嗜尸性蠅類種屬鑒定研究進展

冉淵，張小園，呂宙，2

1.西南政法大學刑事偵查學院（國家安全學院），重慶 401120；2.西南政法大學重慶高校物證技術工程研究中心，重慶401120

死亡時間（postmortem interval，PMI）推斷一直是困擾法醫(yī)工作者的難題之一，同時也是法醫(yī)學研究的重中之重[1]。在許多命案中，尸體常位于人跡罕至的荒郊野外或偏僻的房屋內，周邊環(huán)境多無監(jiān)控設備，一旦尸體或尸塊高度腐敗，死者的身源也無法通過遺傳學或人類學方法確定，此時PMI 的判斷就成為破案的關鍵。對于這類腐敗尸體，傳統(tǒng)的法醫(yī)病理學以及近些年來新興的分子生物學、生物化學、物理學診斷方法大多僅適用于尸體腐敗早期[2]。對于高度腐敗尸體而言，法醫(yī)昆蟲學死亡時間推斷方法的適用性更強[3]。嗜尸性蠅類的個體生長發(fā)育情況和嗜尸性昆蟲群落演替規(guī)律是推算腐敗尸體PMI 的兩類最經典方法[3-5]。然而，由于不同種屬蠅類發(fā)育時間差異較大，在實際案件中如果不進行昆蟲種屬鑒定而直接測量蠅蛆體長、計算積溫或演替階段，或是作出錯誤的種屬鑒定，往往會導致推算出的結果與實際PMI 之間出現(xiàn)較大偏差，誤導案件偵查方向[6]。因此，無論選用上述兩類經典方法中的哪一類方法來推斷腐敗尸體死亡時間，對嗜尸性昆蟲進行快速且準確的種屬鑒定都是關鍵[7]。本文對嗜尸性蠅類種屬鑒定的各種方法進行綜述，以期為今后相關研究和實踐提供新思路和新方法。

1 形態(tài)學種屬鑒定

在法醫(yī)昆蟲學領域，起初是根據(jù)蠅類形態(tài)學分類特征來鑒定嗜尸性蠅類種屬。傳統(tǒng)的形態(tài)學種屬鑒定方法，主要是結合不同蟲態(tài)的大體或解剖形態(tài)特征來進行鑒別[8]。在國內常見蠅類成蟲與幼蟲大體形態(tài)學分類方面，范滋德[9]與薛萬琦等[10]我國老一輩雙翅目昆蟲學專家已經給出了完美答案。隨著科學技術的發(fā)展，近年來掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）也被廣泛用于嗜尸性蠅類的超微形態(tài)學種屬鑒定[11-14]。

1.1 蠅類成蟲鑒定

蠅類成蟲的形態(tài)學種屬鑒定方法，目前最常用的是在體視顯微鏡或放大鏡下觀察蠅類翅脈形態(tài)、鬃毛排列、間額與側額的寬度比例、觸角形態(tài)與顏色、頰毛與下顎須顏色、上下腋瓣形態(tài)、背部顏色、體表粉被與纖毛顏色、前氣門顏色、尾器形態(tài)等特征差異來進行鑒別[8，15-16]。WALLMAN[17]對澳大利亞南部地區(qū)常見的5 屬25 種麗蠅科蠅類進行了形態(tài)學鑒定研究，結果顯示，根據(jù)蠅類雄性個體的尾器形態(tài)，結合部分蠅種的觸角芒類型、頰毛顏色、翅脈形態(tài)、中鬃與背中鬃的數(shù)量與排布、前頂鬃和足鬃的長短等特征，可對該地區(qū)所有25 種麗蠅科蠅類進行有效鑒定。NIHEI 等[18]對全球常見蠅科蠅類進行了形態(tài)學分屬研究，VAIRO等[19]對巴西南部地區(qū)10 屬22 種麻蠅科蠅類進行了形態(tài)學鑒定研究，這兩個研究的結果與WALLMAN[17]的研究結果相類似。但是，上述幾個研究在部分蠅種的鑒定上過于依賴雄性成蟲尾器形態(tài)，而在動物和人類尸體上活動的主要為雌性蠅類[7，20]，因此在實踐應用中必然會受到較大的限制。AKBARZADEH 等[21]對中東地區(qū)的7 屬26 種麗蠅科蠅類進行了形態(tài)學鑒定研究，與VAIRO 等[19]研究不同的是，AKBARZADEH 等還額外選取了觸角顏色及長寬比、腋瓣顏色及是否有毛、前氣門顏色、翅下大結節(jié)形態(tài)、頰毛顏色、側腹片鬃數(shù)量、腹部背板后緣帶寬窄、中鬃與背中鬃數(shù)量及排布等大量形態(tài)特征標準，并降低了對雄性成蟲尾器的依賴。然而在相關命案偵破實踐中，形態(tài)特征標準增加過多也會導致在命案現(xiàn)場無法進行快捷準確的嗜尸性蠅類種屬鑒定，必須將樣本送到專業(yè)實驗室進行顯微鏡下鑒定，最終影響法醫(yī)昆蟲學的應用推廣。VAIRO 等[20]針對其團隊前期研究[19]和AKBARZADEH等[21]研究的短板，對巴西南部地區(qū)9 種最常見麻蠅的雌性個體進行了進一步研究，發(fā)現(xiàn)僅根據(jù)成蟲腹部背板長寬比及粉被顏色、產卵器形態(tài)等少數(shù)幾個形態(tài)特征標準即可區(qū)分這9 種麻蠅。

隨著SEM 技術的成熟和升級，許多國內外學者也開始嘗試將其應用于嗜尸性昆蟲的種屬鑒定，逐漸形成了超微形態(tài)學種屬鑒定這一子領域。觸角是有瓣蠅類最重要的嗅覺感受器官，不同蠅種的觸角感受器超微形態(tài)可能存在一定的差異，因此可以作為形態(tài)學種屬鑒定的參考標準之一[22]。除了觸角外，成蟲體表還有許多部位，如爪墊和唇瓣齒的超微結構也有種屬鑒定價值。爪墊位于蠅類的前跗節(jié)腹面，是蠅類用于吸附在光滑表面上的特殊器官[23]，不同種屬的蠅類該部位的超微結構存在細節(jié)特征上的差異[24]。張學書等[23]對3種常見的嗜尸性蠅類家蠅Musca domestica、肥軀金蠅Chrysomya pinguis、紅尾糞麻蠅Bercaea cruen?tata的前、中、后足爪墊超微結構進行了比較，結果顯示，家蠅和肥軀金蠅的爪墊腹面中部具有特殊的中空型鏟狀剛毛，肥軀金蠅的鏟狀剛毛末端還具有溝狀的開口，而紅尾糞麻蠅爪墊無此類剛毛，但具有實心的勺狀剛毛。唇瓣齒又稱口緣齒（prestomal teeth），位于成蟲頭部口器最遠端的口盤下表面，是用于撕開尸體表皮促進消化液注入的重要結構[25]。SUKONTASON等[26]對泰國地區(qū)常見的幾種嗜尸性蠅類肥軀金蠅、粗足裸金蠅Achoetandrus villeneuvi、星島金蠅Chrysomya chani、斑跖黑蠅Ophyra chalcogaster以及棕尾別麻蠅Boettcherisca peregrina唇瓣齒超微結構進行了研究，發(fā)現(xiàn)不同蠅類唇瓣齒在細節(jié)特征上存在一定的差異，其超微形態(tài)對于某些近緣的蠅類具有一定的區(qū)分能力，可期成為SEM 下嗜尸性蠅類的形態(tài)學種屬鑒定的關鍵特征標準。

SEM 技術的發(fā)展雖然大大促進了嗜尸性蠅類成蟲形態(tài)學鑒定研究的發(fā)展，但也存在局限性：（1）SEM技術主要適用于研究，加上國內公安一線人員法醫(yī)昆蟲學相關知識普及率不高，在實踐應用時有可能找不到需要重點觀察的部位。（2）高度腐敗尸體案件現(xiàn)場常位于荒郊野外，而國內地縣級刑偵技術部門目前大多僅配備了普通光學顯微鏡或體視顯微鏡，有些地區(qū)甚至未配備任何顯微鏡設備，因此該方法難以在公安一線推廣普及。大體形態(tài)學與超微形態(tài)學種屬鑒定方法在法醫(yī)昆蟲學實踐中各有優(yōu)劣，但存在對蠅類雄性成蟲尾器依賴性強、超微形態(tài)鑒定普及學習成本高、標本送檢耗時等不同的問題，不利于涉命案件的快速、高效偵破，也在一定程度上限制了昆蟲證據(jù)在我國的推廣和普及。基于上述困境，亟待推出一種能夠簡單、快速且準確的鑒定嗜尸性蠅類種屬的新方法，翅的脈相圖就是其中一種。這種方法通過精確測量嗜尸性蠅類的翅脈系統(tǒng)的長短、方向和排列方式，能夠對一些常見的具有法醫(yī)學重要蠅類進行有效的種屬鑒定[27-32]。LYRA 等[27]借用了其他科昆蟲借助翅脈識別的思路，使用典型變量分析（canonical variate analysis，CVA）對巴西與烏拉圭地區(qū)常見能引起蠅蛆癥的嗜人錐蠅Cochliomyia hominivorax和次生錐蠅Cochliomyia macellaria進行鑒別，結果顯示，根據(jù)翅脈相圖可以100%區(qū)分2 種錐蠅，因此認為，翅脈的差異可以作為上佳的形態(tài)學指標用于蠅類種屬鑒定。SONTIGUN 等[28-29]在單一CVA 的基礎上進行了改進，采用了兩個CVA 組合分別對泰國境內具有重要法醫(yī)學意義的12 種麗蠅科和12 種麻蠅科蠅類進行了種屬鑒定研究，結果顯示：在屬一級，雙CVA 組合對麻蠅科識別準確率達到89.7%～100%，麗蠅科則高達94.3%～100%；在種一級，除胖葉帶綠蠅Hemipyrellia pulchra外的其他11 種麗蠅科蠅類識別準確率均達到70%以上，而麻蠅科則有多種麻蠅之間的識別準確率低于70%。SONTIGUN 等認為，雙CVA 組合識別準確率高，操作簡單，對于常見嗜尸性蠅類的種屬鑒定具有里程碑式的意義。MACLEOD等[30]采用了另一種思路，使用主成分分析（principal component analysis，PCA）結合CVA 對蛆癥金蠅Chrysomya bezziana、大頭金蠅Chrysomya megacephala和緋顏裸金蠅Chrysomya ru?fifacies成蟲進行種屬鑒定研究，結果顯示，該方法對于種一級鑒定準確率達到91%。LóPEZ-GARCíA等[31]采用了類似的方法對新北界和古北界地區(qū)的12 種酪蠅科蠅類進行種屬鑒定研究，結果顯示，該方法種屬鑒定準確率達到83.33%～100.00%。雖然該方法僅需在光學顯微鏡下對蠅類標本的翅相進行拍照并測量，但目前在種一級鑒定準確率仍然偏低[29，32]，還需進一步改進和提高才能有效應用于法醫(yī)昆蟲學實踐。

1.2 蠅類幼蟲鑒定

蠅類幼蟲俗名蠅蛆，在圍繞動物尸體構建的嗜尸性昆蟲群落中，蠅蛆在尸體腐敗早期往往占據(jù)絕對數(shù)量優(yōu)勢，并且其發(fā)育時間往往與死者的真實死亡時間接近，因此成為法醫(yī)昆蟲學研究者最常用于PMI 推斷的昆蟲證據(jù)類型[33-34]。成蟲因具有大量鬃毛、有色粉被和剛毛、獨特的翅脈以及其他一些較易分辨的大體形態(tài)特征，在體視顯微鏡甚至高倍放大鏡下就能進行快速準確的鑒定。與成蟲相比，幼蟲體表除前后氣門外，相對缺乏這類容易識別的大體形態(tài)特征，因此需要借助幼蟲所獨有的一些特殊器官的形態(tài)特征來鑒別。目前，對嗜尸性蠅類幼蟲的種屬鑒定主要依靠口咽器、氣門的形態(tài)和細節(jié)特征。此外，幼蟲胸部與腹部各節(jié)棘的形態(tài)和排布、各腹節(jié)是否有錐狀肉突或微棘、微毛、微疣等也是部分種屬幼蟲形態(tài)學鑒定的關鍵特征[35]。

20 世紀80 年代，O’FLYNN 等[36-37]在探索各種嗜尸性蠅類幼蟲的種屬鑒定要點時就聚焦于口咽器的大體形態(tài)?？谘势饔址Q頭咽骨，是由成對的口鉤、“H”形的下口骨、體積最大的分叉形咽骨以及一些細小骨片組成，是蠅蛆用于分解尸體組織的最主要器官[8，38]。SZPILA 等[39]在普 通光鏡下對紅頭麗蠅Cal?liphora vicina、伏蠅Phormia regina和亮綠蠅Lucilia illustris的一齡幼蟲口咽器形態(tài)特征進行了對照研究，結果顯示，3 種蠅類幼蟲的口咽器形態(tài)完全不同。紅頭麗蠅與亮綠蠅的一齡幼蟲口鉤呈較典型的“L”形，而伏蠅一齡幼蟲的口鉤僅出現(xiàn)遠端雛形；紅頭麗蠅幼蟲下口骨堤部較伏蠅和亮綠蠅寬，但咽骨背堤部卻較伏蠅和亮綠蠅窄。3 種蠅類中，伏蠅幼蟲的咽骨體最為粗壯，咽骨背角和腹角也是三者中最尖銳的。SZPILA 等[40]此后又對3 種金蠅屬一齡幼蟲進行了類似的對照研究，結果顯示，3 種不同金蠅屬蠅類幼蟲的口咽器均具有種屬特異性。上述研究結果說明，口咽器的種屬特異性非常高，可以作為嗜尸性蠅類幼蟲種屬鑒定的形態(tài)特征標準單獨使用。但從另一角度來看，蠅類幼蟲口咽器體積微小、結構復雜，在光鏡下鑒定時還需要采取特殊的前處理[38]，對于一線鑒定人員而言難以掌握。

氣門是蠅類幼蟲的重要呼吸器官，前氣門的大小、形狀和孔突數(shù)目、排列方式，以及后氣門的大小、形狀、深度、兩氣門間距、氣門環(huán)完整性，氣門裂的形狀、大小、排列方式，以及氣門鈕的有無等大體形態(tài)特征都是分類學上的重要依據(jù)[8，41-42]。對醬亞麻蠅Para?sarcophaga dux[43]、緋顏裸金蠅[44]、蛆癥金蠅[45]、大頭金蠅[46]、瘦葉帶綠蠅Hemipyrellia ligurriens[47]、紫綠蠅Lu?cilia porphyrina[48]、擬斑翅巨尾蠅Hypopygiopsis tum?rasvini[49]、中華綠蠅Lucilia sinensis[50]、星島金蠅[51]、瘦突巨尾蠅Hypopygiopsis infumata[52]等具有重要法醫(yī)學意義的蠅類不同齡期幼蟲的研究結果顯示，在SEM下不同種屬的蠅類幼蟲前后氣門超微形態(tài)存在顯著差異，即使是遺傳學上近緣的各種金蠅或綠蠅之間，幼蟲后氣門在三齡期時也存在細節(jié)特征方面的差異[51]。因此，嗜尸性蠅類幼蟲的前后氣門超微形態(tài)可以作為形態(tài)學種屬鑒定的重要參考依據(jù)。與歐美同類研究相比，泰國SUKONTASON 團隊[43-52]的系列研究更聚焦于東亞和東南亞地區(qū)嗜尸性蠅類重點種屬，研究方法也是一脈相承且不斷更新，對我國相關研究與實踐更具有指導價值。

除了口咽器和氣門，第三種較為重要的嗜尸性蠅類幼蟲形態(tài)分類特征是其第8～10 腹節(jié)上著生的各種棘突和疣的形態(tài)和排列方式[8]。有些嗜尸性蠅類的整個幼蟲階段一直有較明顯的棘突或疣狀突起。SANIT 等[50]在對中華綠蠅幼蟲進行形態(tài)學研究時發(fā)現(xiàn)，該蠅種幼蟲的第8 腹節(jié)在一齡階段已發(fā)育出長圓錐狀的下側突（outer ventral tubercle），二齡時第8 腹節(jié)上的其他棘突也開始出現(xiàn)，到三齡時下側突已形成肉眼可見的巨大角狀棘突。即使幼蟲化蛹后，仍然能在蛹殼后端肉眼觀察到該棘突的殘留突起。PA?OS等[53]在SEM 下對大斑酪蠅Piophila megastigmata幼蟲進行超微形態(tài)研究時也觀察到類似的情況，該蠅種幼蟲的第10 腹節(jié)亞肛疣（subanal papillae）自一齡階段就非常發(fā)達，到三齡時形成放大鏡下可見的角狀棘突，在蛹期也有少許殘留。然而，并非所有嗜尸性蠅類的幼蟲腹節(jié)棘突或疣狀突起都有類似的變化。MENDON?A 等[54]對銅綠蠅Lucilia cuprina幼蟲進行超微形態(tài)研究時發(fā)現(xiàn)，該蠅種幼蟲在一齡階段腹節(jié)上的各種棘突和疣只表現(xiàn)為輕微的隆起，二齡時第10腹節(jié)才出現(xiàn)隆起的肛疣群，到三齡階段第8 腹節(jié)上才出現(xiàn)較明顯的鈍圓錐狀棘突群。GRZYWACZ 等[55]在SEM 下對東方芒蠅Atherigona orientalis幼蟲進行了形態(tài)學研究，發(fā)現(xiàn)該蠅種幼蟲一齡、二齡階段腹節(jié)無明顯棘突和疣，發(fā)育到三齡時第8 腹節(jié)才出現(xiàn)較小的疣狀突起。CORTINHAS 等[56]對古銅黑蠅Ophyra aenescens不同齡期的幼蟲進行了觀察，其研究結果與東方芒蠅Atherigona orientalis[55]相類似，直到三齡時古銅黑蠅幼蟲第8 腹節(jié)才出現(xiàn)不甚明顯的疣狀突起。上述幾種蠅類幼蟲因棘突和疣較小甚至不明顯，在幼蟲化蛹時往往因為表皮回縮而僅余少許小疣殘留。嗜尸性蠅類幼蟲腹節(jié)上的棘突和疣隨蟲齡增長而逐漸出現(xiàn)并變化，但由于許多蠅種的幼蟲棘突和疣較小或不明顯，因此該種形態(tài)分類特征一般僅適用于部分三齡和二齡階段的幼蟲。

傳統(tǒng)的嗜尸性蠅類幼蟲的形態(tài)學種屬鑒定主要依靠上述三類形態(tài)分類特征。近年來，也有部分學者另辟蹊徑，從蠅類幼蟲表皮上的肌肉組織附著點數(shù)量和排列模式情況來進行判斷。NIEDEREGGER 等[57]將歐洲戶外常見的3 種麗蠅科蠅類新陸原伏蠅Proto?phormia terraenovae、紅頭麗蠅和反吐麗蠅Calliphora vomitoria幼蟲蠅蛆的表皮從肌肉組織上剝離后用考馬斯亮藍染色，在體視顯微鏡下觀察了表皮上肌肉組織著生點的數(shù)量和排列模式，結果顯示，3 種麗蠅科蠅類幼蟲的第1～3 胸節(jié)和第1 腹節(jié)表皮上的肌肉著生點數(shù)量和排列模式均存在顯著差異。蠅類幼蟲表皮上肌肉著生點具有種屬特異性，可以作為種屬鑒定的形態(tài)特征標準單獨使用[58]。在這一開創(chuàng)性的研究成果基礎上，NIEDEREGGER 團隊還對多種綠蠅屬[59]、酪蠅族[60]、麻蠅屬[61]和污蠅屬[62]蠅類幼蟲進行了系列研究，進一步證實了該方法的有效性。上述研究中采用的染色方法簡單快速，對光學設備的要求也不高，且可聯(lián)合計算機圖像識別的方法進一步簡化，具有較強的實踐價值。但是，將蠅蛆表皮和肌肉組織完整分離仍然需要一定的操作技巧和經驗，因此必須對相關人員進行統(tǒng)一的技術培訓才能進一步推廣。

1.3 蠅卵和蠅蛹鑒定

雖然蠅蛆一般是命案現(xiàn)場中數(shù)量最大的昆蟲蟲態(tài)，但有時在尸體上下表面、衣物上或附近泥土砂石中僅能見到蠅卵或蠅蛹[63-65]。在這類情況下，如果等待幼蟲從蠅卵中孵化或成蟲從蛹中羽化再進行種屬鑒定，可能會錯過案件偵破最佳窗口期。與成蟲和幼蟲相比，蠅卵體積較小，其表面具有的種屬特異性形態(tài)特征相也對較少。王江峰等[63]對絲光綠蠅Lucilia sericata、大頭金蠅、巨尾阿麗蠅Aldrichina grahami和廄腐蠅Muscina stabulans的卵表面超微結構進行了形態(tài)學分類研究，認為蠅卵的大小、表面形態(tài)、中區(qū)、孵出線、卵孔和垂柱等超微形態(tài)特征可用于區(qū)分常見的一些嗜尸性蠅類。該研究的對象分屬4 個不同屬的蠅類，因此有足夠的種屬間形態(tài)差異來進行區(qū)分。然而，同一屬的近緣蠅種是否還能借助這些超微形態(tài)特征差異來進行分類仍然需要相關研究來驗證。SANIT 等[64]針對該問題進行了進一步研究，對比了緋顏裸金蠅、大頭金蠅、肥軀金蠅Chrysomya pinguis、擬斑翅巨尾蠅Hypopygiopsis tumrasvini、銅綠蠅Lucilia cuprina、紫綠蠅、烏足錫蠅Ceylonomyia nigripes和家蠅Musca domestica的卵超微形態(tài)差異，研究結果顯示，在光鏡下經高錳酸鉀溶液染色處理的緋顏裸金蠅、大頭金蠅與肥軀金蠅卵形態(tài)極為相似，擬斑翅巨尾蠅、銅綠蠅與紫綠蠅的卵三者間也較難區(qū)分，即使在超高倍的SEM 下，大頭金蠅與肥軀金蠅的卵中區(qū)寬度與平滑程度、卵殼表面多邊形網(wǎng)狀紋飾的形態(tài)以及微孔結構也都非常近似。目前對近緣種的嗜尸性蠅卵進行形態(tài)學種屬鑒定仍然存在較大的難度，需要遺傳學鑒定方法來輔助。

嗜尸性蠅類的三齡幼蟲在發(fā)育成熟后，往往會爬離尸體尋找隱蔽處化蛹[7]。在化蛹的過程中，幼蟲表皮皺縮硬化，體長變短，體圍變粗，頭部往往會縮成鈍圓錐狀，最終形成圍蛹[10]。與蠅卵相比，蠅蛹的體積較大，且蛹殼表面仍然保留有許多源于老熟三齡幼蟲的體表形態(tài)特征，如前后氣門、第8～10 腹節(jié)的棘突和疣等，此外有些蠅類蛹殼胸部表面還會向外突出演化成一對呼吸角[65-66]。上述這些蛹殼表面超微形態(tài)特征與幼蟲一樣具有較高的種屬特異性，因此其種屬鑒定難度遠遠低于蠅卵。國外對嗜尸性蠅類蛹殼形態(tài)研究較早的是O’FLYNN 等[36]和ERZINCLIOGLU 等[37]，國內則是薛瑞德等[67-68]。這些早期研究主要關注的是體視顯微鏡下的蛹殼表面大體形態(tài)特征以及蛹頭部的頭咽骨解剖形態(tài)特征。隨著SEM 技術的普及，該技術開始大規(guī)模用于蠅蛹的超微形態(tài)研究。然而，近3 年該領域的相關研究[13，52，66]與15 年前同類研究[45，69-70]相比并無本質上的提升，大部分是使用SEM 技術對不同蠅類蛹殼進行橫向拓展研究，僅在圖像分辨率和某些蛹殼表面超微形態(tài)細節(jié)上有所加強。

2 分子生物學鑒定

自20 世紀70 年代，歐美地區(qū)大范圍開展法醫(yī)昆蟲學研究并實踐應用至今，基于形態(tài)學分類的種屬鑒定方法一直是嗜尸性昆蟲種屬鑒定的“金標準”[4，7]。然而，要能較準確地對嗜尸性蠅類尤其是幼蟲和蛹進行形態(tài)學種屬鑒定，除了必須具備專業(yè)且系統(tǒng)的蠅類分類學知識外，有些蠅類如麻蠅科幼蟲通常需要一定的時間來等待成蟲羽化才能進行鑒定[3]，有些麻蠅科雌性成蟲甚至無法有效區(qū)分[71]。此外，刑事偵查人員有時在命案現(xiàn)場中采集到的蠅類成蟲或蠅蛆樣本不完整，導致嗜尸性蠅類形態(tài)學種屬鑒定難上加難。為了補齊上述實踐中存在的這些短板，一些法醫(yī)昆蟲學研究者開始另辟蹊徑，分子生物學技術就是其中最重要的一種思路。

加拿大學者SPERLING 等[72]最早報道了通過分子生物學技術來鑒定嗜尸性蠅類種屬的方法，采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）結合限制性酶切片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）進行了序列分析，首次證實了DNA 測序方法可以用于嗜尸性蠅類屬一級的鑒定，并確認了mtDNA 的COⅠ、COⅡ片段及其對應的亮氨酸轉運RNA（transfer RNA，tRNA）片段是最主要的差異，由此拉開了國內外該領域研究的序幕。此后，歐洲[73-79]、澳大利亞[80-86]、南美與北美[87-90]、中國[91-118]、泰國[119-120]、韓國[121]、日本[122]、印度[123]、南非[84，124]等國家和地區(qū)的法醫(yī)昆蟲學研究者陸續(xù)對麗蠅科、麻蠅科、蠅科、蚤蠅科以及糞蠅科等較為重要的嗜尸性蠅類種屬進行了細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ（cytochromecoxi?dase subunit Ⅰ，COⅠ）、COⅡ片段種屬特異性研究。然而，COⅠ與COⅡ片段雖然能將常見的嗜尸性蠅類有效區(qū)分至屬一級，但對于絲光綠蠅和銅綠蠅這類近緣種，其在自然界中就存在突破生殖隔離的雜交現(xiàn)象[125]，因此僅應用COⅠ與COⅡ片段難以達到有效鑒定。此后，部分學者開始選擇核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）28S[126]、16S rRNA[98，106，108，110]或第二內轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer 2，ITS2）[80，82，121]片段，線粒體還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基1（reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehy?drogenase subunit 1，簡稱ND1）[104]、線粒體ND4[83]或線粒體ND5[107]片段，以及核染色體組生物鐘基因period[103]等不同的基因序列來進行種屬鑒定，這些片段各有優(yōu)劣，但尚無法完全替代COⅠ與COⅡ片段。隨著近年來基因測序技術的逐漸成熟，該技術也開始被廣泛用于嗜尸性蠅類的種屬鑒定[88，94，96，100]，達到了更好的近緣種區(qū)分效果，但經濟成本偏高。由于上述這些研究采用的檢測方法較為相似，我國學者在該領域研究情況見表1。

表1 近年來我國嗜尸性蠅類分子生物學種屬鑒定研究情況Tab.1 Studies on identification of sarcosaprophagous flies by molecular biology methods in recent years

前述的PCR-RFLP 序列分析法鑒定嗜尸性蠅類種屬目前仍然是主流，部分學者也曾嘗試采用隨機擴增多態(tài)性DNA（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）[127]、擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）[128]、內含子特異靶向性[115]、簡單重復序列多態(tài)性（simple sequence repeat poly?morphism，SSRP）與序列特異擴增區(qū)域（sequence characterized amplified region，SCAR）[115]等分子生物學技術來提高種屬鑒定的系統(tǒng)效能，但這些方法與PCR-RFLP 法相比并不存在絕對的優(yōu)勢。

與形態(tài)學種屬鑒定方法相比，分子生物學方法有時鑒定更加精準，但也存在標本送檢耗時、經濟成本高等問題。因此，該類方法僅適用于科學研究和破案時限較為寬松的案件，難以大規(guī)模推廣應用。

3 總結與展望

法醫(yī)昆蟲學相關研究已在我國開展了25 年，取得了相當豐碩的成果。然而，由于死亡時間推斷在很長一段時間都屬于公安偵查階段的證據(jù)，加上我國公安一線刑偵技術人員的法醫(yī)昆蟲學知識普及率較低，因此根據(jù)昆蟲學證據(jù)推斷PMI 的方法之前沒有大范圍推廣。2020 年5 月司法部印發(fā)《法醫(yī)類司法鑒定執(zhí)業(yè)分類規(guī)定》（司規(guī)〔2020〕3 號），才正式明確了法醫(yī)昆蟲學方法可以作為法醫(yī)病理學死亡時間司法鑒定的技術手段。該文件的頒布，使昆蟲學證據(jù)終于能夠合法有效地用于法庭審判階段，法醫(yī)昆蟲學研究和應用也必將迎來新一輪高潮。但是，法醫(yī)昆蟲學要推廣普及，首先必須解決的問題仍然是嗜尸性蠅類各蟲態(tài)的種屬鑒定。本文綜述的各種形態(tài)學和分子生物學種屬鑒定方法各有優(yōu)劣，配合使用才能優(yōu)勢互補。隨著近年來支持向量機（support vector machine，SVM）、卷積神經網(wǎng)絡（convolutional neural network，CNN）等智能算法的興起和蛋白質譜、二代測序技術的逐漸普及，嗜尸性蠅類形態(tài)學與分子生物學種屬鑒定方法必將更加精準，屆時近緣種的鑒別難題也有望得到突破。此外，表皮碳氫化合物差異用于嗜尸性昆蟲分類鑒定近年來時有報道[129-133]，這類研究從生物化學角度入手，為嗜尸性蠅類的種屬鑒定提供了形態(tài)學和分子生物學以外的新思路。