基因測序診斷遺傳性高膽紅素血癥的研究進展

李 偉

（天津和平新世紀婦兒醫(yī)院兒內科，天津 300041）

遺傳性高膽紅素血癥（hereditary hyperbilirubinemia）是一類常染色體遺傳病，由于基因缺陷導致膽紅素代謝障礙，從而引起膽紅素增高的臨床綜合征，有家族聚集性。根據膽紅素增高的種類不同，可分為遺傳性高直接膽紅素血癥和遺傳性高間接膽紅素血癥。該類疾病均以黃疸為主要表現，臨床表現及相關化驗室檢查缺乏特異性，故對于嬰幼兒、青少年或是成年人，以間歇性或長期反復出現的黃疸為主要表現，實驗室檢查結果僅提示膽紅素升高，而不伴丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferse，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、谷氨酰胺轉移酶（transglutaminase，GGT）等其他酶學異常，在除溶血性因素及肝膽系統(tǒng)其他疾病后，臨床即可做出初步判斷，根據患者膽紅素增高的種類及程度，進行針對性的基因測序，以提高確診率。本文就遺傳性高直接膽紅素血癥及遺傳性高間接膽紅素血癥概述及各型相關基因突變及治療進展進行綜述，以期為臨床治療提供參考。

1 遺傳性高直接膽紅素血癥概述

遺傳性高直接膽紅素血癥包含2 個亞型，即Dubin-Johnson 綜合征（Dubin-Johnson syndrome，DJS）及Rotor 綜合征（Rotor syndrome，RS）。DJS 由Dubin 和Johnson 于1954 年首次發(fā)現并報道的常染色體隱性遺傳病。DJS 及RS 臨床上以長期或間歇性結合膽紅素升高為主要表現[1]，實驗室檢查缺乏特異性，診斷較為困難。肝組織活檢為二者鑒別診斷的主要依據，DJS 肝穿刺活檢可見肝組織呈黑色、棕褐色或褐墨綠色，肝細胞內可有大量褐色色素沉著。在電鏡下，褐色色素顆粒通常包括3 種成分，分別是沉積有鐵蛋白樣的基質、電子致密體和脂樣小滴。通過超微結構發(fā)現顆粒內含致密核心結構溶酶體，其被認為是DJS 超微結構特征，可與其他高膽紅素血癥相鑒別[2]。RS 肝組織顏色正常，肝細胞內無色素沉著。隨著基因檢測技術的發(fā)展進步，基因測序成為疾病診斷的首選方案。

1.1 ABCC2 基因突變 研究發(fā)現[3]，DJS 患者存在ABCC2 基因突變。該基因位于人類10 號染色體短臂24 區(qū)（10q24），當發(fā)生基因突變時，導致多藥耐藥相關蛋白（MRP2）功能障礙或缺失，使得間接膽紅素在肝細胞內微粒體中形成直接膽紅素后，在肝細胞內轉運和向毛細膽管排泌發(fā)生障礙，造成慢性良性間歇性黃疸。目前已報道DJS 相關的ABCC2 基因突變位點多達68 個，包括錯義突變、無義突變、剪接突變、調節(jié)突變、刪除/缺失突變、插入突變、復雜重排突變等。2018 年，Wu L 等[4]首次報道了我國DJS患者的ABCC2 基因突變模式，該研究對7 例臨床確診患者的所有32 個外顯子和鄰近的剪接區(qū)域都進行了測序，報道的新型突變包括p.G693R、p.G808V、p.E647X、p.G693R 及p.E647X，且突變均為雜合突變，其中1 例出現復合雜合突變（p.G693R/p.G808V），而其他患者只攜帶一種單一突變，肝臟活檢的免疫組化結果證實了新型無義突變p.E647X導致MRP2 膜表達缺失。Corpechot C 等[5]對32 例臨床診斷DJS 的患者進行基因測序研究，其中30 例患者ABCC2 基因存在大量的點突變和拷貝數突變，這些患者中有8 例（27%）表現出短暫的膽汁淤積癥狀，分別為4 例新生兒膽汁淤積、2 例ICP、1 例避孕藥引起的膽汁淤積和1 例散發(fā)性膽汁淤積。故，基因檢測對早期診斷新生兒膽汁淤積等不典型表現的DJS 患者至關重要。

1.2 SLCO1B 基因突變 SLCO1B 基因突變?yōu)镽S 的致病原因，雙等位基因SLCO1B1、SLCO1B3 位于12號染色體上（12q12.1，12q12.2），由于溶質載體有機陰離子載體1B1/3（SLCO1B1/3）雙等位基因突變，導致有機陰離子轉運多肽（OATP1B）功能缺陷，OATP1B1 和OATP1B3 同時缺乏[6]，繼而引起肝細胞分泌功能缺陷和肝內處理膽紅素能力下降，使血清內結合膽紅素和非結合膽紅素均增高。目前，人類基因庫中共收錄了SLCO1B1 突變26 種，以錯義突變和無義突變?yōu)橹?；SLCO1B3 基因突變10 種，均為錯義突變。白潔等[7]通過對SLCO1B1 及SLCO1B3 基因測序進行分析得出，較為常見的突變位點為SLCO1B1 基因的錯義突變 c.1738C ＞T 以及SLCO1B3 基因的IVS13+1G＞A。另有研究發(fā)現[6，8]，在部分RS 患者中有逆轉錄轉座子LINE-1 插入到了SLCO1B 基因中，LINE-1 可調節(jié)基因的表達，使得外顯子發(fā)生倒置或跳躍，從而引起疾病的發(fā)生。這個新的發(fā)現為RS 的發(fā)病機制、診斷及治療都提供了新的方向。

1.3 DJS 及RS 的治療 DJS 患者的主要癥狀為黃疸、高膽紅素血癥，部分患者會伴有膽汁淤積，生化指標可存在ALT、AST、GGT、膽汁酸等異常，但目前導致膽汁淤積癥的機制尚不明確，多數患者無需藥物治療；而當合并膽汁淤積時，可給予熊去氧膽酸等藥物對癥治療[9]。RS 患者肝功能正常，預后良好，一般無需給予特殊治療，病情不會惡化，遠期不會發(fā)展為肝癌或者肝硬化等[10，11]。因此，在臨床工作中，對于反復出現的以直接膽紅素增高為主要表現的黃疸患者，而臨床缺乏其他特異性表現，應積極進行針對性的基因檢測，在明確診斷為DJS 或者RS 后，無需反復的檢查及藥物治療，這為臨床工作者制定規(guī)范的診療提供了幫助，同時為這類疾病的患者減輕了痛苦及經濟負擔。

2 遺傳性高間接膽紅素血癥概述

遺傳性高間接膽紅素血癥，其特點為血清總膽紅素增高，以間接膽紅素增高為主，包括Gilbert 綜合征（Gilbert syndrome，GS）、Crigler-Najjar 綜合征Ⅰ型（Crigler-Najjar syndrome Ⅰ，CNS-Ⅰ）、Crigler-Najjar綜合征Ⅱ型（Crigler-Najjar syndrome Ⅱ，CNS-Ⅱ）。

2.1 UGT1A1 基因突變 研究發(fā)現[12]，GS、CNS-Ⅰ及CNS-Ⅱ均與尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1（UGT1A1）基因突變有關。UGT 酶負責膽紅素的葡萄糖醛酸化過程，使其代謝產物更容易通過尿、膽道排出體外[13]。而當UGT1A1 基因發(fā)生突變時，該酶活性部分或者完全缺失，從而導致間接膽紅素增高。該酶的編碼基因位于人類2 號染色體的長臂37區(qū)（2q37），是由4 個共同外顯子及1 個可變的第一外顯子構成的。梁晨等[14]通過總結共發(fā)現UGT1A1突變位點163 個，突變類型有錯義突變、無義突變、缺失突變及移碼突變等，且患者血清膽紅素水平的高低及復雜的遺傳性狀與UGT1A1 突變位點或互相組合的多態(tài)性相關。GNS 根據其分子和功能特征、臨床表現的嚴重程度、苯巴比妥反應等臨床標準分為兩類，Ⅰ型是最嚴重的，幾乎完全缺乏UGT 酶活性，主要累及中樞神經系統(tǒng)并發(fā)核黃斑，而Ⅱ型相對輕，酶活性水平較低[15]。CNS-Ⅰ患者的致病基因突變位于UGT1A1 2～5 號外顯子，以無義突變、錯義突變?yōu)橹?，此外，部分移碼突變，比如位于1 號外顯子的65delC 以及4 號外顯子的1220delA也可導致CNS-Ⅰ型發(fā)病[16-18]。此型發(fā)病率極低，多在新生兒期起病，表現為UGT 酶活性完全或嚴重缺乏、出現嚴重黃疸，極易導致核黃疸，患兒預后差，多于嬰幼兒期死亡。

GS 及CNS-Ⅱ常見的基因突變位點類似，以點突變?yōu)橹?，尤其是以單堿基替代錯義突變?yōu)橹?，常見的突變位點為1 號外顯子錯義突變c.211G＞A 和5號外顯子c.1456T＞G[13，19]。此種突變類型對酶活性影響較小，因此黃疸相對較輕，預后良好。通過對GS及CNS-Ⅱ表型復合雜合突變基因位點進行分析總結發(fā)現，一條染色體某個區(qū)域突變可能容易與另外一條染色體的某個特定區(qū)域突變位點形成復合雜合突變；同時，GS、CNS 不同疾病表型中外顯子基因突變數目與外顯子長度呈正相關，即隨著外顯子堿基序列數量增多，突變位點數目也會增多，但與疾病的表型無關[14]。Maruo Y 等[12]對日本163 例CNS-Ⅱ或GS 患者的基因型和表型進行分析后發(fā)現，絕大多數患者存在UGT1A1 雙等位基因突變，其中78.5%存在多重突變，典型的CNS-Ⅱ為純合雙錯義突變p.[G71R:Y486D]，并在典型的GS 患者中檢測到4 種基因型，即純合子型UGT1A1*28、UGT1A1*6/UGT1A1*28、純合子型UGT1A1*6 及UGT1A1*27/UGT1A1*28。宋金云等[20]研究報道，GS 患者的UTG1A1 基因突變主要有3 種類型，即啟動子區(qū)域TA 盒中TA 堿基序列插入突變、外顯子區(qū)域單堿基突變以及遠端加強序列苯巴比妥反應增強原件的突變。Chiddarwar AS 等[21]在GS 患者中發(fā)現了7 種不同的序列變異，在7 個變異中UGT1A1 基因存在6個錯義突變和1 個沉默的單核苷酸替換，表明UGT1A1 基因存在不同的變異，特別是H55R 變異對膽紅素水平有顯著影響，可能是高膽紅素血癥的遺傳危險因素。Radoi VE 等[22]對羅馬尼亞897 名受試者進行了研究，包括292 例GS 患者和605 名健康對照者，旨在篩選出在UGT1A1 基因TATA 盒區(qū)存在（TA）插入的患者，結果發(fā)現UGT1A1*28（7TA）等位基因頻率最高，為61.87%；其次是UGT1A1*1（6TA），為36.79%；同時該研究還發(fā)現了UGT1A1基因的另外兩種變異，5TA（0.61%）和8TA（0.72%）；在所有UGT1A1 基因突變陽性患者中，32.33%為TA 7/7 純合型，其中TA 6/7 雜合型占57.64%、野生型（TA）6/6 占7.36%，表明羅馬尼亞人群中UGT1A1*28 多態(tài)性與GS 患者的高膽紅素血癥有很強的相關性。Mi XX 等[23]對我國東南部高膽紅素血癥患者UGT1A1 基因型進行了研究，結果發(fā)現GS患者85%（47/55）存在致病性變異UGT1A1*60，而且在UGT1A1 的啟動子區(qū)域檢測到了UGT1A1*28和UGT1A1*81；同時，在UGT1A1 中均出現多個變異位點，而變異數與膽紅素水平無關。由上述研究分析得出，UGT1A1 基因突變后引起UGT 酶活性發(fā)生改變，而此酶的活性降低的程度受UGT1A1 基因突變發(fā)生的位置、突變類型以及多態(tài)性等多方面的因素共同影響，從而表現出黃疸的嚴重程度不同。

2.2 基因突變類型與疾病相關性 Sun L 等[24]對95例遺傳性高間接膽紅素血癥的患者進行研究，結果共檢測到6 個位點的192 個UGT1A1 突變，其中UGT1A1 中的連鎖多態(tài)性突變A（TA）7TAA 和c.-3279T＞G 與GS 的相關性最強，而編碼區(qū)突變p.G71R 和p.Y486D 與CNS-II 的相關性最強。另外，Moyer AM 等[25]對346 例高膽紅素血癥的兒童患者進行了UGT1A1 基因測序分析，結果發(fā)現新生兒（年齡≤28 d）UGT1A1 變異發(fā)生頻率（31.3%）年齡較大的兒童（1～18 歲）變異發(fā)生率（85.1%）低，并鑒定出了C.337t＞G（p.Y113D）、C.1037c＞A（p.A346E）和C.1469a＞C（p.D490A）3 個新變種，同時在年齡較大兒童中UGT1A1 基因分析證實了79.0%的患兒為GS。梁晨等[14]研究發(fā)現，亞洲地區(qū)報道的UGT1A1基因突變位點在c.211-c.558 有明顯的聚集，其次的高頻突變是UGT1A1*28、UGT1A1*60，其中CNS-Ⅱ型高頻突變位點是c.1456T＞G、c.625C＞T（UGT1A1*8）。通過總結各文獻，結合患者膽紅素水平，建議對有c.211G＞A、UGT1A1*60、UGT1A1*28基因突變的患者，優(yōu)先考慮將GS 作為初步診斷。對有兩個及以上的基因突變位點，尤其其中一個包括c.1456T＞G、c.625C＞T 的患者，可優(yōu)先考慮將CNS-Ⅱ型作為初步診斷。這些基因測序的研究進展，為臨床工作者對該類疾病的診斷提供了重要思路及指導。

2.3 GS、CNS-Ⅰ及CNS-Ⅱ的治療 GS 及CNS-Ⅱ均為良性疾病[26]，預后良好，輕度的膽紅素增高一般無需特殊處理，必要時可給予口服苯巴比妥或光療等對癥治療。而CNS-Ⅰ則多于新生兒期起病，且黃疸嚴重，此類患者對苯巴比妥治療無反應，極易導致核黃疸，如果不及時治療，幾乎都會死于膽紅素腦病，預后差。有研究發(fā)現[27]，在CNS-Ⅰ患者中，膽紅素水平在新生兒時期增加3～6 mg/（dl·d），并在5～14 d 達到神經危險水平。目前，光療仍是該疾病的主要治療方法，但盡管有持續(xù)的光療，CNS-Ⅰ患者隨著年齡的增長，高膽紅素血癥會惡化，而肝移植是當下CNS-Ⅰ唯一的最終治療方法，但也會帶來高昂的費用、內科和外科的發(fā)病率以及免疫抑制的風險。Apgar JF 等[28]研究給患有CNS-Ⅰ的小鼠體內注射脂質納米顆粒包裹的hUGT1A1-modRNA，結果發(fā)現該患病小鼠UGT1A1 基因可以重新表達，其血清膽紅素水平也降至正常水平。另外，Ebrahimi A 等[29]也利用腺病毒等重組病毒的基因轉移載體成功地將UGT1A1 基因轉移到Gunn 大鼠CNS 模型的肝臟中?；趧游锬Ｐ偷那熬埃蛑委煼椒ㄓ型^續(xù)用于人類臨床前研究，甚至成為未來10 年內CNS 的一種現實治療模式。

3 總結

遺傳性高膽紅素血癥是一類常染色體遺傳病，近幾年的研究已經取得了較大的進展，提高了臨床工作者對此類疾病的認識，但是部分疾病的發(fā)病機制尚不明確。此類疾病其臨床表現及相關化驗室檢查均缺乏特異性，在日常的臨床工作中診斷及治療均有困難，基因測序是非常重要的診斷方法。在做好產前咨詢及預防的基礎上，對于新生兒高膽紅素血癥及其高危因素的早期識別及干預尤為重要。對于以間歇性或長期反復出現的黃疸為主要表現，而實驗室檢查無明顯陽性者，結合血清膽紅素增高的種類及水平，盡早進行針對性的基因測序，做到早期診斷，并根據不同病因，給予及時、適當的治療，可減少不必要的治療，給患者及家屬減輕痛苦及經濟負擔。