桃若干重要性狀的KASP分子標記開發(fā)與應用

孟君仁，曾文芳，鄧麗，潘磊，魯振華，崔國朝，王志強，牛良

桃若干重要性狀的KASP分子標記開發(fā)與應用

孟君仁，曾文芳，鄧麗，潘磊，魯振華，崔國朝，王志強，牛良

中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所/國家桃葡萄改良中心/農(nóng)業(yè)部果樹育種技術重點實驗室，鄭州 450009

【】開發(fā)一系列高通量、低成本的桃重要性狀競爭性等位基因特異PCR（Kompetitive Allele Specific PCR，KASP）標記，包括果皮有毛/無毛、果形扁平/圓形、果肉硬質/非硬質、DBF（Dominant Blood Flesh）紅肉/非紅肉、抗/感蚜等5對性狀，加速桃優(yōu)良品種培育，縮短桃育種年限。本研究在控制這些性狀的候選基因及位點附近300 kb內(nèi)，利用已有桃種質資源的基因組序列比對，開發(fā)KASP標記，對已知表型的桃種質材料進行基因分型驗證，最終獲得與目標性狀緊密連鎖的KASP標記。利用開發(fā)的5個性狀的KASP分子標記對桃雜交分離群體和自然群體進行基因型檢測，結果表明，標記鑒定結果與已知表型完全一致，準確率為100%。其中，雜交群體中果皮有毛/無毛性狀分離比例為30﹕30，果形扁平/圓形分離比例為31﹕29，果實硬質/非硬質分離比例為27﹕26，抗蚜/感蚜分離比例為49﹕46，均符合孟德爾遺傳1﹕1的分離定律。開發(fā)的KASP標記可高效檢測桃果實外觀、抗性、肉質等重要性狀相關基因的等位變異，在基因型鑒定、親本選配和雜種后代的分子標記輔助選擇中有很好的應用前景。

桃；KASP；分子標記輔助選擇；育種

0 引言

【研究意義】果樹童期長[1]，且以果實為生產(chǎn)目的，育種中很多重要表型的觀測評價都需要等到開花結果之后，這導致育種周期長，效率低下；同時，果樹雜種實生苗田間定植需占用大量土地，管理成本高，也限制了育種規(guī)模的擴大?，F(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展實現(xiàn)了可以利用與相關性狀緊密連鎖的分子標記來進行親本選擇或對雜種后代進行預先篩選，提高育種效率[2-3]。KASP標記可使分子檢測的可視化程度大幅提升，實現(xiàn)高通量、低成本應用，推動分子育種的發(fā)展。【前人研究進展】桃（）是原產(chǎn)于我國的世界性重要落葉果樹[4]，屬于薔薇科（Rasaceae）李屬（），因其染色體數(shù)目少（2n=16）、基因組較?。s227 Mb）、童期短，成為薔薇科果樹遺傳規(guī)律研究的模式植物[5]。桃很多性狀的遺傳均已有報道，桃果皮有毛/無毛（）[6]、果形扁平/圓形（）[7]、抗桃綠蚜/感蚜（）[8]、紅肉/非紅肉（）[9]、硬質/非硬質（）[10]均為單基因控制的質量性狀，除硬質為隱性外，其余4個性狀均為顯性遺傳。近年來，隨著桃參考基因組測序的完成[11]，研究人員對很多重要性狀進行了定位，并開發(fā)了相關性狀的分子標記[12]。VENDRAMIN等[6]根據(jù)雜交群體毛桃品種‘Contender’×油桃品種‘Ambra’F2代的連鎖分析，將桃有毛/無毛性狀G位點的位置定位在第5條染色體1.1 cM（635 kb）的區(qū)間內(nèi)。CAO等[13]對84份桃/油桃種質資源進行全基因組重測序，利用全基因組關聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）的手段，最終確定是桃果實表皮毛形成的候選基因。馮建燦等[14]開發(fā)的IndelG標記能有效地區(qū)分桃和油桃，為桃育種早期苗期的表型鑒定提供了有效工具。MICHELETTI等[15]認為扁平的桃果實形狀是由一個顯性等位基因介導的雜合性引起，定位在LG6的末端。郭健[16]在果形關聯(lián)分析研究的基礎上，結合二代測序手段，對果形緊密連鎖的位點Chr：25060196（Prunus_persica V1.0）進行驗證，并開發(fā)出1個ASPCR分子標記，在‘大久保’與‘油蟠1-3’雜交群體中進行驗證，準確率為100%。SHEN等[9]對中國特色紅肉桃品種‘五月鮮’進行紅肉性狀遺傳規(guī)律研究時發(fā)現(xiàn)，紅肉由顯性單基因（）控制，將其定位在第5連鎖群的上端。ZHOU等[17]也將DBF型紅肉性狀定于第5號連鎖群頂端約200 kb的區(qū)間，結合比較轉錄組學研究發(fā)掘了一個控制血桃的候選基因，該基因屬于編碼NAC蛋白的轉錄因子。PAN等[18]通過非硬質桃和硬質桃的對比，篩選出一個生長素合成路徑的限速酶基因（類黃素單加氧酶基因），對該基因及其啟動子區(qū)多態(tài)性位點的分析發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)含子中的SSR位點可以準確區(qū)分品種的基因型是否屬于硬質類型。牛良等[19]利用壽星桃及其抗性后代構建遺傳分離群體，對其抗性表現(xiàn)及遺傳進行了鑒定，最終將壽星桃抗蚜性狀定位于45.676—45.837 Mb，物理距離160 kb，受單基因控制，顯性遺傳，未開發(fā)相關分子標記。競爭性等位基因特異PCR技術是基于引物末端堿基的特異匹配來對單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）及插入和缺失（insertions and deletions，InDels）進行高通量基因分型的方法，由LGC（Laboratory of the Government Chemist）公司（http://www.lgcgroup.com/）設計和創(chuàng)制，具有通量高、成本低、準確度高等優(yōu)點。KASP分子標記已經(jīng)成為新一代的SNP分型標記，在水稻[20-21]、小麥[22]、油菜[23]等作物的基因精細定位、分子標記輔助選擇育種（Marker Assisted Selection，MAS）、種質資源鑒定等方面被廣泛應用。但目前KASP標記在桃育種上的應用還鮮有報道。【本研究切入點】盡管已有很多關于控制桃主要質量性狀的功能基因研究，但仍缺少能夠利用到育種中的快速高效、低成本的分子標記。【擬解決的關鍵問題】基于控制桃果皮有毛/無毛、果形扁平/圓形、果肉硬質/非硬質、DBF紅肉/非紅肉、Rm3抗蚜/感蚜等5對重要農(nóng)藝性狀的等位基因位點及附近300 kb的SNP變異，開發(fā)設計KASP標記，對自然群體及雜交群體進行基因分型驗證，為利用KASP標記進行桃親本選配和雜種后代的早期選擇提供支持，加快桃育種選擇進程，提高育種效率。

1 材料與方法

1.1 植物材料

30份桃種質資源和2個桃雜交群體，均來源于中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所桃育種圃，桃種質資源即自然群體材料名稱及表型見表1；雜交群體見表2。其中雜交群體1母本為‘中油20號’（果皮無毛、果實圓形、白肉、硬質、感蚜），父本為‘01-77-4’（果皮有毛、果實扁平、白肉、抗蚜）；雜交群體2母本為‘中油20號’，父本為‘10新25-8’（果皮有毛、果實圓形、紅肉、溶質）。2020年4月采集幼嫩葉片，液氮速凍后置于-80℃保存，提DNA備用。

表1 本研究涉及的自然群體材料

表2 本研究涉及的雜交群體

1.2 桃葉片DNA提取

采用張南南等[24]的高通量桃DNA提取方法快速提取基因組總DNA，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，微量紫外分光光度計（Nanodrop 2000，Thermo）檢測DNA濃度，將DNA稀釋至50—100 ng?mL-1，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 KASP分子標記的開發(fā)

基于已有油桃品種‘中油13號’‘中油16號’，蟠桃品種‘中蟠1號’‘中蟠2號’，DBF型紅肉單株‘10新25-8’等50倍基因組重測序數(shù)據(jù)，在控制各個性狀位點附近300 kb內(nèi)，結合基因組序列比對，選擇候選的SNP位點，并從phytozome v 12.1下載候選SNP所在區(qū)域的序列。試驗所需的KASP標記引物由上海艾吉析科技有限公司合成（表3），引物序列基于SNP突變位點設計。

KASP反應在LightCycler 480 （LC480）上進行，PCR擴增反應體系和反應程序參照韋宇等[25]的方法：將稀釋好的DNA模板50—100 ng?mL-1，分別加入96孔板中，配制如下反應體系進行PCR擴增反應：模板DNA 5mL，2×KASP Master mix 5mL，KASP標記引物0.14mL，每個孔的反應體系總體積為10.14mL。

在LightCycler 480（LC480）上的PCR反應程序為：（1）KASP熱循環(huán)：94℃預變性15 min；94℃變性20 s；61—55℃退火延伸60 s，10個循環(huán)（每個循環(huán)降低0.6℃）；94℃變性20 s；55℃退火延伸60 s，26個循環(huán)；37℃讀取1 min。（2）KASP回收：94℃變性20 s；57℃延伸60 s。重復步驟（1）—（2）兩次（共3次）；37℃讀取1 min。反應結束后，根據(jù)檢測的2種熒光信號來判斷樣本分型情況，不同的熒光信號獲得不同的基因型。

1.4 表型鑒定

遺傳群體于2017年定植于中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所桃育種圃，在2019年開始結果。在果實成熟期隨機選取樹冠中部外圍10個果實，參照王力榮等[26]編著的《桃種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》調查桃果實表皮有毛/無毛、果形扁平/圓形、果肉紅肉/非紅肉等性狀（圖1）。

表3 桃若干性狀標記引物序列

A：桃果實果肉顏色：紅肉與白肉；B：桃果實形狀：蟠桃與圓桃，桃果皮茸毛有無：油桃與毛桃；C：桃樹感蚜、抗蚜以及蚜蟲刺探后抗蚜植株產(chǎn)生的過敏斑點

桃果實成熟期及采后均不變軟，且均不釋放乙烯的為硬質桃。在果實成熟后，采集50個果實，置于25℃室溫條件下儲存，每3 d隨機取5個桃，用數(shù)顯式水果硬度計（型號：GY-4）測量果實硬度；同時將3個無病蟲害、無機械損傷的桃置于2 L保鮮盒中，密封2 h后，進樣針抽取1 mL氣體，氣相色譜儀（島津GC-2010）檢測乙烯含量。連續(xù)2周后果實不變軟且不釋放乙烯，即為硬質桃。選取的果子成熟度依據(jù)果皮底色來判斷，一般底色已完全褪綠的溶質桃果實在5 d內(nèi)會釋放乙烯，果實迅速軟化，乙烯釋放達到高峰；果實硬度保持較高的水平，有乙烯釋放，為不溶質桃。

抗桃綠蚜性狀于雜種苗定植后第2年蚜蟲發(fā)生盛期開展，對每個單株蚜蟲為害卷葉程度單獨進行評價，抗蚜標準參考牛良等[8]的方法。

1.5 基因分型與數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用LC480 software軟件分析基因分型結果：聚合在X軸附近的基因型為連接FAM熒光標簽序列的等位基因型，聚合在Y軸附近的基因型為連接HEX熒光標簽序列的等位基因型，中間顯示紅色的基因型為兩種等位基因的雜合型，左下角顯示灰色的樣本為不加DNA模板（以滅菌水為模板）的空白對照。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與作圖采用Excel 2007。

2 結果

2.1 桃果皮茸毛有/無等位變異的KASP鑒定結果

從組合1中隨機取60個單株，從保存的種質資源中取30份材料，利用開發(fā)的KASP分子標記對這些材料的基因型進行檢測，KASP分型結果見圖2和表4，共呈現(xiàn)出3種基因型，等位基因X和雜合型為毛桃，等位基因Y為油桃。遺傳群體中后代有毛/無毛性狀分離比例為30﹕30（χ2c=0＜χ20.05=3.84），符合孟德爾遺傳1﹕1的分離規(guī)律，且標記驗證符合率為100%。30份種質資源的標記鑒定結果與表型符合率也達到100%。

圖2 90份桃種質果實有毛/無毛性狀KASP基因分型圖及后代群體中有毛/無毛性狀分離

表4 利用KASP分子標記對桃種質果實有毛/無毛基因分型檢測結果

2.2 桃果實扁平/圓形等位變異的KASP鑒定結果

對90份已知果形表型的組合1遺傳群體和自然群體材料進行KASP標記應用發(fā)現(xiàn)，共呈現(xiàn)2種基因型，等位基因X為圓桃，雜合型為蟠桃，基因分型結果見圖3和表5，標記符合率為100%。發(fā)現(xiàn)59份遺傳群體后代中圓桃﹕蟠桃分離比例為29﹕31（χ2c=0.0667＜χ20.05=3.84），符合1﹕1的孟德爾遺傳分離比例。

圖3 90份桃種質果實扁平/圓形性狀KASP基因分型圖及后代群體中分離比例

表5 桃果實扁平/圓形等位變異的KASP驗證

2.3 桃果肉硬質/非硬質等位變異的KASP鑒定結果

利用硬質性狀KASP標記檢測組合2遺傳分離群體和自然群體基因型。標記檢測結果表現(xiàn)出3種基因型（圖4、表6）。其中組合2群體共檢測53個單株，有27個單株為硬質桃的隱性純合基因型，26個單株為非硬質桃的雜合基因型，2種基因型比例符合1﹕1單基因遺傳分離規(guī)律（χ2c=0.0189＜χ20.05=3.84），標記檢測結果與果實成熟期肉質鑒定表型完全一致，即KASP標記與硬質表型共分離，同時能檢測到雜合基因型，表明標記可用于硬質桃育種的MAS選擇。對22份品種資源材料的檢測，與表型的符合率為100%（表6）。

圖4 桃硬質群體KASP基因分型圖及后代群體中硬質/非硬質性狀分離

表6 桃果實硬質/非硬質等位變異的KASP驗證

2.4 桃果實DBF型紅肉變異的KASP鑒定結果

利用開發(fā)的DBF紅肉KASP標記對組合2中53個單株及17份驗證單株進行基因分型（圖5、表7）。結果表明，樣品基因型分型準確，且標記與表型鑒定結果的符合率達100%。其中，后代遺傳群體中紅肉有21個單株，非紅肉32個單株。

2.5 Rm3抗蚜/感蚜分離群體的KASP鑒定結果

對組合1的95個單株進行KASP標記驗證，結果表明，樣品基因分型準確（圖6、表8），分型結果與表型完全吻合。組合1雜交后代抗蚜：感蚜分別為49﹕46（χ2c=0.095＜χ20.05=3.84），符合孟德爾遺傳1﹕1的分離規(guī)律。

3 討論

桃果實表皮茸毛、果形、紅肉、抗蚜、硬質等關鍵農(nóng)藝性狀是涉及桃果實外觀、品質、抗逆性、耐貯運性的關鍵性狀。在遺傳育種中，果實相關的表型評價工作需要雜種實生苗定植開花結果后開展，存在鑒定周期長、占用土地資源與人力成本高等問題，不能滿足快速準確地根據(jù)育種目標進行選擇的需求。因此，相關分子標記開發(fā)及應用系統(tǒng)的建立在桃MAS育種中顯得尤為重要。KASP技術具有成本低、通量高、檢測速度快、可視化好的優(yōu)勢，不需要每個SNP位點都合成特異的熒光引物，所有位點都使用通用熒光引物來擴增檢測，大大降低了試劑成本。KASP技術僅需PCR和熒光檢測兩個步驟，且能實現(xiàn)只需加樣一次，即可完成基因分型過程，輕松地將分型結果在軟件中可視化。而且KASP技術除了檢測單個突變位點外，還可以檢測片段缺失或大片段插入等[27]。因此，在植物分子育種、醫(yī)學研究等方面具有很好的應用潛力。

圖5 桃DBF型紅肉KASP基因分型圖及分離遺傳群體中紅肉/非紅肉分離情況

表7 桃果實紅肉/非紅肉等位變異的KASP驗證

圖6 組合1抗蚜分離群體KASP基因分型圖及后代群體中抗蚜/感蚜分離情況

表8 抗蚜/感蚜雜交群體中的KASP驗證

普通的分子標記主要依賴于PCR反應之后，仍需進行瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，試驗費時費力且手工點樣存在誤差，而本研究利用的KASP基因分型方法建立的熒光分子標記，不再需要進行電泳分析，利用96孔板即可在羅氏480儀器上完成樣品的檢測。本研究結果表明，KASP標記對比前人研究的桃果皮茸毛SCAR[28]、SSR標記[29]和果形ASPCR[16]、SSR標記[30]，能快速準確地檢測出桃果實中有毛/無毛、果形扁平/圓形等。本試驗分離群體包含93個單株，而用于果皮茸毛、果形標記驗證的群體數(shù)量有60個，結果相對而言比較可靠，認為可用于分子標記輔助育種。本研究對紅肉/非紅肉的KASP檢測，結果發(fā)現(xiàn)紅肉/非紅肉分離比例為21﹕32，不符合1﹕1孟德爾遺傳分離規(guī)律，推測一方面是紅肉性狀與成熟期相關聯(lián)，導致分離出現(xiàn)偏差；另一方面可能與親本復雜且尚不清楚的遺傳背景有關。對硬質/非硬質性狀的檢測顯示，分型效果好，符合率高，相較于曾文芳等[31]通過兩對引物（PF1、PR1與PF2、PR2）的擴增確定硬質性狀位點基因型，KASP標記能夠更加簡便地檢測HD/hd基因型。另外，本研究基于壽星桃類型的抗蚜新基因首次開發(fā)了抗蚜/感蚜KASP分子標記，為將抗蚜性加入到新品種選育目標中提供了早期選擇工具，可為提高育種效率提供參考。

盡管KASP標記自發(fā)展以來在育種中體現(xiàn)出很大的便捷性，但它也有自身的缺點。由于正向引物末端必須存在位點的變異，導致設計引物有一定局限性，影響引物質量，存在非特異擴增，導致分型失敗。由于KASP技術的高通量特性，加上LGC公司反應試劑，若檢測樣品較少，相對地單個樣本的檢測成本會較高。另外，KASP技術目前多用于對質量性狀的功能基因進行高通量檢測。而對桃來說，數(shù)量性狀QTL如果實含糖量、成熟期等在育種中同樣具有重要意義。相反，隨著基因組測序技術的不斷完善和發(fā)展，SNP信息爆發(fā)性的增長，大量潛在的SNP標記均可以用于品種改良。近年來，已經(jīng)利用基因分型從小麥中成功篩選出有價值的QTLs以及與性狀關聯(lián)的標記[32-34]。LIU等[35]成功將小麥中與產(chǎn)量、品質和抗病相關的數(shù)量性狀位點轉化為KASP標記。何中虎等[36]綜述了小麥條銹病和白粉病成株抗性的系統(tǒng)研究和育種實踐，表明聚合4—5個微效基因可以培育出持久抗性品種，可有效減少產(chǎn)量損失。綜上所述，使用低成本、高效率的KASP基因分型技術進行分子輔助育種，在材料中導入重要農(nóng)藝性狀，是育種工作者更加值得研究的問題。

4 結論

基于KASP技術對桃果皮茸毛有/無、果形扁平/圓形、果肉硬質/非硬質、DBF紅肉/非紅肉、Rm3抗蚜/感蚜等5對桃重要農(nóng)藝性狀進行基因分型，獲得了與性狀共分離的準確分子標記，這些KASP標記可適用于相關品種基因型鑒定、雜交親本輔助選擇及雜種單株的早期選擇等。

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Development and Application of KASP Molecular Markers of Some Important Traits for Peach

MENG JunRen, ZENG WenFang, DENG Li, PAN Lei, LU ZhenHua, CUI GuoChao, WANG ZhiQiang, NIU Liang

Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/ National Peach and Grape Improvement Center/Key Laboratory of Fruit Breeding Technology of Ministry of Agriculture, Zhengzhou 450009

【】In order to improve breeding efficiency based on the marker-assisted selection in peach, a series of high-throughput and low-cost KASP markers for important traits (such as fruit skin fuzz, fruit shape, stony hard fruit texture, DBF blood-flesh and resistance to green peach aphids) of peach were developed. 【】Based on the resequenced genome information of some peach cultivars, multiple sequence alignment was used to find specific SNP within 300 kb of both flanks of target genes or loci for related traits. KASP markers were developed according to the differences of SNPs, and the close link between KASP markers and the target characteristics was confirmed by genotyping.【】The developed KASP molecular markers for five traits were utilized to detect the genotypes of peach hybrid populations and natural populations. The results showed that the markers identification was completely consistent with the known phenotypes, and the accuracy was 100%. In the hybrid populations of CN20 × 01-77-4, the segregation ratio of peach peel with fuzz/without fuzz, flat fruit/round fruit, and the segregation ratio of resistance to green peach aphids/susceptibility was 30﹕30, 31﹕29, and 49﹕46, respectively, which were in accordance with the 1﹕1 of Mendel’s first law. In population of CN20 × 10 xin 25-8, the high-throughput KASP molecular marker was used to detect genotypes of 53 offspring, and the results showed that genotypes of 27 were G/G appeared stony hard peach and 21 were T/C appeared DBF blood-flesh fruit, which were consistent with the phenotype identification results.【】The KASP marker could be efficiently used to detect allelic variations of genes related to important traits, such as peach fruit appearance, resistance, and fruit texture. It had a good application prospect in genotypic identification, parents apolegamy and hybrid progenies marker-assisted selection.

peach; KASP; marker-assisted selection; breeding

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.15.013

2020-08-30；

2020-11-13

國家重點研發(fā)計劃（2019YFD1000801）、國家自然科學基金（31872085）、中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程專項經(jīng)費項目（CAAS-ASTIP-2020-ZFRI）

孟君仁，E-mail：82101186035@caas.cn。通信作者王志強，E-mail：wangzhiqiang@caas.cn。通信作者牛良，E-mail：niuliang@caas.cn

（責任編輯 趙伶俐）