糞便SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化檢測(cè)在大腸腫瘤篩查中的臨床應(yīng)用

孟岳?余中貴?黃文峰?許岸高?李丙生

【摘要】目的 評(píng)估檢測(cè)大腸腫瘤患者糞便中SEPT-9和微RNA（miRNA）-34b/c基因甲基化對(duì)大腸腫瘤篩查的臨床性能。方法 采用病例對(duì)照研究方法，使用甲基化敏感性高分辨率熔解曲線法檢測(cè)大腸腫瘤患者（大腸癌組35例、大腸腺瘤組47例）和正常對(duì)照人群（正常對(duì)照組52名）糞便中SEPT-9和miRNA-34b/c基因是否存在甲基化，來(lái)評(píng)估其篩查大腸腫瘤的性能。結(jié)果 大腸癌組SEPT-9和miRNA-34b/c基因的甲基化陽(yáng)性率分別為68.6%、71.4%，大腸腺瘤組分別為57.4%、63.8%，正常對(duì)照組分別為9.6%、11.5%。3組的SEPT-9、miRNA-34b/c基因甲基化陽(yáng)性率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2SEPT-9 = 37.185，χ2miRNA-34b/c = 40.040，P均< 0.001），利用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較，大腸癌組和大腸腺瘤組的甲基化陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.001）。3組聯(lián)合檢測(cè)SEPT-9和miRNA-34b/c基因的甲基化陽(yáng)性率為88.6%、76.6%、13.5%，大腸癌組和大腸腺瘤組聯(lián)合檢測(cè)的甲基化陽(yáng)性率均高于SEPT-9單基因檢測(cè)和miRNA-34b/c單基因檢測(cè)（P均< 0.05）。結(jié)論 檢測(cè)糞便中SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化具有效好的大腸腫瘤篩查性能，或許可作為大規(guī)模人群篩查大腸腫瘤新的生物標(biāo)志物組合;多基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)篩查的性能優(yōu)于單基因。

【關(guān)鍵詞】大腸腫瘤;SEPT-9;miRNA-34b/c;甲基化;甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析

Clinical performance of detecting fecal SEPT-9 and miRNA-34b/c gene methylation for colorectal tumor screening Meng Yue， Yu Zhonggui， Huang Wenfeng， Xu Angao， Li Bingsheng. Departmengt of Gastroenterology， the First Hospital of Huizhou， Huizhou 516000， China

Corresponding author， Li Bingsheng， E-mail： 1102066844@ qq. com

【Abstract】Objective To access the clinical performance of detecting fecal SEPT-9 and miRNA-34b/c gene methylation for colorectal tumor screening in patients diagnosed with colorectal tumor. Methods In this case-control study， the fecal SEPT-9 and miRNA-34b/c gene methylation in patients diagnosed with colorectal cancer（n = 35），colorectal adenoma（n = 47） and normal controls （n = 52） was identified by by using methylation-sensitive high-resolution melting （MS-HRM） to access the clinical performance for colorectal tumor screening. Results The methylation rates of fecal SEPT-9 and miRNA-34b/c detection in the colorectal cancer group were 68.6% and 71.4%， 57.4% and 63.8% in the colorectal adenoma group， and 9.6% and 11.5% in normal control group， respectively. The methylation rates of SEPT-9 and miRNA-34b/c significantly differed among three groups （χ2SEPT-9 = 37.185， χ2miRNA-34b/c = 40.040， all P < 0.001）. According to two-group comparison by using Bonferroni correction，the methylation rates did not significantly differ between the colorectal cancer and colorectal adenoma groups （both P > 0.05）， which significantly differed from those in the normal control group （all P < 0.001）. The methylation rates of combined detection of SEPT-9 and miRNA-34b/c were 88.6% in the colorectal cancer group， 76.6% in the colorectal adenoma group and 13.5% in normal control group. Combined decection methylation rates of SEPT-9 and miRNA-34b in colorectal cancer group and colorectal adenoma group were significantly higher compared with that of either SEPT-9 or miRNA-34b/c alone （all P < 0.05）. Conclusions Detecting fecal SEPT-9 and miRNA-34b/c gene methylation yields high clinical performance for colorectal tumor screening. Methylated SEPT-9 and miRNA-34b/c genes may be a new panel of biomarkers for colorectal tumor screening in large-scale population. The performance of combined detection of multi-gene methylation detection is better compared with that of single gene.

【Key words】Colorectal cancer;SEPT-9;miRNA-34b/c;Methylation;

Methylation-sensitive high-resolution melting

大腸癌是常見的消化道腫瘤之一，我國(guó)大腸癌發(fā)病率繼胃癌、肺癌、食管癌之后排第4位，且呈上升趨勢(shì)[1]。和其他惡性腫瘤不同的是，大腸腫瘤早期篩查、早期診斷、早期治療能顯著降低大腸癌的發(fā)病率和病死率，改善預(yù)后，有重大社會(huì)意義。目前，尚無(wú)行之有效的大腸腫瘤大規(guī)模篩查方法。DNA甲基化是大腸腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)早期事件，研究證實(shí)通過(guò)檢測(cè)糞便DNA/微RNA（miRNA）基因的甲基化可早期篩查大腸腫瘤，并且多基因聯(lián)合檢測(cè)的篩查性能優(yōu)于單基因檢測(cè)。目前有較多的糞便DNA/miRNA基因甲基化標(biāo)志物被研究用于大腸腫瘤篩查，其中SEPT-9和 miRNA-34b/c基因被證實(shí)具有較好的篩查性能[2-6]。

基于此，本研究評(píng)估聯(lián)合檢測(cè)糞便SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化對(duì)大腸腫瘤篩查的臨床性能，以期尋求更好的大腸腫瘤篩查標(biāo)志物組合。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

1. 標(biāo)本來(lái)源及相關(guān)臨床資料

收集2017年1月至2017年7月我院術(shù)前大腸癌患者、術(shù)前大腸腺瘤患者及腸鏡受檢者的糞便標(biāo)本及臨床資料。共搜集糞便標(biāo)本如下：根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，總共入組35例大腸癌 、47例大腸腺瘤、52例正常對(duì)照組。大腸癌組中，男女比例19∶16，年齡（58.72±2.34）歲;大腸腺瘤組中，男女比例25∶22，年齡（55.50±1.78）歲。按年齡、性別匹配的正常對(duì)照組中，男女比例25∶27，年齡（53.67±2.13）歲。大腸癌組、大腸腺瘤組、正常對(duì)照組的性別構(gòu)成、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），具有可比性。研究對(duì)象對(duì)本研究均知情同意。

2.納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥40歲，病理組織學(xué)檢查（均由一位經(jīng)驗(yàn)豐富的胃腸道病理學(xué)專家閱片判定）確診為結(jié)直腸腺瘤或大腸癌患者;②能收集合格糞便樣本的患者。病例組排除標(biāo)準(zhǔn)：①家族性或遺傳性結(jié)直腸腺瘤或腫瘤;②非原發(fā)癌灶者及不能確診等其他情況;③合并其他系統(tǒng)或器官腫瘤;④同時(shí)患有炎癥性腸病者;⑤術(shù)前有放射治療或化學(xué)治療史;⑥妊娠或有嚴(yán)重肝腎功能不全者;⑦肉眼見全血性大便者。正常對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡、性別與大腸癌組、大腸腺瘤組匹配;②腸鏡檢查陰性;③能收集到合格糞便樣本。正常對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他系統(tǒng)或器官腫瘤;②妊娠或有嚴(yán)重肝腎功能不全者。

二、主要試劑

糞便DNA提取試劑盒、高分辨率熔解（HRM）分析試劑盒;亞硫酸氫鹽修飾試劑盒、100%甲基化DNA標(biāo)準(zhǔn)品、0%甲基化DNA 標(biāo)準(zhǔn)品;HRM引物由上海生工公司合成。

三、實(shí)驗(yàn)儀器

PCR 擴(kuò)增儀;LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR 儀;紫外分光光度計(jì);-80 ℃冰箱、-20 ℃冰箱;電子天平;臺(tái)式高速低溫離心機(jī);渦旋振蕩器。

四、實(shí)驗(yàn)方法

使用糞便DNA提取試劑盒提取糞便DNA;對(duì)提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾;在Light Cycler 480 Ⅱ螢光定量 PCR儀上按設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增目的基因CpG島，后采用Gene Scanning分析其甲基化狀態(tài);結(jié)果判定：構(gòu)建各基因甲基化標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線，依據(jù)所檢測(cè)標(biāo)本熔解曲線在標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線中的相對(duì)位置，判斷其是否存在甲基化;結(jié)果由2名研究人員分別判斷，如意見不同，則再次實(shí)驗(yàn)?；蚵?lián)合檢測(cè)結(jié)果判定：任一基因甲基化陽(yáng)性則結(jié)果記錄為陽(yáng)性，兩基因甲基化均陰性記錄為陰性。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布資料以表示，組間比較采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，多組間比較采用χ2檢驗(yàn)，兩兩比較采用Bonferroni法校正檢驗(yàn)水準(zhǔn);組內(nèi)不同檢測(cè)指標(biāo)比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)。α = 0.05。

結(jié)果

一、提取的糞便DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

從糞便標(biāo)本中提取的DNA條帶亮度高且條帶單一，分子量均大于2000 bp，提示提取DNA濃度高，較純，見圖1。

二、3組糞便SEPT-9和miRNA-34b/c基因的甲基化陽(yáng)性率比較

3組的SEPT-9、miRNA-34b/c基因甲基化陽(yáng)性率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2SEPT-9 = 37.185，χ2miRNA-34b/c = 40.040，P均< 0.001），利用Bonferroni法校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行兩兩比較，大腸癌組和大腸腺瘤組的甲基化陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.001）。大腸癌組和大腸腺瘤組聯(lián)合檢測(cè)SEPT-9和miRNA-34b/c基因的甲基化陽(yáng)性率均高于SEPT-9單基因檢測(cè)和miRNA-34b/c單基因檢測(cè)（P均< 0.05），見表1。

討論

大腸癌和其他惡性腫瘤不同之處在于大腸癌早期和晚期預(yù)后差別巨大。篩查及診斷早期大腸腫瘤，予以腸鏡下切除，或者行外科手術(shù)切除，可以降低大腸癌的發(fā)病率和病死率。因此，早期篩查大腸腫瘤意義重大。

作為一種新的大腸腫瘤無(wú)創(chuàng)篩查標(biāo)志物，DNA甲基化被部分研究證實(shí)具有良好的篩查性能，然而暫時(shí)只有個(gè)別基因甲基化檢測(cè)應(yīng)用于臨床，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證其性能以及找尋更多具有良好篩查性能的基因甲基化標(biāo)志物或組合。有研究證實(shí)，多基因聯(lián)合檢測(cè)性能優(yōu)于單基因檢測(cè)[7]。目前有大量DNA甲基化標(biāo)志物被研究用于大腸腫瘤篩查，有較多研究報(bào)道SEPT-9和miRNA-34b/c有較好的大腸腫瘤篩查性能。甲基化敏感性HRM法檢測(cè)糞便基因甲基化，已被本課題組之前的研究證實(shí)具有良好性能[5， 8-9]。 因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探索聯(lián)合檢測(cè)大腸腫瘤患者糞便中SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化，以評(píng)價(jià)其篩查大腸腫瘤的性能。

本研究通過(guò)病例對(duì)照研究，分別檢測(cè)大腸腫瘤患者及正常對(duì)照人群糞便中SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化情況，并將甲基化情況和研究對(duì)象的臨床特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)SEPT-9和miRNA-34b/c基因在大腸癌和大腸腺瘤中有較高的甲基化率，在正常人群中甲基化率較低，與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的甲基化率相符，進(jìn)一步證實(shí)了上述2種基因甲基化檢測(cè)篩查大腸腫瘤的性能。然而本研究樣本量不夠大，且未對(duì)不同分期、不同分化程度大腸癌進(jìn)行亞組分型，或許DNA甲基化亦可作為大腸癌分期及惡性程度的輔助指標(biāo)[10]。

綜上所述，SEPT-9和miRNA-34b/c基因是具有較好篩查大腸腫瘤性能的標(biāo)志物組合，或許將來(lái)可大規(guī)模應(yīng)用于臨床篩查大腸腫瘤，但仍有大量工作需要我們進(jìn)一步開展，如更大樣本量的研究，以及對(duì)大腸癌分亞組以研究大腸癌不同分期的甲基化情況，對(duì)甲基化與大腸腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的進(jìn)一步探索等。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-03-18）

（本文編輯：楊江瑜）