基于生物信息學(xué)分析PRMT5在頭頸鱗癌中的表達(dá)及臨床意義

王 楠，黃軒宇

（嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與精準(zhǔn)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 梅州 514015）

頭頸鱗癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是人體常見的惡性腫瘤之一，2018 年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，頭頸部癌癥年新發(fā)病例約70 萬，死亡病例約35 萬，其發(fā)病率和死亡率正逐年增加，已成為危害生命健康的重要疾病之一[1，2]。頭頸部癌癥常發(fā)生于口腔頜面部、咽、喉、鼻腔/鼻竇等部位，其中90%以上組織病理類型為鱗狀細(xì)胞癌。在目前較先進(jìn)的治療標(biāo)準(zhǔn)下，中晚期患者的5 年生存率并沒有得到較大改善，發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者5 年生存率僅30%～40%；發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時，患者5 年生存率不足20%[3，4]。迄今為止，臨床上對頭頸鱗癌患者的診斷、治療和預(yù)后都是以TNM 分期為依據(jù)來制定和判斷，逐步建立有效的個性化評價指標(biāo)和評價體系具有深遠(yuǎn)意義。因此，深入探究頭頸鱗癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及影響預(yù)后的因素，尋找可用于分子診斷及靶向治療的腫瘤標(biāo)記物，是頭頸鱗癌治療中亟待解決的問題。精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5（PRMT5)是PRMT 蛋白家族成員之一，屬于Ⅱ型精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶，可以通過甲基化組蛋白或非組蛋白實(shí)現(xiàn)對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[5]。PRMT5 還可與多種不同的表觀遺傳調(diào)控復(fù)合物結(jié)合，通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)參與細(xì)胞增殖、DNA 復(fù)制、細(xì)胞周期、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程[6-8]。有研究報道[9]，在上皮樣腫瘤中的PRMT5 可以與Snail 結(jié)合，抑制E-cadherin 蛋白表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。PRMT5 高表達(dá)水平直接與腫瘤的進(jìn)程及不良預(yù)后密切相關(guān)[10，11]。PRMT5 的抑制劑GSK591 能夠在體外顯著抑制小鼠細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡[12]。這些研究表明PRMT5可能是潛在的癌基因，但其調(diào)控頭頸鱗癌進(jìn)展的研究國內(nèi)外開展甚少。本研究通過多種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫挖掘PRMT5 在頭頸鱗癌中的表達(dá)情況，探討PRMT5 在頭頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為PRMT5在頭頸鱗癌中的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 UALCAN-TCGA 數(shù)據(jù)庫分析 UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）[13]是一個有效的癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘工具，主要是基于TCGA 數(shù)據(jù)庫的在線分析和挖掘。利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 在頭頸鱗癌中的表達(dá)情況。檢索條件如下：①在Enter gene symbol 輸入PRMT5；②TCGA dataset Select cancer 欄選擇Head and Neck squamous cell carcinoma，點(diǎn)擊Explore；③Links for analysis 選擇Expression。

1.2 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析 GEPIA 數(shù)據(jù)庫是一個高度可視化數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫整合了TCGA 癌癥大數(shù)據(jù)和GTEx 正常組織大數(shù)據(jù)[14]。運(yùn)用該數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 表達(dá)與頭頸鱗癌患者的預(yù)后及分析其與免疫檢查點(diǎn)基因之間的相關(guān)性。檢索條件如下：①在Enter gene name 檢索欄輸入PRMT5，點(diǎn)擊GoPIA! ；②Survival 選擇Survival plots；③Datasets Selection（Cancer name）選擇HNSC。

1.3 HPA 數(shù)據(jù)庫分析 HPA（https://www.proteinatlas.org/）是目前最大、最全面的人類組織細(xì)胞蛋白空間分布數(shù)據(jù)庫。本研究利用HPA 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 蛋白在正常組織和頭頸鱗癌組織中的表達(dá)差異。檢索條件如下：①在檢索欄直接輸入：PRMT5，點(diǎn)擊Search；②PROTEIN EXPRESSION OVERVIEW：Oral mucosa；③選擇合適的正?？谇唤M織細(xì)胞PRMT5 蛋白表達(dá)圖；④點(diǎn)擊PRMT5 欄中的Pathology；⑤PROTEIN EXPRESSION SUMMARY：Head and neck cancer。

1.4 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫分析 利用Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/）[15]分析PRMT5 mRNA 表達(dá)與頭頸鱗癌患者病理特征和總生存期（OS）的關(guān)系。檢索條件如下：①點(diǎn)擊mRNA（RNA-seq）列的Start KM Plotter pan-cancer；②Caner：Head-neck squamous cell carcinoma（n=500）；③Gene symbol：PRMT5；④Split patients by：選擇median；⑤Restrict analysis to subtypes：選擇all。

1.5 TIMER 數(shù)據(jù)庫分析 TIMER（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）是利用RNA-seq 表達(dá)譜數(shù)據(jù)檢測腫瘤組織中免疫細(xì)胞浸潤情況[16]。TIMER 提供（CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）6 種免疫細(xì)胞的浸潤情況。利用TIMER 數(shù)據(jù)庫分析頭頸鱗癌內(nèi)PRMT5 基因表達(dá)和六種免疫細(xì)胞浸潤比例之間的關(guān)系。檢索條件如下：①點(diǎn)擊SCNA，在Cancer Types：選擇HNSC；②Gene symbol：輸入PRMT5，點(diǎn)擊Submit。

1.6 STRING 數(shù)據(jù)庫分析 STRING 11.0（https://string-db.org/）是研究蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫，可進(jìn)行已知蛋白與預(yù)測蛋白之間的相互作用分析，包括直接相互作用和間接相互作用。本研究利用STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 蛋白與其它蛋白的相互作用，檢索條件如下：①數(shù)據(jù)庫中輸入“PRMT5”；②在List Of Name 下方的Orginsim 選擇Homo sapiens；③最后點(diǎn)擊SEARCH 進(jìn)行構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)然后導(dǎo)出tsv 文本文件；④用Cytoscape 3.7.2 打開導(dǎo)出的tsv 文件，用Cytohubba 插件對蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析，并運(yùn)用MCC 算法得到hub 基因。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 24.0 軟件分析PRMT5表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，Spearman 相關(guān)系數(shù)分析GEPIA 數(shù)據(jù)庫中的基因表達(dá)相關(guān)性。采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析生存率，Log-rank 檢驗(yàn)估計生存率的差異。通過TIMER 數(shù)據(jù)庫中的GENE 模塊分析PRMT5 基因與免疫浸潤水平的關(guān)系。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRMT5 在HNSC 癌組織和癌旁組織的差異表達(dá)從GEO 數(shù)據(jù)庫中檢索與頭頸鱗癌相關(guān)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE85195，用于基因表達(dá)的差異分析。以log fold change＞2 和P＜0.05 為篩選閾值，共鑒定出1911 個基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常組織中表達(dá)差異明顯（圖1A），其中PRMT5 呈高表達(dá)。通過UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 在頭頸鱗癌中的mRNA 表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PRMT5 mRNA 在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)高于正常組織（圖1B）。

圖1 PRMT5 在頭頸鱗癌組織及正常組織中的表達(dá)

2.2 PRMT5 表達(dá)量與頭頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 通過UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，TNM 臨床分期中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期頭頸鱗癌患者組織中PRMT5基因表達(dá)水平均高于正常組織（圖2A），Ⅲ期、Ⅳ期頭頸鱗癌患者PRMT5 基因表達(dá)水平高于Ⅰ期頭頸鱗癌組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；PRMT5 高表達(dá)與頭頸鱗癌腫瘤分級相關(guān)（圖2B）。利用KMplotter 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)整合，發(fā)現(xiàn)PRMT5 的表達(dá)水平與性別、等級、AJCC 臨床分期及頭頸鱗癌患者總生存率相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 PRMT5 基因表達(dá)與頭頸腫瘤臨床病理因素的相關(guān)性

圖2 PRMT5 在頭頸鱗癌不同臨床分期和腫瘤分級中的表達(dá)

2.3 PRMT5 基因在頭頸鱗癌中的預(yù)后分析 通過過GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 與頭頸鱗癌患者的預(yù)后，結(jié)果顯示PRMT5 高表達(dá)患者的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）較PRMT5 低表達(dá)患者顯著降低（OS：P=0.0055，HR=1.5；DFS：P=0.041，HR=1.4），見圖3。

圖3 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 對頭頸鱗癌患者總生存期和無病生存期的影響

2.4 PRMT5 表達(dá)與頭頸鱗癌免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系運(yùn)用TIMER 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 表達(dá)與頭頸鱗癌免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性，結(jié)果表明PRMT5 基因表達(dá)與細(xì)胞純度、B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的免疫浸潤水平具有一定相關(guān)性（圖4A），可能參與頭頸鱗癌細(xì)胞的免疫浸潤過程；另外頭頸鱗癌組織與正常組織相比，PRMT5 不同拷貝狀態(tài)對免疫浸潤具有一定影響（圖4B）。

圖4 PRMT5 表達(dá)與頭頸腫瘤免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系

2.5 PRMT5 與免疫檢查點(diǎn)之間相關(guān)性分析 通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 基因表達(dá)與頭頸鱗癌中免疫檢查點(diǎn)基因的相關(guān)性，結(jié)果提示PRMT5 基因與CD276、PD-L1、PVR 和TNFRSF18 等免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)，見圖5。

圖5 頭頸腫瘤中PRMT5 表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)基因的相關(guān)性

2.6 PRMT5 在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)分析 利用HPA 數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 蛋白在正常組織和頭頸鱗癌組織中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示PRMT5 在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)高于正常組織，見圖6。

圖6 PRMT5 在頭頸組織和正常對照組織中的表達(dá)差異

2.7 PRMT5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫分析PRMT5 蛋白與其它蛋白的相互作用，得到可能與PRMT5 相互作用的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果，使用Cytoscape 中的插件Cytohubba 運(yùn)用MCC 算法得到10 個樞紐基因，即CDK6、HIST1H4A、PRMT1、CLNS1A、COPRS、WDR77、SNRPD3、HIST4H4 和HIST2H2AC，見圖7。

圖7 PRMT5 相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

頭頸鱗癌是頭頸部腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一。在過去的幾十年，盡管手術(shù)、放化療等綜合治療手段不斷改善，但是頭頸鱗癌患者的預(yù)后仍然較差，總體生存率維持在40%～60%。頭頸鱗癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移一直是患者死亡的主要原因。雖然病理分級、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素與患者預(yù)后相關(guān)，但這些指標(biāo)尚不足以精確評估頭頸鱗癌患者的預(yù)后。因此，深入研究頭頸鱗癌的發(fā)病機(jī)制、尋找影響其預(yù)后的因素及可用于診斷和治療的分子靶點(diǎn)，對實(shí)現(xiàn)頭頸鱗癌的個體化治療具有重要意義。

PRMT5 是PRMTs 家族中最早被鑒定出來的成員，其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用被研究的最為深入。研究表明[9]，過表達(dá)的PRMT5 可促進(jìn)細(xì)胞增殖和裸鼠體內(nèi)腫瘤的形成。敲除PRMT5 的小鼠在3.5～6.5 d 胚胎致死，表明PRMT5 在胚胎發(fā)育中具有重要作用[17]。此外，敲除PRMT5 囊胚的胚胎干細(xì)胞ES 發(fā)育停滯，且分化基因表達(dá)上調(diào)而多能性基因表達(dá)下調(diào)，提示PRMT5 對維持干細(xì)胞的多能性是必需的[18]。PRMT5 的轉(zhuǎn)錄抑制作用使其在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要的作用，從而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[19,20]。這些研究表明PRMT5 可能是潛在的癌基因，但其調(diào)控頭頸鱗癌進(jìn)展的分子機(jī)制研究較少。本研究通過生物信息學(xué)方法對公共數(shù)據(jù)庫中PRMT5 基因在頭頸鱗癌中的表達(dá)情況進(jìn)行深入挖掘、分析，避免因樣本量、研究方法和人群個體差異導(dǎo)致的結(jié)果異質(zhì)性。通過UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，PRMT5 mRNA 在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)高于正常組織。這與有關(guān)報道[10，11]的研究結(jié)果一致，說明PRMT5 高表達(dá)水平直接與腫瘤的進(jìn)程及不良預(yù)后密切相關(guān)。PRMT5 主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，少量表達(dá)在細(xì)胞核，而對發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞其定位則相反[21]。PRMT5 在多種腫瘤中高表達(dá)使其有望成為頭頸鱗癌及其他癌癥診斷的標(biāo)志物。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TNM 臨床分期中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期頭頸鱗癌患者組織中PRMT5 基因表達(dá)水平均高于正常組織，PRMT5 高表達(dá)與頭頸鱗癌腫瘤分期相關(guān)。利用HPA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，PRMT5 在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)高于正常組織，進(jìn)一步在蛋白水平證明了高表達(dá)PRMT5 與患者的臨床分期相關(guān)。通過Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)PRMT5 高表達(dá)患者的總生存率較PRMT5 低表達(dá)患者降低，提示其表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展其本質(zhì)上是復(fù)雜的，包括異質(zhì)的細(xì)胞成分和腫瘤免疫微環(huán)境。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的不同階段，細(xì)胞-細(xì)胞相互作用（除癌細(xì)胞外，還包括血管和免疫細(xì)胞）以及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用（如周圍基質(zhì)的硬度和組成發(fā)生變化）起著主要作用。本研究利用TIMER 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)PRMT5 基因表達(dá)與細(xì)胞純度、B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的免疫浸潤水平具有一定相關(guān)性，提示PRMT5 有可能參與頭頸鱗癌細(xì)胞的免疫浸潤過程。另外，頭頸鱗癌組織與正常組織相比PRMT5 不同拷貝狀態(tài)對免疫浸潤具有一定影響。進(jìn)一步通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析得出PRMT5 基因與PD-L1、CD276、PVR 和TNFRSF18 等免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)。因此，PRMT5 表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)分析的結(jié)果可以為頭頸鱗癌的免疫治療提供理論依據(jù)和研究新思路。

使用STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步預(yù)測與PRMT5相互作用的蛋白，這些蛋白主要有CDK6、HIST1H4A、PRMT1、CLNS1A、COPRS、SNRPD1、WDR77、SNRPD3、HIST4H4 和HIST2H2AC。其 中CDK6 可 與PRMT5（p53 拮抗劑）的啟動子結(jié)合，通過驅(qū)動細(xì)胞周期進(jìn)程和拮抗應(yīng)激反應(yīng)在p53 和RB 的界面發(fā)揮作用[22]。PRMT5 和PRMT1 相互作用，在聯(lián)合抑制劑治療小細(xì)胞肺癌和胰腺癌細(xì)胞模型中具有協(xié)同作用。此外，PRMT5 可與MEP50/WDR77 復(fù)合物結(jié)合發(fā)揮作用，這種活性通常在癌細(xì)胞中處于激活狀態(tài)，并與肺癌和胰腺癌不良預(yù)后相關(guān)，使PRMT5 成為治療靶點(diǎn)[23]。組蛋白結(jié)合蛋白COPR5 是PRMT5 發(fā)揮核功能所必需的，在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CLNS1A/RIOK1 的比例可作為PRMT5 抑制劑敏感性的標(biāo)志物，PRMT5 敲除干擾了內(nèi)含子（DIs）的去除。這種受損的DI 剪接影響增殖基因，其下調(diào)與細(xì)胞周期阻滯、衰老和/或凋亡相關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)揭示了PRMT5 調(diào)控的雙剪接程序可作為癌癥治療的靶點(diǎn)[24，25]。

綜上所述，PRMT5 在頭頸鱗癌組織中高表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)程及不良預(yù)后密切相關(guān)；同時PRMT5 可能參與頭頸鱗癌細(xì)胞的免疫浸潤過程，并與一些免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)相關(guān)；PRMT5 通過與其他蛋白的相互作用參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期改變和代謝異常調(diào)控等過程，其有望成為頭頸鱗癌的診斷標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)。