AP4 基因促進子宮內膜癌細胞增殖調節(jié)上皮間質轉化相關分子表達的影響

陶淑芳，別延紅（通訊作者），蔡 靜，金瓊燕，范 紅

（上海市嘉定區(qū)安亭醫(yī)院病理科 上海 201805）

激活增強子結合蛋白4（AP4）/轉錄因子結合蛋白4（TFAP4）是一種基本的螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸-拉鏈轉錄因子，其最初被鑒定為與SV40 啟動子結合的蛋白。后來，AP4 被表征為c-Myc 轉錄因子的靶標，c-Myc轉錄因子是在大多數(shù)腫瘤中被激活的原型致癌基因的產物[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，AP4 可能代表c-Myc 和N-Myc 下游的中央樞紐，介導它們的某些功能，例如增殖和上皮-間質轉化（EMT）。AP4 表達升高與多種腫瘤類型的癌癥進展和患者預后不良相關[3-4]。小鼠中AP4 的缺失表明AP4在控制特性，腫瘤起始和適應性免疫中的作用。子宮內膜癌是危害女性健康的一種重要腫瘤，且近年來發(fā)病率逐年增加。我們課題組前期進行了一些AP4 與子宮內膜癌關系的基礎研究，如AP4 對子宮內膜癌細胞凋亡和惡性轉化等的影響等[5]，然而，目前AP4 基因在子宮內膜癌中研究極少，其對子宮內膜癌細胞的上皮間質轉化的調控作用也尚不清楚。在這里，我們將初步探討AP4 基因對子宮內膜癌細胞增殖的影響及其對一些EMT 相關基因表達的調控。

1.資料與方法

1.1 一般資料

AP4 真核表達載體pez-M02-AP4 由廣州復能基因構建，對照組質粒為pez-M02。子宮內膜癌細胞Ishikawa 購買自上海蓋寧生物科技有限公司。細胞培養(yǎng)基DMEM 及Lipo3000轉染試劑盒購自賽默飛世爾。AP4 抗體購自Sigma 公司。Trizol 試劑及PCR 試劑盒購自大連Takara 公司。增殖檢測試劑盒來自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

基因轉染：Lipo3000 脂質體試劑盒轉染AP4 基因入子宮內膜癌細胞，分為對照組及AP4 組。參照Lipo3000 試劑盒說明書，DNA 與lipo3000 的比例是1μg ∶2μL。

RNA 及蛋白檢測：基因轉染48 h 后，分別收集細胞。Trizol 法提取RNA。RT-Real time PCR 法檢測mRNA 水平改變，Western blot 電泳實驗檢測蛋白表達。其中AP4 基因的引物序列為：F：GAGGGCTCTGTAGCCTTGC，R：GAATCCCGCGTTGATGCTCT。E-鈣黏蛋白的引物序列：F：CGAGAGCTACACGTTCACGG；R：GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG.Vimentin 的引物序列：F：GACGCCATCAACACCGAGTT；R：CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT。

細胞增殖測定：將基因轉染后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h，胰酶消化收取細胞并計數(shù)，然后鋪于96 孔板，密度2.5×104/mL。在基因轉染后24 h，48 h 及72 h 加入10 μL/孔CCK-8 試劑。繼續(xù)孵育1 ～2 h，而后在全自動酶標儀上測定各孔吸光度值。設定的測定波長是450 nm，參比波長是630 nm，計算分析增殖數(shù)據(jù)。

2.結果

首先，我們利用lipo3000 脂質體轉染pez-M02-AP4質粒入細胞。轉染后48 h，提取RNA 和蛋白進行PCR 及蛋白電泳實驗。結果表明，在轉錄水平，AP4 組mRNA 表達較對照組升高約3.756 倍（見圖1）；在蛋白水平，AP4 組則檢測到明確的蛋白表達（見圖2），顯示基因轉染成功。

圖1 AP4 基因轉染上調AP4 的mPNA 表達

圖2 AP4 基因轉染上調AP4 的蛋白表達

我們進一步利用CCK-8 法測定了AP4 基因對細胞增殖的影響。細胞增殖實驗的結果表明，AP4 組與對照組相比，在24 h，48 h，72 h，AP4組細胞增殖增加約17.95%（P＜0.05），26.45%（P＜0.05），21.38%（P＜0.05）（見圖3）。

圖3 AP4 基因促進癌細胞增值

在對EMT 相關分子表達的調控方面，AP4 組與對照組相比，E-cadherin的mRNA下調約40.80%（P＜0.01）（見圖4），vimentin（絲蛋白）則上調約71.10%（P＜0.01）（見圖5）。表明其具有潛在的促進子宮內膜癌細胞發(fā)生上皮間質轉化的能力。

圖4 AP4 基因下調的E-cadherin 的mPNA 表達

圖5 AP4 基因上調vimentin 的mPNA 表達

3.討論

最近的許多研究表明，AP4 在多種類型的腫瘤中高表達，包括乳腺癌，結腸直腸癌，胃癌，胰腺癌，前列腺癌，非小細胞肺癌和肝細胞癌等[1-2,6-9]。AP4 的表達是一個獨立的預后指標，可根據(jù)轉移情況預測總體生存時間和癌癥進展。另外，AP4 對于維持癌細胞的細胞周期進程和調節(jié)腸內腫瘤的發(fā)生是必不可少的[1]，然而其在子宮內膜癌中的研究尚少。

上皮間質轉化（EMT）最初是作為一種形態(tài)發(fā)生程序而發(fā)現(xiàn)的，它參與了多個組織和器官的形成以及傷口的愈合[4,10-12]。研究表明，上皮來源的腫瘤細胞經過EMT過程后，細胞黏附逐漸喪失以及細胞的遷移和侵襲特性增加。因此，腫瘤細胞的EMT 有助于轉移，這是癌細胞的重要標志之一。經過上皮間質轉化，靜止的上皮細胞失去極性并與鄰近組織分離，成為更具運動性和侵襲性的間充質樣細胞。在癌癥發(fā)展的后期階段，EMT 發(fā)生在轉移的初始階段，其中腫瘤細胞從其主要部位擴散，生長并在身體其他部位形成腫瘤，最終導致患者死亡。另外，經過上皮間質轉化過程的細胞具有與干細胞或者癌癥干細胞相關的自我更新性狀。已有研究發(fā)現(xiàn)，部分轉錄因子例如Snail，Slug，ZEB1，ZEB2 和Twist 等可以誘導上皮間質轉化的發(fā)生[10-12]。這些因素直接抑制了細胞黏附介體E-cadherin，并且在一定程度上賦予了干細胞。

研究表明AP4 代表EMT-TF（誘導EMT 的轉錄因子），類似于Snail 或ZEB1/2[1]。AP4 與許多EMT 效應子和標記基因（如Snail，vimentin，F(xiàn)OS，LEF1 和N-cadherin）的啟動子結合并上調[1]，并直接抑制CDH1/E-cadherin。此外，異位AP4 誘導的EMT 和AP4 對于c-Myc 誘導的EMT 是必需的。在異種移植小鼠模型中，AP4 的失活阻止了結直腸癌細胞系注射后肺轉移的形成。此外，AP4 表達升高與患者生存不良和遠處轉移形成增加相關。使用轉移性乳腺癌MDA-MB-231 細胞系，證明AP4 可以通過激活突變的p53-R280K 蛋白和缺乏DNA 結合域的顯性陰性AP4 的表達來激活細胞遷移和侵襲，降低細胞的流動性。此外，大腸癌細胞中的AP4 抑制可抑制細胞遷移和侵襲，而AP4 的過表達則具有相反的作用[4]。子宮內膜癌是一種腺癌，起源于子宮腔內襯的上皮細胞。本次我們發(fā)現(xiàn)，AP4 也具有誘導子宮內膜癌細胞上皮間質轉化的潛能。

綜上所述，AP4 過表達于子宮內膜癌細胞后，抑制了E-cad 基因的表達，并且上調了vimentin 的表達，這一過程有助于降低細胞間黏附作用并促進細胞游離。