比較用單因素方差分析（ANOVA），P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用GraphPad Prisn7軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 Dex 對 H2O2-TNFα-U937 細胞的抑制作用減輕 TNF-α 可刺激 U937 細胞分泌 IL-8，H2O2+TNF-α聯(lián)合刺激，使得U937 分泌IL-8 的水平更高，為421.8 pg/ml。激素（Dex）可以抑制 TNF-α-U937 模型和H2O2-TNFα-U937模型中IL-8的分泌，但它使前者IL-8 分泌水平下降為73%，而使后者IL-8 分泌水平下降僅50%（圖1）。該結(jié)果提示H2O2是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，是活性氧（reactive oxygen species，ROS）成分的一種，細胞模型中添加H2O2可明顯增加細胞釋放炎癥介質(zhì)的能力，并使細胞對Dex 的抑炎作用產(chǎn)生抵抗（圖1）。

圖1 TNF-α 刺激 Dex 預(yù)處理的 H2O2-TNFα-U937 細胞時IL-8的表達Fig.1 Effects of TNF-α on IL-8 expression in H2O2-TNFα-U937 cell pre-incubated with Dex

2.2 單用PI3K 抑制劑不能明顯抑制H2O2-TNFα-U937 細胞釋放IL-8 由上述實驗可知H2O2-TNFα-U937 細胞模型對Dex 的敏感性下降，有效模擬了重癥哮喘、吸煙哮喘患者PBMCs 的氧化應(yīng)激-激素耐受效應(yīng)。為了了解PI3K 抑制劑能否抑制H2O2-TNFα-U937 細胞釋放 IL-8，將 Dex、PI3K 抑制劑BEZ235 或LY294002 分別與其單獨作用，檢測各組在TNF-α 刺激后的IL-8 表達水平（圖2）。結(jié)果顯示單用 Dex 可減少 H2O2-TNFα-U937 細胞釋放 IL-8 水平約 55%，而 PI3K 抑制劑如 BEZ235 或 LY294002 單獨作用于H2O2-TNFα-U937 細胞僅僅使得IL-8 的釋放減少23%、21%。說明單用PI3K 抑制劑不能明顯抑制H2O2-TNFα-U937 細胞釋放IL-8，不如單用Dex的抑制效果。

圖2 PI3K 抑制劑干預(yù)后 H2O2-TNFα-U937 細胞的 IL-8 釋放情況Fig.2 Effects of PI3K inhibitor on IL-8 releasing in H2O2-TNFα-U937 cell

2.3 PI3K 抑制劑聯(lián)合Dex 明顯改善H2O2-TNFα-U937 細胞模型對激素的不敏感性 為了進一步驗證 PI3K 抑制劑聯(lián)合 Dex 對 H2O2-TNFα-U937 細胞模型 的 作 用 ，將 Dex、PI3K 抑 制 劑 BEZ235+Dex 或LY294002+Dex 分別處理 H2O2-TNFα-U937 細胞，檢測各組IL-8 分泌情況（圖3）。組間比較顯示BEZ235 或 LY294002 聯(lián)合 Dex 對 IL-8 釋放的抑制作用，對比Dex 單用抑制55%的情況下，又有明顯降低。BEZ235+Dex 組、LY294002+Dex 組分別對 IL-8的分泌抑制為86%、65%（vs H2O2-TNF-α組）。

圖3 PI3K 抑制劑聯(lián)合 Dex 干預(yù)后 H2O2-TNFα-U937 細胞的IL-8釋放情況Fig.3 Effects of PI3K inhibitor plus Dex on IL-8 releas?ing in H2O2-TNFα-U937 cell

2.4 BEZ235聯(lián)合Dex可部分恢復(fù)H2O2-TNFα-U937細胞核蛋白HDAC2 活力 已知激素耐受與氧化應(yīng)激損害了HDAC2 活力有關(guān)，為了驗證PI3K 抑制劑BEZ235 或LY294002 輔助Dex 減輕該模型激素不敏感是否與HDAC2活力改善有關(guān)，提取上述各組細胞核蛋白檢測其HDAC2 活力（圖4）。結(jié)果顯示H2O2-TNFα-U937 細胞模型組較空白對照組HDAC2 活力顯著降低（P<0.01），說明氧化應(yīng)激可損害U937 細胞核蛋白HDAC2 活力，在Dex 單獨處理后能部分恢復(fù)其 HDAC2 活力，但不顯著；BEZ235 聯(lián)合 Dex 可進一步促進 HDAC2 活力恢復(fù)（vs H2O2組，P<0.05），Dex 聯(lián)合LY294002 與H2O2組相比無明顯差異。提示PI3K 的兩個抑制劑對HDAC2 活力恢復(fù)能力不同。BEZ235 聯(lián)合Dex 能更加有效地逆轉(zhuǎn)該模型核蛋白HDAC2活力，從而改善其對激素的敏感性。

圖4 Dex 或 PI3K 抑制劑聯(lián)合 Dex 對 H2O2-TNFα-U937 細胞核蛋白HDAC2活力的影響Fig.4 Effect of DEX or PI3K inhibitor combined with Dex on activity of nuclear protein HDAC2 in H2O2-TNFα-U937 cell

2.5 PI3K 抑制劑（BEZ235/LY294002）聯(lián)合Dex 可降低H2O2-TNFα-U937 細胞中炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1 的磷酸化水平 為了探索BEZ235/LY294002聯(lián)合Dex 減輕H2O2-TNFα-U937 模型對激素不敏感的機制，通過 Western blot 檢測各組 NF-κB 磷酸化水平及AP-1 亞基c-FOS 及c-Jun 蛋白磷酸化水平（圖5）。結(jié)果表明H2O2處理使炎癥轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB、c-FOS、c-JUN）磷酸化水平顯著高于空白對照組（P<0.01）；Dex 單獨處理后 NF-κB 磷酸化水平無明顯變化，而 LY294002 聯(lián)合 Dex 能顯著抑制 NF-κB 磷酸化水平（P<0.01）；BEZ235 或 LY294002 聯(lián)合 Dex 均能顯著抑制c-FOS 和c-JUN 磷酸化水平（P<0.01）。提示BEZ235 或LY294002 能通過減輕相應(yīng)炎癥轉(zhuǎn)錄因子磷酸化水平來輔助Dex發(fā)揮抗炎作用。

圖5 PI3K 抑制劑聯(lián)合 Dex 對 H2O2-TNFα-U937 細胞炎癥轉(zhuǎn)錄因子磷酸化的影響Fig.5 Effects of PI3K inhibitor on phosphorylation of nuclear signal transcription factors in H2O2-TNFα-U937 cell

3 討論

氧化應(yīng)激是哮喘、COPD 等慢性氣道炎癥性疾病的主要發(fā)病機制之一，也是激素治療不敏感的關(guān)鍵因素［2］。但激素不敏感的發(fā)生機制涉及多種途徑，目前仍沒有明確證據(jù)指明如何改善這一現(xiàn)象。本研究前期預(yù)實驗分離了重癥哮喘、輕中度哮喘和健康對照者的PBMCs，證實Dex 抑制重癥哮喘組PBMCs 釋放IL-8 的作用較后兩組明顯減弱（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。因此，建立H2O2-TNFα-U937 細胞模型來模擬氧化應(yīng)激-激素耐受效應(yīng)，以求深入研究氧化應(yīng)激對慢性氣道炎癥激素不敏感的作用并探討改善途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2處理U937 細胞后，細胞釋放IL-8 明顯增多，對Dex 的抑炎作用產(chǎn)生了抵抗，提示H2O2引起的氧化應(yīng)激的確能損害細胞對激素的敏感性。

煙霧暴露哮喘小鼠模型表明，氧化應(yīng)激可激活PI3K 通路，促進炎癥反應(yīng)，從而降低激素敏感性，且PI3Kδ 和γ 是潛在的抗炎靶點［12］。因此本研究選取了 BEZ235 和 LY294002 兩種 PI3K 抑制劑對 H2O2-TNFα-U937 細胞模型進行單獨干預(yù)，結(jié)果表明單用PI3K 抑制劑不能明顯抑制細胞釋放IL-8，甚至不如單用Dex。顯然單獨抑制PI3K 通路并不能有效抑制炎癥反應(yīng)，這可能與抑制IL-8 基因表達還需通過GC-糖皮質(zhì)激素受體（GR）復(fù)合物與IL-8基因相互作用實現(xiàn)有關(guān)，目前尚無證據(jù)能予以解釋。本研究進一步采用上述兩種PI3K 抑制劑聯(lián)合Dex 對細胞模型進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)兩種PI3K 抑制劑聯(lián)合Dex 能明顯改善細胞對激素的抵抗，與單用Dex 或PI3K 抑制劑相比有顯著差異。聯(lián)合Dex干預(yù)有效或許在一定程度上與本研究的假設(shè)符合，但具體原因需要更多實驗進行探索。

組蛋白去乙?；福℉DACs）家族是一類細胞內(nèi)酶，可催化組蛋白賴氨酸去乙?；瘉碚{(diào)節(jié)基因表達，HDAC2 幾乎僅存在于細胞核中，是關(guān)閉活化的炎癥基因的關(guān)鍵核酶，因此，HDAC2 減少將引起炎癥過程放大［13］。研究表明氧化應(yīng)激能通過激活PI3K/AKT/mTOR 通路導(dǎo)致HDAC2 活力降低，與哮喘和 COPD 患者激素不敏感性的發(fā)生密切相關(guān)［7，14］。臨床研究也發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)氧化應(yīng)激水平高的重癥哮喘患者HDAC2活力明顯受損，而低濃度茶堿有望通過PI3Kδ 依賴機制將降低的HDAC2 活力恢復(fù)到正常水平，改善COPD、重癥哮喘和吸煙哮喘患者對激素的不敏感［15］。為了驗證小分子抑制劑輔助Dex改善細胞對激素的不敏感性是否與HDAC2 活力改變有關(guān)，本研究檢測了細胞核蛋白HDAC2 活力，結(jié)果證實氧化應(yīng)激損害了U937 細胞核蛋白HDAC2 活力，Dex 單獨處理僅能部分恢復(fù)其HDAC2 活力，但并不顯著，與上述研究中Dex 對炎癥介質(zhì)釋放的抑制作用明顯減弱一致；BEZ235 聯(lián)合Dex 能進一步促進HDAC2 活力恢復(fù)，LY294002 聯(lián)合 Dex 與 H2O2組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，盡管該結(jié)果與LY294002 能改善激素抵抗的發(fā)現(xiàn)相矛盾，也許是由于LY294002作為非選擇性抑制劑，干預(yù)了其他通路導(dǎo)致其恢復(fù)HDAC2的活力受到了影響。

GC 的間接基因調(diào)控中，GR 結(jié)合HDAC2脫去乙?；?，使轉(zhuǎn)錄因子如 NF-κB 和 AP-1 失去功能，抑制炎癥基因轉(zhuǎn)錄［16］，因此本研究檢測了 BEZ235 或LY294002 聯(lián)合 Dex 對 NF-κB、AP-1 磷酸化水平的影響，研究其改善激素不敏感性的機制。通過West?ern blot 分析，發(fā)現(xiàn) Dex 單獨處理后 NF-κB 磷酸化水平無明顯變化，BEZ235 或 LY294002 聯(lián)合 Dex 均能顯著抑制AP-1 磷酸化水平，但僅LY294002 聯(lián)合Dex 能顯著抑制 NF-κB 磷酸化水平，可見 BEZ235 或LY294002 聯(lián)合Dex 改善激素不敏感性的調(diào)節(jié)機制復(fù)雜，在輔助Dex 發(fā)揮抗炎作用的不同環(huán)節(jié)中存在著一定差異。LY294002 聯(lián)合Dex 雖不能恢復(fù)HDAC2 的活力，但能通過減少 NF-κB、AP-1 的磷酸化水平來輔助Dex 改善氧化應(yīng)激導(dǎo)致的激素不敏感，這也說明激素不敏感的具體作用機制亟待后續(xù)的深入探索。

由于本研究細胞模型并非慢性氣道炎癥疾病患者的來源細胞，氣道炎癥環(huán)境又較為復(fù)雜，故在某些程度上存在局限性。但從一定意義上來說，它是模擬重癥哮喘、吸煙哮喘患者PBMCs 對激素干預(yù)不敏感效應(yīng)的體外細胞工具。通過該細胞模型，本研究證實PI3K 抑制劑聯(lián)合Dex 可以通過恢復(fù)HDAC2活力和（或）抑制核信號轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，在體外改善H2O2-TNFα-U937 細胞模型對激素的不敏感性。PI3K 抑制劑是否能輔助激素治療因氧化應(yīng)激導(dǎo)致的慢性氣道炎癥患者對激素的不敏感性還有待深入研究。