miR-877-3p對(duì)骨質(zhì)疏松癥小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響

童 徐，舒林徑

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科，重慶 401147；2.口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401147；3.重慶市高校市級(jí)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401147；4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植科，重慶 401147

骨質(zhì)疏松癥是以骨質(zhì)喪失及骨破壞為特點(diǎn)的一類(lèi)全身性疾病，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。該疾病與雌激素缺乏相關(guān)，尤其以絕經(jīng)后女性高發(fā)［1］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是存在骨髓中的多潛能干細(xì)胞，其能夠分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞等［2-4］。因此，BMSCs在維持骨平衡穩(wěn)態(tài)、維護(hù)骨健康中發(fā)揮重要作用［5］。BMSCs生物學(xué)特性的改變會(huì)打破骨平衡穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生［6］。然而，其具體機(jī)制仍不明確。微小RNA（microRNA，miRNA）能夠調(diào)控多種細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，受到研究人員的關(guān)注［7-9］。細(xì)胞內(nèi)miRNA表達(dá)的變化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)特性的改變，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。研究［10］發(fā)現(xiàn)，miR-877-3p能夠促進(jìn)細(xì)胞的分化；但尚無(wú)研究指出miR-877-3p能夠調(diào)控BMSCs的增殖能力。本實(shí)驗(yàn)旨在研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，雌激素的減少是否影響miR-877-3p的變化，并調(diào)控BMSCs的增殖能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 8周健康雌性WT C57BL/6J小鼠，購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（渝）2018-0003，使用許可證號(hào)為SYXK（渝）2018-0003。將小鼠在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由飲水及采食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［2020年倫審（067）號(hào)］。

1.1.2 主要試劑及設(shè)備 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（天杭生物，中國(guó)）；α-MEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；實(shí)時(shí)熒光PCR（real-time PCR）試劑盒、RNA提取試劑盒（TaKaRa，日本）；茜素紅、胰蛋白酶（Sigma，美國(guó)）；CKK-8試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）；成脂誘導(dǎo)試劑、成骨誘導(dǎo)試劑（百恩維，中國(guó)）；siPORTTM轉(zhuǎn)染劑（Ambion，美國(guó)）；miR-877-3p凍干粉（銳博，中國(guó)）；micro-CT檢測(cè)儀（西門(mén)子，德國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 骨質(zhì)疏松模型及假手術(shù)模型建立 手術(shù)在10 g/L戊巴比妥鈉麻醉下進(jìn)行。將40只小鼠隨機(jī)分為卵巢摘除術(shù)后骨質(zhì)疏松癥組（OVX組，n=20）和假手術(shù)組（Sham組，n=20）。OVX組小鼠切除雙側(cè)卵巢，Sham組切除卵巢附近部分脂肪，分層縫合肌肉和皮膚層。

1.2.2 血清雌激素水平及骨參數(shù)檢測(cè) 術(shù)后8周，小鼠頭部及眶周消毒后眼球取血，離心取血清，用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定血清雌激素水平。術(shù)后2個(gè)月，脫頸處死2組小鼠，多聚甲醛固定小鼠股骨48 h；micro-CT掃描檢測(cè)2組小鼠骨參數(shù)，包括骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume fraction，BVF）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）及骨密度（bone mineral density，BMD）。

1.2.3 BMSCs培養(yǎng)及表型鑒定 取Sham組及OVX組小鼠股骨，在超凈臺(tái)內(nèi)冰袋上去盡肌肉與筋膜，剪刀剪去股骨兩端。注射器插入髓腔，將骨髓沖出，剪碎吹均成單細(xì)胞懸液，加入含F(xiàn)BS的α-MEM培養(yǎng)液，于37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取狀態(tài)較好的P3代BMSCs消化，用含3%FBS的PBS清洗后重懸，分別加入Sca-1、CD90、CD45、CD34抗體，4℃避光1 h，離心，棄上清液，用含3%FBS的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）清洗，重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原表達(dá)率。

1.2.4 BMSCs成骨誘導(dǎo)及觀(guān)察

（1）茜素紅染色觀(guān)察 取P3代細(xì)胞，按照2×105個(gè)/孔密度接種于6孔板中，隨后加入成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，每3 d換液。培養(yǎng)21 d后，PBS清洗，多聚甲醛固定，PBS輕輕沖洗，去除多聚甲醛。茜素紅染液染色，顯微鏡下拍照觀(guān)察，利用分光光度儀檢測(cè)吸光度［D（520 nm）］。

（2）堿 性 磷 酸 酶（alkaline phosphatase，ALP）染色 取P3代細(xì)胞，按照2×105個(gè)/孔密度接種于6孔板中，隨后加入成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，每3 d換液，培養(yǎng)7 d。PBS清洗，多聚甲醛固定，依照ALP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行ALP染色，拍照觀(guān)察，檢測(cè)吸光度［D（520 nm）］。

1.2.5 BMSCs成脂誘導(dǎo)及觀(guān)察 取P3代細(xì)胞，按照2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，加入成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)，每3 d換液。培養(yǎng)14 d后，PBS清洗，多聚甲醛固定，再用PBS輕輕沖洗，去除多聚甲醛。油紅O染色，顯微鏡下拍照觀(guān)察，利用分光光度儀檢測(cè)吸光度［D（520 nm）］。

1.2.6PPARγ2和Runx2基因檢測(cè) 將OVX組和Sham組P3代BMSCs進(jìn)行成脂基因PPARγ2與成骨基因Runx2檢測(cè)。提取2組細(xì)胞RNA，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及合成cDNA，real-time PCR檢測(cè)。PPARγ2上游引物為5′-GGGTCAGCTCTTGTGAATGG-3′，下游引物為5′-CTGATGCACTGCCTATGAGC-3′；Runx2上游引物為5′-TTCTCCAACCCACGAATGCAC-3′，下游引物為5′-CAGGTACGTGTGGTAGTGAGT-3′；Gapdh上游引物為5′-GACTTCAACAGCAACTCCCAC-3′，下游引物為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.2.7 BMSCs增殖能力檢測(cè)

（1）CCK-8法 將P3代BMSCs按照4×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，連續(xù)7 d每日定時(shí)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。每孔滴入10μL CCK-8液，置于37℃培養(yǎng)箱中2 h，取出后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)機(jī)測(cè)量吸光度［D（490 nm）］。

（2）細(xì)胞計(jì)數(shù)法 將P3代BMSCs按照4×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，連續(xù)7 d每日定時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.8 miR-877-3p表達(dá)檢測(cè) 收集OVX組和Sham組P3代BMSCs，PBS清洗，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。miR-877-3p上游引物為5′-UGUCCUCUUCUCCCUCCUCCCA-3′，下游引物為5′-UGGGAGGAGGGAGAAGAGGACA-3′；內(nèi)參U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。具體反應(yīng)條件及體系參照產(chǎn)品說(shuō)明。

1.2.9 miR-877-3p轉(zhuǎn)染及BMSCs增殖能力檢測(cè) 取P3代BMSCs，以4×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，待BMSCs貼壁，按照miRNA轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)將miR-877-3p mimics（miR-877-3p過(guò)表達(dá)組）、miR-877-3p inhibitor（miR-877-3p抑制組）、空白對(duì)照試劑control（對(duì)照組）進(jìn)行BMSCs轉(zhuǎn)染。步驟如下：用50μL不含血清的培養(yǎng)基稀釋1μL轉(zhuǎn)染試劑siPORTTM，輕輕混勻并室溫孵育5 min；用50μL不含血清培養(yǎng)基分別稀釋0.5μL（20μmol） 的miR-877-3p mimics、miR-877-3p inhibitor、control存儲(chǔ)液，輕輕混勻，室溫孵育5 min；將稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑siPORTTM與稀釋后的miR-877-3p mimics、inhibitor、control輕輕混勻，靜置后分別加入含有BMSCs的96孔板，置于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別采用CCK-8法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)BMSCs的增殖能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料用x±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs鑒定

細(xì)胞表面抗原流式檢測(cè)結(jié)果顯示，間充質(zhì)來(lái)源干細(xì)胞表面標(biāo)志物Sca-1和CD90表達(dá)率分別為88.4%和90.3%，而非間充質(zhì)來(lái)源干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45和CD34的表達(dá)率分別為4.9%和0.3%（圖1）。

圖1 BMSCs流式細(xì)胞鑒定Fig 1 Flow cytometry analysis of BMSCs

2.2 血清雌激素水平的比較

術(shù)后8周，Sham組血清雌激素水平為（32.49±3.17）pg/mL，顯著高于OVX組的（8.89±1.13）pg/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）。

2.3 骨參數(shù)的比較

術(shù)后2個(gè)月，micro-CT骨參數(shù)檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，Sham組BVF、Tb.N、BMD均明顯高于OVX組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。

圖2 2組小鼠股骨micro-CT影像學(xué)表現(xiàn)及骨參數(shù)比較Fig 2 Comparison of micro-CT imaging features of femurs and boneparameters between thetwo groups

2.4 BMSCs成骨分化及成脂分化鑒定

BMSCs經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)7 d后，ALP染色（圖3A）及定量檢測(cè)（圖3B）結(jié)果顯示，OVX組ALP活性低于Sham組（P=0.004）。BMSCs經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)21 d后，經(jīng)茜素紅染色，顯微鏡下可見(jiàn)橘紅色鈣鹽沉淀，Sham組橘紅色鈣化結(jié)節(jié)多于OVX組（圖3C）；定量檢測(cè)結(jié)果（圖3D）顯示Sham組吸光度明顯高于OVX組（P=0.005）。

圖3 2組BMSCs成骨能力比較Fig 3 Comparison of osteogenic ability of BMSCs between thetwo groups

BMSCs成脂誘導(dǎo)14 d后，經(jīng)油紅O染色，顯微鏡下可見(jiàn)成串脂滴（圖4A）。定量檢測(cè)結(jié)果（圖4B）顯示，OVX組吸光度明顯高于Sham組（P=0.042）。

圖4 2組BMSCs成脂能力比較Fig 4 Comparison of adipogenic ability of BMSCsbetween the two groups

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，OVX組BMSCs成骨基因Runx2的相對(duì)表達(dá)量低于Sham組，OVX組BMSCs成脂基因PPARγ2的相對(duì)表達(dá)量高于Sham組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。

圖5 2組小鼠BMSCs Runx2 and PPARγ2表達(dá)量比較Fig 5 Comparison of expression levels of Runx2 and PPARγ2 in BMSCs between thetwo groups

2.5 2組BMSCs增殖能力比較

連續(xù)7 d采用CCK-8法檢測(cè)2組BMSCs的增殖能力，結(jié)果（圖6A）顯示，Sham組BMSCs與OVX組BMSCs增殖能力從第4日開(kāi)始逐步顯現(xiàn)差異，Sham組BMSCs的增殖能力顯著高于OVX組（均P<0.05）。同樣，連續(xù)7 d細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果（圖6B）顯示，Sham組BMSCs的增殖能力也是從第4日開(kāi)始，顯著高于OVX組（均P<0.05）。

圖6 2組BMSCs增殖能力比較Fig 6 Comparison of proliferation ability of BMSCsbetween thetwo groups

2.6 2組miR-877-3p表達(dá)量的比較

Real-time PCR檢測(cè)OVX組和Sham組BMSCs miR-877-3p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示OVX組BMSCsmiR-877-3p相對(duì)表達(dá)量（0.23±0.04）明顯高于Sham組（0.06±0.02），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018）。

2.7 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

將BMSCs轉(zhuǎn)染miR-877-3p mimics后，miR-877-3p的相對(duì)表達(dá)量顯著上升；轉(zhuǎn)染miR-877-3p inhibitor后，miR-877-3p的表達(dá)顯著下降。該結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)染有效（圖7）。

圖7 轉(zhuǎn)染后BMSCs中miR-877-3p的相對(duì)表達(dá)量Fig 7 Expression of miR-877-3p in BMSCsafter transfection

2.8 轉(zhuǎn)染miR-877-3p后BMSCs增殖能力變化

轉(zhuǎn)染miR-877-3p后通過(guò)CCK-8法（圖8A）和細(xì)胞計(jì)數(shù)（圖8B）檢測(cè)各組BMSCs的增殖能力，均發(fā)現(xiàn)各組BMSCs增殖能力從第4日開(kāi)始逐步顯現(xiàn)差異。miR-877-3p過(guò)表達(dá)組BMSCs增殖能力顯著低于對(duì)照組，而miR-877-3p抑制組BMSCs的增殖能力顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。

圖8 轉(zhuǎn)染miR-877-3p后各組BMSCs增殖能力比較Fig 8 Comparison of proliferation ability of BMSCs in thegroupsafter transfection of miR-877-3p

3 討論

雌激素缺乏在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生及發(fā)展中起著重要作用。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是女性最常見(jiàn)的疾病之一。伴隨年齡增加，女性體內(nèi)雌激素水平降低，骨質(zhì)破壞逐漸增加。絕經(jīng)期后女性的BVF、Tb.N、BMD等骨參數(shù)指標(biāo)較絕經(jīng)前明顯降低。研究［11］發(fā)現(xiàn)，雌激素影響體內(nèi)成骨細(xì)胞的形成與破骨細(xì)胞的破壞，進(jìn)而調(diào)控骨的破壞與重建。BMSCs具有增殖和多向分化的潛能，在一定條件下能夠分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞等，從而對(duì)體內(nèi)骨平衡穩(wěn)態(tài)有著重要的調(diào)控作用［12］。近年來(lái)，研究人員［13］發(fā)現(xiàn)，miRNA因其特有的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中產(chǎn)生了較大影響。本研究構(gòu)建小鼠雌激素缺乏所致的骨質(zhì)疏松癥模型，比較來(lái)源于骨質(zhì)疏松癥小鼠的BMSCs與假手術(shù)組的BMSCs中miR-877-3p的表達(dá)情況；并通過(guò)上調(diào)（下調(diào)）BMSCs中miR-877-3p的表達(dá)，觀(guān)察miR-877-3p是否能夠調(diào)控BMSCs的增殖，進(jìn)而影響雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OVX組小鼠行卵巢摘除術(shù)8周后，雌激素水平較假手術(shù)組明顯降低，BVF、Tb.N、BMD均下降，與Shuai等［14］研究結(jié)果一致。BMSCs作為成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過(guò)程中有重要作用。骨質(zhì)疏松癥與BMSCs相互影響的研究大多集中在骨質(zhì)疏松癥環(huán)境下BMSCs多向分化能力的生物學(xué)特性改變；而關(guān)于來(lái)源于骨質(zhì)疏松癥機(jī)體BMSCs增殖能力改變的分子機(jī)制，研究較少。Tan等［15］發(fā)現(xiàn)，TAZ能夠通過(guò)PI3K/Akt通路促進(jìn)BMSCs的成骨分化。Qi等［16］發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于骨質(zhì)疏松癥病理環(huán)境下的BMSCs成骨能力較弱，骨再生與改建能力降低；但自噬能夠保護(hù)BMSCs的成骨能力，進(jìn)而減少骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。Wang等［17］發(fā)現(xiàn)，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain，leucine rich repeat and pyrin domain containing 3，NLRP3）炎癥小體的激活能夠抑制BMSCs的成骨能力，而B(niǎo)MSCs的成脂能力卻明顯提升，進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于卵巢摘除術(shù)所致的骨質(zhì)疏松癥小鼠模型的BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，成骨能力低于假手術(shù)組，而成脂能力卻高于假手術(shù)組，與上述相關(guān)研究結(jié)果一致。來(lái)源于骨質(zhì)疏松癥小鼠的BMSCs增殖能力較假手術(shù)組弱，說(shuō)明在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過(guò)程中，可能存在某些分子影響B(tài)MSCs的增殖能力。miRNA是多種生理和病理過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子，并可能通過(guò)影響成骨細(xì)胞分化，在維持骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［18］。Wang等［10］研究發(fā)現(xiàn)，miR-877-3p能夠靶向調(diào)控Smad7的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控肌纖維細(xì)胞的分化。有研究［19］指出，在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-877-3p參與了成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系MC3T3-E1成骨分化的過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，OVX組BMSCs中miR-877-3p表達(dá)水平高于假手術(shù)組，說(shuō)明雌激素缺乏可能導(dǎo)致BMSCs中miR-877-3p表達(dá)升高，進(jìn)而對(duì)BMSCs的增殖能力產(chǎn)生影響，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。Li等［20］在膀胱癌的腫瘤抑制基因p16的啟動(dòng)子位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)了miR-877-3p的結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)高表達(dá)miR-877-3p，能夠增加p16的表達(dá)，抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，提示miR-877-3p可能參與細(xì)胞增殖能力調(diào)控。Xu等［21］發(fā)現(xiàn)，miR-887-3p負(fù)調(diào)控STARD13，進(jìn)而調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的增殖能力，影響胰腺癌的進(jìn)展。本研究得到相似結(jié)果：OVX組BMSCs中miR-877-3p表達(dá)升高，BMSCs增殖能力降低；體外下調(diào)miR-877-3p后，BMSCs的增殖能力有一定程度的升高。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，在雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥病理環(huán)境下，BMSC中miR-877-3p表達(dá)升高，抑制了BMSC的增殖，但其涉及的相關(guān)靶基因調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

參·考·文·獻(xiàn)

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