二甲雙胍與美沙拉嗪在小鼠結(jié)腸炎中的療效比較

鄧鈞?曾麗珊?劉樂?陳燁?

【摘要】 目的 探討二甲雙胍與美沙拉嗪在治療小鼠結(jié)腸炎中的療效差異性。方法 選取6 ～ 8周齡的C57BL/6雄性小鼠32只，隨機分為Control組、硫酸葡聚糖（DSS）組、DSS+美沙拉嗪組、DSS+二甲雙胍組，每組8只。Control組小鼠自由飲用高壓滅菌雙蒸水，并每日予0.2 ml 磷酸鹽緩沖液（PBS）灌胃。采用3%DSS誘導C57BL/6雄性小鼠結(jié)腸炎模型。DSS組小鼠自由飲用3%DSS溶液，每日予0.2 ml PBS灌胃，DSS+美沙拉嗪組、DSS+二甲雙胍組自由飲用3%DSS溶液，予100 mg/（kg·d） 的美沙拉嗪或100 mg/（kg·d） 二甲雙胍灌胃。評估各組小鼠體質(zhì)量變化、結(jié)腸長度、疾病活動指數(shù)、組織病理學改變及腸道炎癥因子表達情況。結(jié)果 與DSS組相比，DSS+二甲雙胍與DSS+美沙拉嗪組均可降低小鼠結(jié)腸炎所致的體質(zhì)量丟失、疾病活動度評分、組織病理學評分及腸道炎癥因子表達水平（P均< 0.05），但DSS+二甲雙胍組與DSS+美沙拉嗪組上述指標比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05）。結(jié)論 二甲雙胍可以減輕DSS誘導的小鼠結(jié)腸炎，其療效不亞于美沙拉嗪。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)腸炎;二甲雙胍;美沙拉嗪;療效

Comparison of efficacy between metformin and mesalazine in treatment of experimental colitis in mouse models Deng Jun， Zeng Lishan， Liu Le， Chen Ye. Department of Gastroenterology， the Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510655， China

Corresponding author， Chen Ye， E-mail： yechen@ smu. edu. cn

【Abstract】 Objective To compare the efficacy between metformin and mesalazine in the treatment of experimental colitis in mouse models. Methods Thirty-two C57BL/6 male mice aged 6-8 weeks were randomly divided into the control， dextran sulphate sodium （DSS）， DSS+mesalazine and DSS+metformin groups， with 8 animals in each group. In the control group， the animals were given ad libitum access to autoclaved double-distilled water and oral gavage of 0.2 ml PBS daily. C57BL/6 male mouse models were induced by 3% DSS. In the DSS group， the mice were given ad libitum access to 3% DSS and oral gavage of 0.2 ml PBS daily. In the DSS+mesalazine and DSS+metformin groups， the animals were given ad libitum access to 3% DSS， and oral gavage of 100 mg/（kg·d） mesalazine or metformin. The body weight， colon length， disease activity index （DAI）， histopathological changes and the expression levels of pro-inflammatory cytokines were evaluated in each group. Results Compared with the DSS group， mice treated with DSS+metformin or DSS+mesalazine experienced significantly less body weight loss，lower DAI scores， lower histopathological scores and lower expression levels of pro-inflammatory cytokines（all P < 0.05）. No significant difference was noted between the metformin and mesalazine groups（all P > 0.05）. Conclusion Metformin can ameliorate DSS-induced experimental colitis in mice， which yields equivalent efficacy to that of mesalazine.

【Key words】 Colitis;Metformin;Mesalazine;Efficacy

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）一種以腹痛、腹瀉和黏液血便為表現(xiàn)的慢性非特異性腸道疾病。UC目前尚無有效治愈藥物，臨床上常用的治療藥物包括氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑。UC病程易反復遷延，嚴重影響患者身心健康和生活質(zhì)量，同時病情控制需要長期藥物維持，給患者造成較大的經(jīng)濟負擔[1-2]。因此，尋求一種廉價有效的藥物用于UC治療具有重要意義及經(jīng)濟學價值。腸道屏障功能破壞是UC的特征性改變[3]。我們近期研究發(fā)現(xiàn)臨床用于2型糖尿病治療的一線藥物二甲雙胍能夠減輕硫酸葡聚糖（DSS）誘導小鼠UC模型結(jié)腸炎的發(fā)生，保護腸黏膜上皮屏障功能[4]。這提示二甲雙胍具備用于治療UC的潛能。美沙拉嗪是用于UC治療的基石藥物，已被廣泛用于臨床。美沙拉嗪需長期使用，因此患者仍需承受較高的醫(yī)療支出。目前關(guān)于二甲雙胍與美沙拉嗪在減緩UC腸道炎癥的療效優(yōu)異性相關(guān)研究尚未有報道。故本研究通過應用二甲雙胍或美沙拉嗪治療UC小鼠模型，對比其減輕腸道炎癥的療效，為二甲雙胍用于治療UC進一步提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、材 料

1.實驗動物

6 ～ 8周21 ～ 24 g的C57BL/6雄性小鼠，購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心，飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學SPF級動物中心，以普通顆粒飼料飼養(yǎng)，光照周期為明暗交替12 h，常規(guī)適應性飼養(yǎng)7 d。本實驗符合動物實驗相關(guān)倫理規(guī)范（L2015059）。

2. 實驗試劑與設(shè)備

2.1實驗試劑

DSS（美國MP公司）;二甲雙胍和美沙拉嗪（美國Sigma公司）、隱血試劑盒（南京建成生物工程研究所）;小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）;戊巴比妥鈉（美國Sigma公司）;HE試劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄RT試劑盒、SYBR Premix Ex Taq（日本Takara公司）。

2.2 實驗設(shè)備

超速低溫離心機（美國Thermo-Fiser公司）;酶標板（美國Corning公司）;包埋盒（海門市康泰實驗器材廠）;載玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）;切片機、展片機、烤片機（德國Leica公司）;超聲波破碎儀（美國Sonics公司）;實時熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）。

二、實驗方法

1. 動物模型構(gòu)建

按隨機分組原則分為4組（Control組、DSS組、DSS+美沙拉嗪組、DSS+二甲雙胍組），每組8只。Control組小鼠自由飲用高壓滅菌雙蒸水，并每日予0.2 ml 磷酸鹽緩沖液（PBS） 灌胃。UC模型組（包括DSS組、DSS+美沙拉嗪組、DSS+二甲雙胍組）小鼠自由飲用3%DSS溶液，其中DSS組每日予0.2 ml PBS灌胃，DSS+美沙拉嗪組、DSS+二甲雙胍組則分別予100 mg/（kg·d）的美沙拉嗪或100 mg/（kg·d） 二甲雙胍灌胃。實驗開始前各組分別使用PBS或治療藥物提前灌胃1周，達到適應性灌胃和預處理效果。實驗開始后每日觀察各組小鼠毛發(fā)、進食、活動情況，以及體質(zhì)量、大便情況，重點觀察有無稀便、血便，7 d后UC模型組的DSS溶液全部更換為滅菌雙蒸水，所有組別小鼠禁食1 d，但不禁水，第8日后全部小鼠予0.1%戊巴比妥腹腔麻醉后經(jīng)內(nèi)眥靜脈取血，留取血清，斷頸處死小鼠。

2. 疾病活動指數(shù)（DAI）評分

根據(jù)體質(zhì)量變化情況、大便情況及大便隱血或便血情況對每只小鼠每日的DAI進行綜合評價[4]。

3. 腸道病變組織病理學評分

按照炎癥、病變深度、隱窩破壞情況及病變范圍的嚴重程度進行評分，總評分為各項的合計分值[4]。

4. 組織總RNA提取及熒光定量PCR

總RNA提?。孩賹⑦m量結(jié)腸組織用PBS洗滌干凈，置于無RNA酶的1.5 ml EP管中剪碎， 加入200 μl TRIzol液，用超聲破碎儀將組織勻漿，補足TRIzol液至1 ml，室溫靜止5 min;②每1 ml TRIzol中加1/5總體積的氯仿（200 μl），用力搖晃約15 s，充分混勻后靜置10 min后，然后在4℃下12 000 轉(zhuǎn)/分離心15 min;③離心后可見液體分為3層（上層清液為RNA液），輕輕吸取上層液體至新的1.5 ml EP管（約200 μl），加入等體積異丙醇（200 μl），混勻后靜置10 min，4℃ 離心機12 000 轉(zhuǎn)/分離心10 min;④離心后可見EP管底部有少量RNA沉淀，棄去上清，留下沉淀，沿管壁緩慢加入加1 ml現(xiàn)配的75%乙醇溶液（用DEPC水配，4℃預冷），振蕩洗滌RNA沉淀1次后，在4℃下離心機12 000 轉(zhuǎn)/分離心5 min;⑤去掉上清，沉淀在空氣中干燥5 ～ 10 min。在管中加入適量的DEPC水溶解，采用Nanodrop超微量分光光度計測量RNA濃度與純度（OD260/OD280，一般在1.8 ～ 2.0認為RNA純度良好），-80℃保存。

熒光定量PCR：以1 μg RNA為模板，使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT Master Mix （RR036A），總反應體系為20 μl。逆轉(zhuǎn)錄的各溫度和時間：37℃→15 min，85℃→5 s，降溫至4℃，所得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行實時熒光定量PCR，擴增反應條件：預變性95℃→30 s;擴增95℃→5 s，60℃→30 s，共40個循環(huán)，溶解95℃→5 s，60℃→1 min，冷卻50℃→30 s。

反應結(jié)束后擴增特異性可根據(jù)溶解曲線單峰判定。擴增效率可根據(jù)擴增曲線分析得到相應的CP值，以β-actin作為內(nèi)參照基因，使用2-△△Ct法計算出目的基因的相對表達。引物序列如下：IL-6（正向5-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3，反向5-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC）、TNF-α（正向5-CCTGTAGCCCACGTCGTAG-3，反向5-G GGAGTAGACAAGGTACAACCC）、IL-1β（正向5-CTCGTGCTGTCGGACCCAT-3，反向5-CAGGCTT GTGCTCTGCTTGTGA-3）。

三、統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學分析使用SPSS 21.0，數(shù)據(jù)在符合正態(tài)分布且方差齊時用表示，多組間比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。α= 0.05。

結(jié) 果

一、各組小鼠一般情況觀察結(jié)果

造模7 d后，Control組小鼠毛發(fā)光澤良好，活動度正常，體質(zhì)量保持每日穩(wěn)定增長，大便成形顆粒狀，無便血。DSS組小鼠毛發(fā)粗糙，食欲下降，活動減少，出現(xiàn)腹瀉，排肉眼血便、爛便，體質(zhì)量進行性下降等表現(xiàn)。

二、各組小鼠體質(zhì)量丟失及DAI評分情況

各組小鼠在實驗開始前體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計學意義，造模開始后第3日起，DSS+二甲雙胍組體質(zhì)量丟失低于DSS組小鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。DSS+美沙拉嗪組在造模第6日時體質(zhì)量丟失低于DSS組（P < 0.05）。在造模第7日結(jié)束，各組體質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計學意義（F = 25.52，P < 0.001），DSS+美沙拉嗪組及DSS+二甲雙胍組的體質(zhì)量丟失情況均低于DSS組小鼠（P均 < 0.05），但DSS+二甲雙胍組與DSS+美沙拉嗪組比較差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.292），見圖1A。

隨著造模的進行，DSS組小鼠的DAI評分高于DSS+二甲雙胍組及DSS+美沙拉嗪組（P均 < 0.01）。造模第7日DAI評分達到最高，各組DAI評分比較差異有統(tǒng)計學意義（F = 127.90，P < 0.001），但DSS+二甲雙胍組和DSS+美沙拉嗪組的DAI評分比較差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.114），見圖1B。

三、各組小鼠結(jié)腸長度改變

造模結(jié)束處理后，各組結(jié)腸長度比較差異有統(tǒng)計學意義（F = 62.72，P < 0.001），UC模型組小鼠結(jié)腸長度均短于Control組小鼠。其中，DSS組小鼠結(jié)腸縮短最明顯，DSS+二甲雙胍組及DSS+美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸長度長于DSS組小鼠（P均< 0.05），但DSS+二甲雙胍組與DSS+美沙拉嗪組比較差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.683），見圖2。

四、各組小鼠腸道組織病理學評分

各組小鼠腸道組織病理學評分比較差異有統(tǒng)計學意義（F = 153.70，P < 0.001）。HE染色顯示Control組小鼠結(jié)腸上皮及隱窩結(jié)構(gòu)完整，無炎性細胞浸潤;DSS組小鼠結(jié)腸炎可見腸黏膜完整性受到破壞，鏡下見多發(fā)潰瘍，腸道杯狀細胞明顯減少，腸道隱窩及正常腺體結(jié)構(gòu)消失，可見大量的炎性細胞浸潤至黏膜層或黏膜下層;DSS+二甲雙胍組及DSS+美沙拉嗪組的鏡下病理變化均較DSS組要明顯減輕，見圖3。腸道組織病理學評分亦提示DSS+二甲雙胍組及DSS+美沙拉嗪組小鼠腸道病理評分均低于DSS組（P均< 0.05），但DSS+二甲雙胍組與DSS+美沙拉嗪組比較差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.554），見圖4。

五、各組小鼠腸道促炎因子mRNA的表達水平

結(jié)腸IL-6、TNF-α和IL-1βmRNA表達水平在組間比較的F值分別為36.86、15.6和99.76，P均 < 0.001。二甲雙胍及美沙拉嗪治療均可以降低DSS誘導小鼠UC模型的腸道促炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β的mRNA表達水平（P均< 0.05），但DSS+二甲雙胍組與DSS+美沙拉嗪組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），見圖5。

討 論

UC是一種腸道非特異性慢性炎癥，炎癥主要發(fā)生在腸道的黏膜層和黏膜下層，病情反復遷延。UC的發(fā)病率和患病率在西歐和北美已經(jīng)趨于穩(wěn)定（約占0.3%以上人口），但在亞洲各國家中UC的發(fā)病率仍在不斷上升[5]。目前UC尚無根治性藥物。UC的治療目標是誘導和維持緩解，從而達到黏膜愈合。美沙拉嗪作為一種廣譜的氨基水楊酸制劑，是臨床上最常用于UC治療的口服藥物。美國胃腸病學會指南建議口服和（或）局部使用美沙拉嗪作為輕度至中度UC誘導和維持治療的一線藥物[6]?；顒悠赨C患者腸黏膜中白三烯B4和前列腺素E2含量升高，美沙拉嗪可以抑制劑量依賴方式抑制其合成，減緩腸道炎癥。由于UC疾病的病程特征，氨基水楊酸制劑等口服藥物需要長期使用來誘導和維持疾病緩解，因此需要花費較大醫(yī)療費用，增加患者經(jīng)濟負擔。

二甲雙胍是一種廣泛應用的治療糖尿病的一線藥物，其不局限于降糖，還具有抗炎、抗癌、抗衰老、調(diào)節(jié)腸道菌群等多種功效，可用于多種疾病的預防、治療或輔助治療等[7]。二甲雙胍已被證實在多種疾病或疾病模型中具有減少炎癥因子產(chǎn)生及抑制炎癥相關(guān)通路的作用。目前關(guān)于二甲雙胍在結(jié)腸炎方面的相關(guān)研究甚少。近來有研究提示二甲雙胍可以緩解IL-10基因敲除小鼠的腸道炎癥，提示了二甲雙胍在腸道炎癥中具有保護作用[8]。Lee等[9]報道二甲雙胍治療結(jié)腸炎小鼠時可以促進調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的分化，下調(diào)腸道中促炎性Th17細胞數(shù)量，在炎性腸道中達到緩解炎癥的功效。二甲雙胍通過調(diào)節(jié)腸道菌群，增加阿克曼菌數(shù)量，誘導 Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞表達，減輕高脂飲食所致脂肪炎癥[10]。

我們課題組近期研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以減緩DSS誘導小鼠UC模型的腸道炎性病變，抑制炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生，維護腸上皮屏障功能[4]。這與后期其他研究者的研究結(jié)論一致[11-12]。上述研究證實二甲雙胍具備減輕小鼠結(jié)腸炎的功能。那么，二甲雙胍與美沙拉嗪在緩解小鼠腸道炎癥的療效上是否具有差異性？本研究結(jié)果提示，二甲雙胍與美沙拉嗪在治療小鼠UC模型結(jié)腸炎中均可減輕小鼠體質(zhì)量丟失、降低DAI評分、減少結(jié)腸縮短和緩解炎癥對腸道上皮損害，兩者差異無統(tǒng)計學意義。同樣，二甲雙胍與美沙拉嗪均可顯著降低小鼠UC模型腸道炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表達，2組間炎癥因子降低水平差異亦無統(tǒng)計學意義。我們的研究結(jié)果顯示，二甲雙胍在緩解小鼠UC模型腸道炎癥的療效上并不差于美沙拉嗪，另外我們尚未發(fā)表的研究數(shù)據(jù)也提示二甲雙胍能夠保護腸道黏液屏障功能，而黏液屏障是腸道抵御有害病原體的第1道防線，這些結(jié)果直接或間接證實了二甲雙胍在減緩結(jié)腸炎上具有良好的功效。二甲雙胍是一類廉價而安全的藥物，已在臨床上廣泛應用，具備用于治療UC的潛力。在DAI評分、組織病理學和腸道炎癥因子水平上，我們既往研究已對Control組與DSS組進行過統(tǒng)計學比較提示差異有統(tǒng)計學意義[4]。故本研究對以上結(jié)果未再進行陳述及標注。

綜上所述，二甲雙胍在小鼠UC模型中可以有效控制腸道炎癥，抑制炎癥因子的表達，其療效與美沙拉嗪相比差異無統(tǒng)計學意義，但尚需臨床相關(guān)研究數(shù)據(jù)支持，以便驗證其能夠作為一種廉價備選藥物用于UC治療。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-03-05）

（本文編輯：楊江瑜）