丹參飲預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究

任耀龍，楊 磊，趙明君，鄭 剛，徐佳萌，楊 聰，王艷琴，尤金枝，齊 婧，鐘 偉，李瑩超

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；3. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000)

心肌缺血再灌注損傷是冠脈血運(yùn)重建時(shí)代嚴(yán)重制約臨床獲益的常見(jiàn)原因[1]。目前研究認(rèn)為心肌缺血再灌注損傷與氧自由基爆發(fā)[2]、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載[3]、pH值快速恢復(fù)[4]、心肌能量代謝障礙[5]、炎性反應(yīng)[6]等有關(guān)，但其具體病理生理機(jī)制尚未明確，且西醫(yī)學(xué)應(yīng)對(duì)手段非常有限。中醫(yī)經(jīng)典名方丹參飲由丹參、檀香、砂仁組成，具有活血祛瘀、行氣止痛作用，用于冠心病心絞痛的治療顯示出較好療效[7]。本實(shí)驗(yàn)研究從炎癥角度出發(fā)，探討了丹參飲預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康成年SD大鼠50只，雌雄各25只，體重180～210 g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲用水喂養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2主要藥物 丹參飲由丹參15 g、檀香15 g、砂仁10 g組成，藥物均購(gòu)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中草藥房。藥物制備：精確稱取生藥40 g，加12倍自來(lái)水，浸泡30 min，按W/V=1/8量加水煎煮2次(檀香后下)后，藥液以1 000 r/min離心10 min除雜質(zhì)，濃縮為含生藥量1 g/mL，4 ℃下密封冷藏備用。

1.3試劑與儀器 肌酸激酶同工酶(CK-MB)、高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)試劑盒[艾萊薩生物科技(上海)有限公司，批號(hào)：20191231]，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20191228)。澳大利亞埃德公司PL3508/P八通道研究型高速記錄系統(tǒng)；SC-5型小動(dòng)物呼吸機(jī)；美國(guó)Bio-Tek ELXSOSIU型全自動(dòng)酶標(biāo)儀；日本日立CR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī)；Leica VT1000 S振動(dòng)切片機(jī)；TC-120S+生物組織自動(dòng)脫水機(jī)；TR-180生物組織自動(dòng)染色機(jī)；Nikon TS100-F(配DS-5MC)IX73-U型倒置熒光數(shù)碼顯微鏡。

1.4分組及干預(yù) 將50只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、丹參飲低劑量組、丹參飲中劑量組、丹參飲高劑量組，每組10只，各組雌雄各5只。丹參飲低、中、高劑量組大鼠分別給予丹參飲5 g(生藥量)/kg、10 g(生藥量)/kg、15 g(生藥量)/kg灌胃，10 mL/kg；假手術(shù)組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃。各組均每日灌胃2次，連續(xù)14 d。

1.5模型制備方法 末次灌胃結(jié)束后第2天，各組參考文獻(xiàn)[8]方法并進(jìn)行改進(jìn)建立心肌缺血再灌注損傷，具體操作方法：大鼠實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，采用10%水合氯醛以3.5 mL/kg劑量腹腔注射麻醉后仰位固定于動(dòng)物解剖臺(tái)，連接Medlab信號(hào)采集系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，氣管切開(kāi)行氣管插管接小動(dòng)物呼吸機(jī)(潮氣量2.5 mL，呼吸頻率70次/min，呼吸比1∶2)，觀察穩(wěn)定5 min后于胸骨左緣約0.5 cm處開(kāi)胸，剪斷第4肋骨，刺破胸膜充分暴露心臟，剪開(kāi)心包后將心臟擠出胸腔，于左心耳與肺動(dòng)脈圓錐交界處高位以0號(hào)手術(shù)線縫針穿過(guò)左前降支，同時(shí)將直徑1 mm的聚乙烯管置于手術(shù)線與左前降支之間，拉緊手術(shù)線使聚乙烯管壓迫左前降支造成急性心肌缺血模型，以心電圖ST段抬高大于0.1 mV為結(jié)扎成功標(biāo)志。缺血45 min后去除聚乙烯管恢復(fù)左前降支灌注，以心臟表面顏色轉(zhuǎn)紅、抬高的ST段下降1/2以上為再灌注成功標(biāo)志。假手術(shù)組手術(shù)過(guò)程與各造模組相同，但只穿線不結(jié)扎冠脈。

1.6血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠再灌注3 h后腹主動(dòng)脈取血，血液標(biāo)本3 000 r/min離心后取上清分裝，置于-20 ℃冰箱冷凍備用，實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后嚴(yán)格按照試劑盒操作要求測(cè)定血清LDH、CK-MB和hs-CRP水平。

1.7HE染色心肌組織病理觀察 采血后快速摘除心臟，取缺血心肌組織(假手術(shù)組取心肌組織)，置于10%福爾馬林溶液中進(jìn)行固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，HE染色后進(jìn)行光學(xué)觀察，采集圖像進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠心肌缺血再灌注損傷造模各階段心電圖表現(xiàn) 大鼠行前降支結(jié)扎即刻心電圖表現(xiàn)為ST段呈弓背向上抬高，提示造模成功；45 min后取出聚乙烯管給予前降支再灌注后出現(xiàn)室性心律失常，并出現(xiàn)q波；再灌注180 min后心電圖表現(xiàn)為ST段回落，病理性Q波形成。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠心肌缺血再灌注損傷造模各階段心電圖表現(xiàn)

2.2各組大鼠血清CK-MB、LDH、hs-CRP水平比較 模型組大鼠血清CK-MB、LDH、hs-CRP水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)；丹參飲各組大鼠血清CK-MB、LDH、hs-CRP水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，丹參飲中、高劑量組均明顯低于丹參飲低劑量組(P均<0.05)，丹參飲高劑量組均明顯低于丹參飲中劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3各組大鼠心肌組織HE染色病理學(xué)表現(xiàn) 模型組大鼠心肌組織紋理紊亂，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯破壞，丹參飲各組上述病理表現(xiàn)較輕，丹參飲高劑量組最輕。見(jiàn)圖2。

圖2 假手術(shù)組和心肌缺血再灌注損傷各組大鼠心肌組織HE染色表現(xiàn)(×20)

3 討 論

急性心肌梗死是心血管系統(tǒng)急危重癥，具有發(fā)病率高、致死率高的特點(diǎn)，已成為嚴(yán)重威脅人民生命安全的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題[9]。及時(shí)恢復(fù)閉塞冠脈血流可最大限度挽救缺血心肌，保存心臟功能[10]。然而，罪犯血管血流恢復(fù)后的再灌注過(guò)程中血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能存在不同程度損傷，進(jìn)而導(dǎo)致抗中性粒細(xì)胞黏附作用減弱，中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)冠脈，可加劇不可逆心肌損傷，損害心功能，即再灌注損傷[11]。心肌缺血再灌注損傷的具體生理病理機(jī)制復(fù)雜，認(rèn)為與細(xì)胞凋亡、心肌能量代謝障礙、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、氧自由基爆發(fā)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等有關(guān)，其中炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷的主要病理機(jī)制之一[12]。因此，如何減少心肌細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)、保存心功能成為該領(lǐng)域的重要研究課題之一。

目前，西醫(yī)學(xué)應(yīng)對(duì)心肌缺血再灌注損傷的主要手段包括缺血預(yù)處理和缺血后處理，但均為有創(chuàng)操作，存在進(jìn)一步破壞冠脈的潛在風(fēng)險(xiǎn)，臨床應(yīng)用受限[13]。近年來(lái)，中醫(yī)藥廣泛應(yīng)用于心肌缺血再灌注損傷的防治，多種中藥單體及中藥復(fù)方被證實(shí)可有效減少心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌細(xì)胞線粒體損傷，調(diào)控自噬過(guò)程，調(diào)節(jié)內(nèi)源性一氧化氮表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，多角度發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用[14-15]。丹參飲出自《時(shí)方歌括》，該方藥簡(jiǎn)力宏，是本研究團(tuán)隊(duì)臨床治療急性心肌梗死最常用的有效經(jīng)典基礎(chǔ)方劑之一，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了其對(duì)心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)采用前降支結(jié)扎方法制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，造模過(guò)程中觀察到典型的再灌注損傷引起的心律失常表現(xiàn)；再灌注后模型組大鼠血清CK-MB、LDH、hs-CRP水平均明顯升高，丹參飲各組均明顯低于模型組，且隨著丹參飲濃度遞增各指標(biāo)降低越明顯。說(shuō)明丹參飲預(yù)處理可顯著降低心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心肌酶學(xué)指標(biāo)水平，其可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)保護(hù)心肌細(xì)胞，并且該保護(hù)效應(yīng)與丹參飲濃度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)HE染色觀察到模型組大鼠心肌紋理紊亂，心肌細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)破壞，丹參飲預(yù)處理可明顯改善這一病理表現(xiàn)，并隨著丹參飲濃度增加，改善作用越明顯，從病理學(xué)角度證實(shí)丹參飲預(yù)處理可保護(hù)心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心肌細(xì)胞。

綜上所述，丹參飲預(yù)處理可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)保護(hù)缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞，減輕心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷，且這種作用與丹參飲濃度有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。