肺外源性急性呼吸窘迫綜合征關鍵基因的生物信息學分析①

湯娜娜 謝登海 楊國輝（貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院內科ICU，貴陽550004）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是多種原因導致的急性彌漫性炎癥性肺損傷，臨床表現(xiàn)為急性低氧血癥，進行性呼吸窘迫，在呼氣末正壓通氣（positive end expiratory pressure，PEEP）≥5 cm H2O條件下，氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）≤300 mmHg，胸部影像學表現(xiàn)為不能完全用心衰解釋的累及雙肺滲出性病變［1］。自1967年首次提出該臨床綜合征已過50余年，盡管對ARDS發(fā)病機制的認識在不斷深入，治療方法在不斷改進，但ARDS患者住院死亡率仍高達40%以上，嚴重危害著人類健康［2］。根據(jù)致病因素不同，臨床上可將ARDS分為兩類：肺源性ARDS（ARDS induced by pulmonary causes，ARDSp）和 肺 外 源 性ARDS（ARDS induced by extra pulmonary causes，ARDSexp）。ARDSp常見于各種病因所致的肺炎、肺挫傷、胃內容物的誤吸、煙霧吸入等。ARDSexp常見病因有膿毒癥、重癥創(chuàng)傷、急性胰腺炎和大量輸血等。肺外組織器官感染所致的膿毒癥是ARDSexp的臨床常見病因，但肺外膿毒癥并發(fā)ARDSexp的比例并不高，在西方國家發(fā)生率約6%～7%［3-5］。為何僅有部分膿毒癥患者并發(fā)ARDSexp，相關機制尚未明確，也尚無理想的有助于早期診斷的生物學標志物?；颊咭坏┎l(fā)ARDS，病情進展迅速，預后極差，晚期干預措施非常有限。如何能早期識別這類高?；颊撸蔷戎纬晒Φ年P鍵，也仍是目前醫(yī)務工作者們面臨的難題。通過高通量基因測序，對ARDS患者的基因表達和信號通路的研究，有助于ARDS發(fā)病機制的探討和揭示。本研究擬通過生物信息學方法，對GEO數(shù)據(jù)庫中有關膿毒癥誘發(fā)的ARDSexp的基因表達譜芯片進行分析，獲得差異表達基因、生物學過程、信號通路及關鍵基因等重要信息，為探討ARDSexp發(fā)生、發(fā)展中基因的調控機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選后下載KANG ELARIS等［3］2015年提交的基因芯片數(shù)據(jù)GSE66890。該芯片的平臺信息：GPL6244［HuGene-1_0-st］Affymetrix Human Gene 1［transcript（gene）version］（Affymetrix Inc.Santa Clara，California，USA）。芯片共包含57例膿毒癥患者（其中29例并發(fā)ARDS）的全血mRNA標本。血標本在患者被收入ICU 24 h內進行采集，使用相同材料和方法分兩個批次進行處理。本研究選取了其中的23例肺外膿毒癥患者的數(shù)據(jù)為研究對象，以并發(fā)ARDSexp的8例患者作為實驗組（Sepsis+ARDSexp），剩余的15例未并發(fā)ARDS的患者作為對照組（Sepsis Only）進行研究。

1.2 方法

1.2.1 兩組患者臨床特征比較比較兩組患者年齡、性別、檢測批次、血常規(guī)中白細胞計數(shù)等臨床特征有無差異。采用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，兩組比較采用t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)［median］表示，兩組比較采用U檢驗；分類變量用百分比（%）表示。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.2.2 差異表達基因的篩選GEO2R（https：//w ww.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）是基于R編程語言的開源軟件，通過使用來自Bioconductor的GEOquery和limma程序包來分析高通量基因組數(shù)據(jù)，應用t檢驗篩選差異表達基因（differentially expressed gene，DEGs）。篩選條件為差異表達倍數(shù)（FC）≥1.5，即|log2FC|＞0.585且P＜0.05。

1.2.3 差異表達基因的GO富集分析和KEGG通路分析利用DAVID在線分析平臺（https：//david.ncifcrf.gov/）對DEGs進行基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。GO注釋包括分子功能（molecular function，MF），參與的生物學過程（biological process，BP）和細胞組成（cellular component，CC）。對富集的功能及信號通路進行可視化圖形展示。以P＜0.05作為生物信息分析的閾值。

1.2.4 差異表達基因的蛋白互作網(wǎng)絡圖及關鍵基因的篩選通過STRING在線數(shù)據(jù)庫（http：//www.string-db.org/）預測蛋白之間的相互關系。以綜合評分（combination score）＞0.4為閾值條件，將STRING中所得的數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.6.1軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡（protein-protein interaction，PPI）圖，PPI圖是由多個節(jié)點和多條邊組成，每個節(jié)點代表一個蛋白質，每條邊表示蛋白質之間的相互作用。通過Cytoscape中的插件Cytohubba［6］計算關鍵基因。

2 結果

2.1 兩組患者臨床特征比較年齡、性別和標本處理批次差異無統(tǒng)計學意義，兩組一般情況均衡可比。白細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，Sepsis+ARDSexp組所有病例均并發(fā)休克，顯著高于對照組（P=0.007，表1）。

表1 兩組臨床特征比較Tab.1 Clinical characteristics in two groups

2.2 差異表達基因的篩選Sepsis+ARDSexp組和對照組一共篩選出288個DEGs，其中上調基因128個，下調基因160個。DEGs火山圖見圖1，紅點表示上調的DEGs，藍點表示下調的DEGs。表2和表3分別列出了Sepsis+ARDSexp組與對照組比較，差異表達顯著上調和下調前10位的基因。

表2 上調的差異表達基因（前10位）Tab.2 Up-regulated DEGs（TOP 10）

表3 下調的差異表達基因（前10位）Tab.3 Down-regulated DEGs（Top 10）

圖1 差異表達基因火山圖Fig.1 Volcano map of DEGs

2.3 差異表達基因的GO和KEGG通路富集分析利用DAVID在線數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，DEGs主要富集炎癥反應、細胞防御、平滑肌細胞增殖、IL-1分泌和細胞免疫反應等生物學過程（圖2A）。細胞組成主要富集于外泌體、細胞膜和細胞漿等（圖2B）。分子功能主要富集碳水化合物結合、蛋白同源二聚體活化、受體激活和蛋白結合等功能（圖2C）。而KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，這些DEGs主要富集于吞噬體、cGMP-PKG信號通路、造血、味覺傳導和內質網(wǎng)蛋白加工等相關信號通路（圖2D）。

圖2 差異表達基因GO和KEGG通路富集分析Fig.2 GO and KEGG pathway enrichment analysis of DEGs

2.4 差異表達基因的蛋白互做分析及關鍵基因篩選將288個DEGs導入STRING在線數(shù)據(jù)庫，以綜合評分＞0.4為有效篩選標準，將數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.6.1軟件，構建由161個節(jié)點和296條邊組成的PPI網(wǎng)絡圖（圖3）。通過Cytohubba插件中的MCC計算法篩選出前8位關鍵基因：CCR2、CXCR2、TAS2R20、TAS2R39、TAS2R40、S1PR1、HCAR2和HCAR3（表4）。

表4 關鍵基因篩選結果Tab.4 Result of hub genes screening

圖3 PPI圖Fig.3 Protein-protein interaction network

3 討論

近年來，隨著生物信息學的發(fā)展和各種高通量技術的興起，大量基因芯片表達譜數(shù)據(jù)及全基因組測序技術被廣泛應用，通過生物信息學分析技術，可以找出疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起關鍵作用的基因，有助于揭示疾病的發(fā)病機制，為尋找疾病新的治療方法和預后的監(jiān)測提供新的方向［7］。本文通過在GEO下載基因芯片數(shù)據(jù)集GSE66890，將膿毒癥并發(fā)的ARDSexp患者全血標本和肺外膿毒癥對照患者全血標本的芯片數(shù)據(jù)對比，共篩選出288個DEGs，其中上調基因128個，下調基因160個。GO分析顯示，DEGs主要富集炎癥反應、細胞防御和免疫反應等生物學過程。KEGG分析顯示主要富集于吞噬體、cGMP-PKG信號通路、造血、味覺傳導和內質網(wǎng)蛋白加工相關信號通路。通過蛋白互做分析，篩選出8個關鍵基因，其中S1PR1表達水平上調，其余7種基因水平下調。

趨化因子是能使細胞發(fā)生趨化運動的小分子細胞因子。根據(jù)其N端半胱氨酸的位置分為四大類：CC、CXC、C和CX3C，相應的受體分別為CCR、CXCR、CR和CX3CR。趨化因子與其受體相互作用能誘導靶細胞趨化性遷移，增強靶細胞與內皮細胞的黏附能力等，廣泛參與多種生理病理過程。CCR2、CXCR2與配體結合后，在感染部位募集中性粒細胞，誘導中性粒細胞氧化爆發(fā)和顆粒釋放，減輕炎癥反應，增加細菌清除，從而在炎癥介導過程的發(fā)揮重要作用。CXCR2的異常調控已涉及腫瘤和多種炎癥介導疾?。?-9］。肺部的炎癥反應是ARDS發(fā)生、發(fā)展的重要原因，中性粒細胞大量聚集在肺微血管、間質和肺泡腔內是ARDS的重要特征，趨化因子在介導中性粒細胞進入肺部中發(fā)揮主要作用。通過對臨床ARDS患者的樣本和ARDS動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，調節(jié)肺中性粒細胞遷移的趨化因子網(wǎng)絡可能涉及多個趨化因子配體及受體家族［10-11］。有研究報道分析ARDS患者血液和肺泡灌洗液分離的中性粒細胞CXCR2的表達無顯著性差異，但血液中的中性粒細胞CCR2的表達水平明顯低于肺泡灌洗液［12］。本文分析發(fā)現(xiàn)與對照組相比，ARDSexp患者全血中CCR2和CXCR表達均下降，但還需進一步實驗來驗證。

苦味受體（bitter taste receptor，TAS2R）是與人體感受苦味物質密切相關的一類G蛋白偶聯(lián)受體，TAS2R不僅存在于舌的味蕾中，在其他組織也表達并發(fā)揮功能。2010年DEEPAK等［13］首次發(fā)現(xiàn)，在人類氣道平滑肌上存在TAS2R。近年研究發(fā)現(xiàn)，TAS2R激動劑可促進氣道平滑肌松弛和支氣管擴張，抑制絲裂原誘導的生長［14］。TAS2R激動劑如氯喹和苯甲地那銨可以抑制TNF-α，IL-13和MCP-1的釋放，氯喹還可以呈劑量依賴性抑制IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-10等炎癥因子的產(chǎn)生，從而抑制氣道炎癥反應，提示TAS2R激動劑可作為一種新型有效的藥物用于支氣管哮喘、COPD等慢性炎癥性疾病治療［15-16］。2020年全球新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情暴發(fā)，我國學者通過大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)TAS2R激動劑可通過TAS2R增強機體防御能力，抑制過度免疫炎癥反應，可能對治療COVID-19有效［17］。TAS2R是否也在ARDS等呼吸道急性炎癥性疾病中發(fā)揮作用尚未見研究報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)TAS2R在ARDSexp患者全血中差異表達并可能作為關鍵基因影響ARDSexp的發(fā)生發(fā)展。

磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）是一種具有生物活性的鞘氨醇代謝產(chǎn)物，通過與細胞表面的1-磷酸鞘氨醇受體（sphingosine-1-phosphate receptor，S1PR）作用而發(fā)揮其廣泛的生物學效應。S1PR屬于G蛋白偶聯(lián)受體，目前S1PR已成為炎癥、腫瘤、動脈粥樣硬化、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病的研究熱點之一。有研究報道，S1PR激動劑可抑制樹突狀細胞的活化和T細胞的增殖，顯著降低細胞因子/趨化因子的產(chǎn)生，抑制細胞因子風暴，可抑制甲型H1N1流感病毒誘發(fā)的急性肺損傷［18］。S1P-S1PR信號通路通過抑制炎癥反應、維持血管屏障功能有望成為ARDS新的治療方法［19-20］。

羥基羧酸（hydroxy-carboxylic acids，HCA）包括乳酸、酮體3-羥基丁酸以及β-氧化中間體3-羥基辛酸。HCA既是能量代謝的中間產(chǎn)物也是一種信號分子，通過激活羥基羧酸受體（hydroxy-carboxylic acid HCA receptor，HCAR）參與機體代謝、免疫等功能調節(jié)［21］。HCAR也是G蛋白偶聯(lián)受體，其家族由3個成員組成，分別為HCAR1、HCAR2和HCAR3。HCAR2和HCAR3在人體內表達廣泛，近期研究發(fā)現(xiàn)HCAR2激動劑富馬酸單乙酯前體DMF，可降低中性粒細胞對內皮細胞黏附性和趨化性，對治療銀屑病、多發(fā)性硬化癥有積極作用［22］。HCAR在ARDS發(fā)病中是否也具有抗炎和免疫調節(jié)等功能，目前尚未見相關研究報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)HCAR2和HCAR3在ARDSexp患者全血中表達下調且均為關鍵基因。

綜上所述，本文通過對GEO中ARDSexp相關的基因芯片進行生物信息學分析，篩選出206個差異表達基因和并從中獲得8個關鍵基因。其中TAS2R20、TAS2R39、TAS2R40、HCAR2和HCAR3關鍵基因是首次發(fā)現(xiàn)在ARDSexp患者全血中差異表達。通過文獻挖掘，推測這些關鍵基因可能通過影響全身和肺局部炎癥反應、免疫應答及血管屏障等功能在ARDSexp的發(fā)病機制中起重要作用，可為ARDSexp的早期臨床診斷和個體化治療提供潛在靶點。由于本研究是基于數(shù)據(jù)庫中相關基因芯片數(shù)據(jù)的生物信息學分析，存在病例少，相關臨床資料提供不全等缺陷，故上述關鍵基因在ARDSexp患者中的表達和具體作用還需要后續(xù)的臨床和基礎研究來進一步證實。