殺傷細胞免疫球蛋白樣受體和人白細胞抗原C基因型特定前葡萄膜炎的關系

王玉青 劉云霞 任桂芳②（濱州市中心血站，濱州256613）

葡萄膜炎是虹膜、睫狀體、脈絡膜及鄰近眼部結構的炎癥。它是獲得性失明的主要原因之一［1］。急性前葡萄膜炎（acute anterior uveitis，AAU）占所有葡萄膜炎病例的85%［2-3］。HLA-B27抗原陽性相關急性前葡萄膜炎（HLA-B27 antigen-positive associated with acute anterior uveitis，B27AAU）和特發(fā)性急性前葡萄膜炎（idiopathic acute anterior uveitis，IAAU）是AAU最常見的臨床病例［4］。臨床上對葡萄膜炎的藥物治療多使用免疫抑制劑，如糖皮質激素、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素、甲氨蝶呤、秋水仙堿等。B27AAU和IAAU致病的免疫抑制機制尚不清楚。

自然殺傷（natural killer，NK）細胞作為一種對靶細胞能夠直接進行殺傷的淋巴細胞，在細胞免疫方面發(fā)揮重要作用。殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（killer cell immunoglobulin-like receptors，KIRs）是一種主要表達在NK細胞和部分T細胞表面的受體。KIR基因編碼的跨膜蛋白屬免疫球蛋白超家族，共有16個成員：8個抑制型，6個激活型和2個假基因。KIR與其配體的結合調控NK細胞和部分T細胞的活性進而發(fā)揮其重要的免疫功能［5-6］。雖然大多數(shù)KIR的配體并不知曉，目前其配體鑒定最多是人類白細胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）C基因。HLA-C基因具有豐富的多態(tài)性，依據(jù)其第80位氨基酸的差異把HLA-C基因分成2大組：HLA-C1組是攜帶精氨酸，HLA-C2組攜帶賴氨酸。已有報道HLAC1可分別和KIR2DL2、2DL3、2DS2結合，HLA-C2可分別和KIR2DL1、2DS1結合來影響NK細胞的活性［7］。

近年來隨著對KIR和HLA-C基因研究的不斷深入，不同的眼部疾病和炎癥性疾病都與KIR和HLAC基因多態(tài)性有關，如Vogt-Koyanagi-Harada（VKH）、重度干眼癥（dry eye disease,DED）、原發(fā)性Sj?gren綜合征（primary Sj?gren syndrome，SS）以及年齡相關黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）［8-11］等。但迄今未見KIR、HLA-C基因與B27A AU、IAAU關聯(lián)性的研究報道。本文采用序列特異性引物聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction sequence-specific primer，PCR-SSP）方法就KIR和HLA-C基因型與B27AAU和IAAU的關聯(lián)性研究報道如下，以為B27AAU和IAAU發(fā)生的免疫學機制奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 資料選取遺傳上不相關的確診為AAU的患者196例以及210例健康者為對照組?；颊邅碜詽鲜械谒娜嗣襻t(yī)院眼科。通過視力、裂隙燈顯微鏡檢查、后段瞳孔擴大檢查、x線評價、HLA-B27分型及臨床表現(xiàn)確診。根據(jù)葡萄膜炎命名標準化（SUN）工作組的建議，對葡萄膜炎進行了定義和解剖學分類［12］。術語“急性”用于描述以突發(fā)性和有限時間（＜3個月）為特征的特定葡萄膜炎綜合征的病程。本研究將AAU患者分為B27AAU組和IAAU組。根據(jù)與AAU相關的HLA-B27基因分型，對B27AAU進行診斷。IAAU的診斷依據(jù)眼科檢查，前房細胞有無閃光，無玻璃體細胞，虹膜炎、虹膜睫狀體炎、前睫狀體炎，無感染性病因。排除基因分型HLA-B27的AAU之外的患者被定義為IAAU組患者。所有患者均無關節(jié)炎、口腔或生殖器潰瘍病史，并由風濕病學家根據(jù)相應標準排除了AS、ReA、SpA和Beh?et?。˙D）的診斷。有眼部手術史、眼外傷、除葡萄膜炎外的、主要全身疾?。òㄌ悄虿　⒛I功能衰竭、肝病、血液學和動脈硬化/心血管疾?。┑幕颊吲懦谕?。196例AAU患者中，男性117例，女性79例，年齡33～51歲，平均年齡43歲。同時從本院健康體檢中心抽取210名健康者作為對照組。該組由124名男性和86名女性組成，年齡30～55歲，平均年齡為41歲。研究對象均為山東地區(qū)漢族。每個參與者須知情同意，并經濟南市第四人民醫(yī)院委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取EZ Bead system-32 DNA提取工作站（Texas BioGene Inc.）提取血液基因組DNA，嚴格按照說明書操作。

1.2.2KIR基因檢測采用PCR-SSP法對患者和健康者的16個KIR基因進行分型。KIR基因PCR特異性引物序列見表1。（由上海博尚生物技術有限公司合成）。PCR反應體系10μl：包括20 ng的受檢基因組DNA、0.2 mmol/L的dNTP、0.5 U的Taq DNA聚合酶（購自Promega）、0.4 μmol/L的引物（除了KIR2DS1的引物為0.8μmol/L外）和1×PCR反應緩沖液。PCR反應參數(shù)94℃，4 min；94℃，30 s，65℃，30 s，72℃，90 s，30個循環(huán)；72℃，10 min。部分KIR基因PCR擴增的退火溫度略有變化：KIR2DS2（63℃）、KIR2DS3（63℃）、KIR2DS4（61℃）和KIR2DS5（63℃）。PCR產物用1～2%瓊脂糖凝膠電泳檢查，SYNGENE生物圖像分析儀進行結果分析。

表1 KIR基因的序列特異性PCR引物Tab.1 Sequence specific PCR primers of KIR genes

1.2.3HLA-C基因型檢測采用PCR-SSP法對患者和健康者的HLA-C基因進行分型。HLA-C基因PCR特異性引物序列為C1/C2正向引物:5'-CCGGGGAGCCGCGCA-3',C1反向引物:5'-GCGCAGGTTCCGCAGGC-3',C2反向引物:5'-CGCGCAGTTTCCGCAGGT-3'。PCR反應體系同1.2.2。PCR反應的陽性內對照為生長因子基因（growth hormone gene，GH）。PCR反應參數(shù)94℃，120 s；94℃，25 s，70℃，45 s，72℃，30 s，5個循環(huán)；94℃，25 s，65℃，45 s，72℃，30 s，21個循環(huán)；94℃，25 s，55℃，60 s，72℃，120 s，5個循環(huán)；72℃，5 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查，SYNGENE生物圖像分析儀進行結果分析。

1.3 統(tǒng)計學分析HLA-C和KIR基因的表型頻率（phenotypic frequency，PF）通過直接計數(shù)測得。用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行χ2相關分析，Hardy-Weinberg法則證實樣本代表性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。比值比（odds ratio，OR）分析關聯(lián)強度，用Woolf公式計算（OR=ad/bc），同時計算95%可信區(qū)間（95%confidence interval，95%CI）。

2 結果

2.1KIR基因在患者組和健康對照組中的分布在196例AAU患者中，KIR基因的分布沒有偏離Hardy-Weinberg平衡（P=0.28）。與對照組相比，B27AAU患者激活KIR2DS2的頻率增加（P=0.022，OR=1.77，95%CI=1.08～2.90），然而，在Bonferroni校正后，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.067，表2）。與對照組相比，IAAU患者組抑制性KIR2DL2的頻率顯著增加（P=0.009，OR=2.25，95%CI=1.31～3.85），而抑制性KIR2DL3的頻率顯著降低（P=0.000，OR=0.03，95%CI=0.00～0.24）。其他KIR基因和基因型在B27AAU、IAAU和對照組之間的分布差異無統(tǒng)計學意義。

表2 AAU患者和對照組KIR基因頻率分布［例（%）］Tab.2 Distributions of KIR gene frequencies in AAU patient and control groups［n（%）］

2.2HLA-C基因在患者組和健康對照組中的分布與對照組相比，B27AAU患者的HLA-C1C1基因型頻率顯著降低（P=0.034，OR=0.55，95%CI=0.35～0.88，表3）。IAAU患者組HLA-C1C2基因型頻率較對 照 組 增 加（P=0.043，OR=1.97，95%CI=1.01～3.82），但經Bonferroni校正后，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.128）。與對照組相比，B27AAU組HLA-C1等位基因頻率顯著降低（P=0.009，OR=0.60，95%CI=0.42～0.84），而HLA-C2等位基因頻率顯著增加（P=0.009，OR=1.68，95%CI=1.19～2.37）。其他HLA-C等位基因和基因型在B27AAU、IAAU和對照組之間的分布無統(tǒng)計學意義（表3）。

表3 AAU患者和對照組HLA-C等位基因頻率分析［例（%）］Tab.3 Distributions of HLA-C allele groups′frequencies in AAU patient and control groups［n（%）］

2.3HLA-C基因和其KIR基因受體在患者組和健康對照組中的分布由于目前鑒定KIR的配體最多的是HLA-C分子，因此分析了HLA-C和KIR基因即受體和配體組合的基因型頻率在B27AAU和IAAU患者組與對照組中的分布（表4）。HLA-C1等位基因與其已知的KIR配體KIR2DS2與B27AAU的相關性（P=0.019，OR=1.90，95%CI=1.10～3.29），但Bonferroni校正后差異無統(tǒng)計學意義（P=0.058）。與對照組相比，B27AAU患者的KIR2DL1/HLA-C2基因型頻率顯著增加（P=0.044，OR=1.78，95%CI=1.12～2.83）。HLA-C1等位基因和KIR2DL2、KIR2DL3與IAAU顯著相關（P=0.044，OR=2.05，95%CI=1.14～3.66，P=0.001，OR=0.36，95%CI=0.20～0.62）。其他HLA-C和KIR基因型的表型頻率在B27AAU、IAAU和對照組之間的分布無統(tǒng)計學意義（表4）。

表4 AAU患者和對照組HLA-C和KIR基因配對基因型頻率分布［例（%）］Tab.4 Distributions of HLA-C and KIR gene paired genotype frequencies in AAU patient and control groups［n（%）］

3 討論

KIR和其相應配體對NK細胞在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用［13-16］。然而，KIR和HLA基因在B27AAU和IAAU發(fā)病機制中的作用尚不清楚。本研究是首次報道B27 AAU、IAAU與KIR、HLA-C基因之間的關聯(lián)。

在本研究中，KIR基因和HLA-C等位基因在B27AAU、IAAU和對照組中分布的頻率不同，對照組中KIR基因和HLA-C等位基因的分布與中國漢族人群中的分布相似［9，17］。IAAU組與對照組相比，KIR2DL3和KIR2DL3/HLA-C1的頻率顯著降低，提示KIR2DL3和KIR2DL3/HLA-C1對IAAU有保護作用。KIR2DL3/HLA-C1比其他HLA-C抑制NK細胞的信號較弱，并且可能具有較低的激活閾值［18］。KHAKOO等［19］報道，KIR2DL3/HLA-C1基因型增加了早期丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）感染的清除率，減弱其抑制功能。與對照組相比，IAAU組的KIR2DL2和KIR2DL2/HLA-C1的頻率顯著增加，提 示KIR2DL2和KIR2DL2/HLA-C1對IAAU敏感。LEVINSON等［20］人報道KIR2DL2/HLA-C1結合增加Birdshot脈絡膜視網膜病變的風險。先前的研究表明，KIR2DL2似乎可以抵消KIR2DL3/HLA-C1的清除HCV的保護作用［19］。結果與KIR2DL2/HLA-C1和KIR2DL3/HLA-C1在IAAU組的分布相似。

B27AAU患者的HLA-C1C1基因型 和HLA-C1等位基因頻率分別低于對照組，這提示HLA-C1在B27AAU中起保護作用。然而，患者的HLA-C2等位基因頻率高于對照組，提示HLA-C2在B27AAU的發(fā)病機制中起著不利的作用。此研究結果與前人報道相似：BD患者的HLA-C1頻率顯著低于健康對照組，而HLA-C2的頻率顯著高于健康對照組［15］。結果提示，HLA-C1對B27AAU和BD具有保護作用，而HLA-C2與兩種眼病的易感風險相關。

KIRs及其配體的結合分析提示KIR2DL1/HLAC2組合與B27AAU呈正相關，HLA-C2與抑制性配體結合時對B27AAU有易感性是由于HLA-C2的易感性。先前的研究表明，B27AAU患者與對照的高加索白人之間KIR2DL1/HLA-C2組合頻率差異無統(tǒng)計學意義［21］。結果的不同可能是由于人群的差異造成的。同時也提示KIR與HLA的相互作用與不同的遺傳背景有關。

綜上所述，本研究分析了KIR基因和HLA-C配體與中國漢族AAU病例的關系，提示KIR和HLA-C基因可以作為1個標記物，為有效治療疾病提供個性化方案。HLA-C配體與受體結合可能誘導NK細胞活化和抑制AAU進展。KIR受體及其HLA配體的基因分型、表達和功能，以及這些配體和受體在疾病發(fā)病中的作用有待進一步研究。