腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌拮抗放線菌的篩選與鑒定

宋利沙，蔣 妮，張占江，藍(lán)祖栽，白隆華

(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023)

【研究意義】腫節(jié)風(fēng)(Sarcandraglabra)為金粟蘭科草珊瑚屬多年生草本植物草珊瑚[S.glabra(Thunb.)]的干燥全草，具有活血消斑、清熱涼血、祛風(fēng)通絡(luò)等功效，是中國(guó)藥典的收錄品種[1-2]，也是廣西傳統(tǒng)瑤藥“七十二風(fēng)”中的重要風(fēng)藥品種之一[3]。近年來(lái)，腫節(jié)風(fēng)在廣西融安、靖西、東蘭等縣市大面積種植，從苗期到成株期均出現(xiàn)由半知菌類刺盤(pán)孢屬黑線炭疽菌(Colletotrichumdematium)引起的葉部病害，平均發(fā)生率在50%以上，尤其在融安的林下套種模式下發(fā)病率達(dá)65%[4]。目前，腫節(jié)風(fēng)炭疽病的防治以化學(xué)藥劑為主，但長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑容易產(chǎn)生病原菌抗(耐)藥、病害易復(fù)發(fā)及農(nóng)藥殘留等負(fù)面問(wèn)題[5]。世界上50%的生物活性化合物由放線菌產(chǎn)生，尤其是鏈霉菌產(chǎn)生的多抗霉素、井崗霉素和阿維菌素等抗生素已成為實(shí)際利用的次級(jí)代謝產(chǎn)物[6-8]，并已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，但至今利用放線菌防治腫節(jié)風(fēng)炭疽病的研究尚屬空白。因此，篩選拮抗腫節(jié)風(fēng)炭疽病病原菌的放線菌，對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病的生物防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鏈霉菌存在于不同類型的土壤和水中，資源豐富，能產(chǎn)生多種抗菌活性的抗生素，已在生物防治上廣泛應(yīng)用[9-10]。牛紅杰等[11]研究顯示，從黃瓜根際土壤分離得到的小鏈霉菌對(duì)黃瓜枯萎病病菌(尖孢鐮刀菌、茄腐鐮刀菌和立枯絲核菌)具有一定的抑制作用。劉琴等[12]研究表明，徹氏鏈霉菌100倍液灌根對(duì)番茄枯萎病的防治效果最佳，達(dá)72.84%。涂璇等[13]、申哲等[14]研究發(fā)現(xiàn)，淡紫灰鏈霉菌對(duì)番茄早疫病菌和灰霉病菌、柑桔炭疽病菌、黃瓜炭疽病菌、玉米彎孢病菌、小麥赤霉病菌、棉花枯萎病菌、辣椒疫病菌、小麥紋枯病菌、棉花立枯病菌、油菜菌核病菌及蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌等多種植物病原菌均有很強(qiáng)的拮抗作用，具有潛在生防價(jià)值。Dame等[15]研究發(fā)現(xiàn)，從海洋放線菌中分離獲得的4種抗生素(寡霉素a和b、巴馬霉素和棘孢鏈菌素)可抑制葡萄霜霉病病菌(Plasmoparaviticola)孢子游動(dòng)，使其細(xì)胞壁溶解，達(dá)到防治葡萄霜霉病的目的。Sellem等[16]研究認(rèn)為，鏈霉菌發(fā)酵提取物可使腐霉菌(Pythiumultimo)菌絲生長(zhǎng)受到抑制及卵孢子畸形扭曲。Phuakjaiphaeo等[17]研究表明，從積雪草(Centellaasiatica)根節(jié)分離得到1株內(nèi)生鏈霉菌，其代謝產(chǎn)生的化合物可導(dǎo)致甘藍(lán)黑斑病菌(Alternariabrassicicola)分生孢子畸形、附著胞不能形成及孢子萌發(fā)延遲。Shrivastava等[18]研究顯示，印度恒河平原土壤中分離得到的嗜鹽放線菌(K20)產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶可溶解菜豆殼球孢菌(Macrophominaphaseolina)的菌絲細(xì)胞壁，從而發(fā)揮明顯的拮抗作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】利用生防菌防治植物病害已成為植物病害防治的重要方法之一及國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，也是未來(lái)綠色中藥材發(fā)展的趨勢(shì)，但目前關(guān)于篩選拮抗腫節(jié)風(fēng)炭疽病病原菌放線菌的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從健康腫節(jié)風(fēng)植株根系土壤中篩選拮抗腫節(jié)風(fēng)炭疽病病原菌的放線菌菌株，分析確定其分類地位，采用離體葉片刺傷接種法測(cè)定所篩選獲得拮抗菌株對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病的防效，以期為腫節(jié)風(fēng)炭疽病的生物防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌(編號(hào)Z1)由廣西壯族自治區(qū)藥用植物園實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存；土壤樣品采自廣西靖西市五嶺林場(chǎng)腫節(jié)風(fēng)健康植株根系土壤。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌發(fā)酵液制備 腫節(jié)風(fēng)健康植株根系土壤取樣時(shí)采取五點(diǎn)取樣法將整株腫節(jié)風(fēng)挖起，用無(wú)菌小毛刷刷取植株根系上的土壤，每5株的根系土壤均勻混合為一個(gè)樣品(200 g)，重復(fù)3次，共計(jì)15株，編號(hào)后封存于保鮮袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，48 h內(nèi)采用稀釋涂布平板法在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上進(jìn)行放線菌分離，并通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)，計(jì)算分離得到的放線菌對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌的抑制率，篩選對(duì)黑線炭疽病具有拮抗活性的放線菌[19-22]。將抑制率最高的拮抗菌株用于下一步抑菌譜試驗(yàn)。挑取抑制率最高的拮抗菌株(JT-2F菌株)單菌落接種于不加瓊脂的高氏一號(hào)培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩3 d，得到拮抗菌株的發(fā)酵液，用無(wú)菌紗布和濾紙過(guò)濾后，10 000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，得到拮抗菌株的無(wú)菌發(fā)酵液。

1.2.2 JT-2F菌株抑菌譜測(cè)定 供試藥用植物病害病原真菌三七灰霉病菌(Botrytiscinerea)、三七根腐病菌(Fusariumsolani)、三七黑斑病菌(Alternariapanax)、三七炭疽病菌(Colltetorrichumgloeosporioides)、羅漢果斑枯病菌(Stagonosporopsiscucurbitacearum)、苦玄參葉斑病菌(Alternariaputuminum)、廣西莪術(shù)葉斑病菌(Phomopsissp.)、豆蔻葉斑病菌(Phyllostictasp.)和艾納香褐斑病菌(Phomasp.)均由廣西壯族自治區(qū)藥用植物園實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存；農(nóng)作物病害病原菌西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、香蕉炭疽病菌(Colltetorrichumgloeosporioides)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、香蕉葉斑病菌(Alternariasp.)和煙草灰霉病菌(Botrytiscinerea)均由廣西大學(xué)植病研究室袁高慶教授提供。

選取1.2.1中對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌防效較佳的放線菌JT-2F和DT-3F菌株，參照程麗娟等[20]、朱宏建等[21]、張瑾等[22]的平板對(duì)峙法對(duì)上述14種植物病原菌進(jìn)行抑菌譜測(cè)定。將直徑為0.5 cm的病原菌組織塊置于PDA平板中心，在其兩側(cè)等距離處分別接種JT-2F和DT-3F菌株組織塊，以單獨(dú)接種病原菌為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。待對(duì)照長(zhǎng)滿整個(gè)平皿時(shí)，測(cè)量菌落直徑并計(jì)算抑制率。抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100。

1.2.3 JT-2F菌株離體防治試驗(yàn) 參考刺傷接種法進(jìn)行放線菌對(duì)炭疽病菌離體防效試驗(yàn)[23]。選取大小一致的腫節(jié)風(fēng)葉片，先用自來(lái)水沖洗干凈，75%酒精表面消毒，無(wú)菌水沖洗、晾干后置于超凈工作臺(tái)，再用無(wú)菌接種針在葉片上刺傷一個(gè)直徑為6.0 mm的圓形接種面，然后分別在傷口處涂抹(200 μL)稀釋10、20、50、100和200倍JT-2F菌株的無(wú)菌發(fā)酵液及原液，最后在傷口處接種直徑7.0 mm的腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌菌餅，以涂抹無(wú)菌水為對(duì)照，重復(fù)3次。接種5 d后參考薛應(yīng)鈺等[24]的方法測(cè)量并記錄病斑面積，采用十字交叉法測(cè)量病斑長(zhǎng)度，計(jì)算病斑面積及防效。病斑面積=1/4×π×病斑長(zhǎng)徑×病斑短徑；防效(%)=(對(duì)照病斑面積-處理病斑面積)/對(duì)照病斑面積×100，選取防效高的JT-2F菌株進(jìn)行抑菌譜測(cè)定、形態(tài)鑒定和分子學(xué)鑒定。

1.2.4 JT-2F菌株鑒定 ①形態(tài)鑒定。用劃線法將JT-2F菌株接種至高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)約10 d，觀察菌體的形態(tài)特征[25]。②分子生物學(xué)鑒定。將培養(yǎng)3 d的JT-2F菌株接種至40 mL不加瓊脂的高氏一號(hào)培養(yǎng)基三角瓶(100 mL)中，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后制成菌體懸浮液，離心收集菌體，采用改良的SDS裂解法用DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取放線菌基因組DNA。采用放線菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(由生工生物工程(上海)股份有限公司完成)。反應(yīng)體系25.0 μL：模板DNA(20～50 ng/μL) 0.5 μL，10×Buffer(含Mg2+) 2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 1.0 μL，酶0.2 μL，上、下游引物各0.5 μL，加雙蒸H2O至25.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增中利用水代替DNA模板為空白對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽(yáng)性產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以MEGA 4.0的Neighbor-Joining法構(gòu)建16S rDNA相似序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌的分離與篩選結(jié)果

從腫節(jié)風(fēng)健康植株根系土壤中共分離得到具有拮抗活性的15株放線菌，其中，3株對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌抑制率<60.00%，10株抑制率為60.00%～80.00%，2株抑制率>80.00%(編號(hào)分別為JT-2F和DT-3F，表1)。JT-2F菌株對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌的抑制率最高，為86.75%，顯著高于其他14株菌株(P<0.05，下同)；DT-3F對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌的抑制率(80.54%)次之，顯著高于除JT-2F和DT-6F外的其他菌株。與正常的炭疽病菌菌絲(圖1-A)相比，在對(duì)峙培養(yǎng)中腫節(jié)風(fēng)炭疽病病原菌菌絲的生長(zhǎng)明顯受到JT-2F菌株抑制(圖1-B)；分別挑取培養(yǎng)7 d的對(duì)照組和處理組黑線炭疽菌菌絲在顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的菌絲直且粗細(xì)均勻(圖1-C)，而JT-2F菌株處理組的菌絲體發(fā)生畸變，菌絲纏繞扭曲，部分菌絲顏色變深，菌絲體膨大(圖1-D)。說(shuō)明JT-2F和DT-3F菌株對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌有很好的抑菌效果(抑制率均在80.00%以上)。

表1 拮抗放線菌對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌的抑制效果比較

2.2 拮抗菌株對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌的離體防效

JT-2F菌株的離體防治試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的提高防效相應(yīng)降低(圖2)，發(fā)酵液原液的防治效果達(dá)87.32%，且顯著高于其他處理(表2)；當(dāng)發(fā)酵液稀釋至50倍時(shí)，防治效果下降到54.62%，稀釋至100和200倍時(shí)，防效分別下降至30.08%和25.50%，防治效果不理想。

表2 JT-2F菌株發(fā)酵液對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌的防治效果

2.3 拮抗放線菌抑菌譜

以JT-2F和DT-3F菌株對(duì)14種植物病原菌進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JT-2F菌株的平均抑制率達(dá)81.50%，顯著高于DT-3F菌株的平均抑制率(表3)。其中，JT-2F菌株對(duì)農(nóng)作物病原菌的抑制率均在70.00%以上，尤其對(duì)香蕉炭疽病菌的抑制率最高，達(dá)89.41%，對(duì)西瓜枯萎病菌的抑制率雖較低，但仍達(dá)71.18%；JT-2F菌株對(duì)藥用植物病菌艾納香褐斑病菌的抑制率最高，為87.50%，對(duì)豆蔻葉斑病菌的抑制率較低，但仍達(dá)72.94%，對(duì)其他藥用植物病原菌的抑制率均達(dá)到75.00%以上?？梢?jiàn)，JT-2F菌株對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病具有較好的生防應(yīng)用前景。

表3 JT-2F和DT-3F菌株對(duì)14種植物病原菌的抑菌譜

2.4 拮抗菌株的鑒定結(jié)果

2.4.1 形態(tài)鑒定結(jié)果 JT-2F菌株在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上開(kāi)始呈白色，后期呈灰色菌落，菌落邊緣呈乳白色表面褶皺，孢子卵圓形。菌絲生長(zhǎng)旺盛，顏色為白色。

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 JT-2F菌株用通用引物16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，獲得1404 bp核苷酸序列。將該序列與NCBI中GenBank的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JT-2F菌株與鏈霉菌屬(Streptomyces)同源性很高，相似度達(dá)100.0%(表4)。采用MEGA 4.0對(duì)JT-2F菌株的16S rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，結(jié)果(圖3)表明，JT-2F菌株與S.tsukiyonensisAB184594菌株序列在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)上處于同一個(gè)分支，屬津島鏈霉菌(S.tsukiyonensis)。根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征及16S rDNA分子鑒定結(jié)果，初步鑒定JT-2F菌株為津島鏈霉菌，序列登錄號(hào)MK368447。

表4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析中使用的放線菌菌株序列

3 討 論

鏈霉菌屬是放線菌類群中的最大成員之一，具有抗菌防病功能，且抑菌譜廣，可產(chǎn)生多種抗生素[26]，對(duì)開(kāi)發(fā)生物農(nóng)藥和生物制劑具有潛在應(yīng)用價(jià)值。已有研究表明，纖維黃鏈霉菌(S.celluloflavus)和S.yatensis對(duì)香蕉枯萎病菌菌絲的抑制率分別達(dá)70.12%和54.46%[27]，婁徹氏鏈霉菌(S.rochei)Lj20對(duì)番茄灰霉病菌具有較強(qiáng)的抑制作用[28]，紫黑鏈霉菌(S.vioiaceoniger)對(duì)山藥炭疽病菌具有較好的拮抗作用[29]，殺黃孢鏈霉菌(S.xanthocidicus)對(duì)白色假絲酵母(Candidaalbicaus)CMCC 98001和恥垢分枝桿菌(MycobacteriumSmegmatis)MC2的抗菌活性較強(qiáng)[30]，新種閘坡鏈霉菌(S.zhapoensis)對(duì)花生青枯菌具有較強(qiáng)的拮抗作用[31]，放線菌S.griseinus對(duì)葡萄白腐病菌具有良好的抑制效果[32]，黃暗色鏈霉菌(S.xanthophaeus)Ac16抑制草莓灰霉病菌能力較強(qiáng)[33]，天藍(lán)鏈霉菌放線菌素變種(S.coeruleofuscusvar.actinomycini)屬于對(duì)常見(jiàn)植物病原菌(黃瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌、玉米小斑病菌、蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌、番茄早疫病菌和棉花黃萎病菌)有較強(qiáng)抑制活性的放線菌[34]。本研究從健康腫節(jié)風(fēng)根際土壤中分離到1株對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌具有較強(qiáng)拮抗作用的鏈霉菌菌株JT-2F，對(duì)14種供試病原菌(包括香蕉、煙草和西瓜等5種農(nóng)作物病原真菌及三七、艾納香、豆蔻和廣西莪術(shù)等9種藥用植物的病原真菌)均具較強(qiáng)的拮抗作用；通過(guò)形態(tài)學(xué)特性和16S rDNA鑒定，JT-2F菌株屬于津島鏈霉菌；離體防效試驗(yàn)結(jié)果顯示，JT-2F菌株發(fā)酵原液對(duì)離體葉片上腫節(jié)風(fēng)炭疽病的防效達(dá)87.32%。但是關(guān)于津島鏈霉菌在生物防治中的作用機(jī)理、在田間的拮抗效果、對(duì)腫節(jié)風(fēng)生長(zhǎng)有無(wú)促生作用及如何與生物農(nóng)藥和生物制劑配合使用等仍需進(jìn)一步探究。

鏈霉菌發(fā)酵液能產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物[24]，在生物防治中常采用液體發(fā)酵方式產(chǎn)生拮抗活性物質(zhì)以應(yīng)用于植物病害防治。段學(xué)輝等[35]研究發(fā)現(xiàn)，紫黑吸水鏈霉菌(S.violaceoniger-hygroscopicus)的發(fā)酵液對(duì)辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、番茄灰病菌(B.cinerea)和黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)具有一定抑制作用。李勇等[36]研究顯示，放線菌YIM31249發(fā)酵液粗提物對(duì)灰霉病菌的最小抑制濃度為0.022 mg/mL，表明發(fā)酵液中具有天然抗菌活性物質(zhì)。榮曉瑩等[37]研究發(fā)表明，灰色鏈霉菌(S.griseus)FQ-017 對(duì)苗期番茄灰霉病的防治效果較佳。本研究將JT-2F菌株在不加瓊脂的培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液原液可使腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌菌絲畸形、膨大，表明JT-2F菌株發(fā)酵液中有抗生類物質(zhì)產(chǎn)生，且發(fā)酵液在一定范圍內(nèi)對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果隨稀釋倍數(shù)增大而減弱，與已報(bào)道的焊灰直絲鏈霉菌(S.chungwhensis)和紫色鏈霉菌(S.spurpureus)的抑菌效果相似[38-39]。

本研究?jī)H將不加瓊脂的放線菌培養(yǎng)液發(fā)酵后應(yīng)用于腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌拮抗試驗(yàn)，在今后的研究中還應(yīng)通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)進(jìn)行鏈霉菌發(fā)酵條件優(yōu)化，以期得到最優(yōu)培養(yǎng)條件用于后期推廣應(yīng)用。

4 結(jié) 論

JT-2F菌株對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，可使炭疽病菌菌絲膨大、畸變和扭曲，抑制率達(dá)86.75%，且對(duì)14種病原真菌也具有較強(qiáng)的拮抗作用，平均抑制率達(dá)81.50%；其發(fā)酵原液對(duì)腫節(jié)風(fēng)離體葉片上腫節(jié)風(fēng)炭疽病的防效達(dá)87.32%。因此，JT-2F菌株用作腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌的生物防治材料具有較大開(kāi)發(fā)和應(yīng)用潛力。