中藥育發(fā)洗劑對C57BL/6小鼠毛發(fā)生長影響的實驗研究

王愛娟 胡慧 馮放 羅莎 曲保全 吳瑞英 楊頂權

[摘要]目的：研究中藥育發(fā)洗劑對C57BL/6小鼠毛發(fā)、毛囊生長周期的影響。方法：40只C57BL/6小鼠以脫毛膏脫毛2cm×4cm面積大小造模，造模成功后次日分5組（n=8）：模型組、生理鹽水組、空白洗劑組、米諾地爾組、中藥育發(fā)洗劑組，每日涂抹給藥1次，持續(xù)18d。每日同一光源下拍照1次，觀察目標區(qū)小鼠皮膚顏色變化、毛發(fā)生長情況;每日固定時間毛發(fā)鏡檢測4次，記錄毛發(fā)鏡下皮膚顏色變化直至小鼠毛發(fā)長度影響檢測效果;第18天取小鼠背部毛發(fā)測量毛長，取背部組織HE染色觀察毛囊數量、毛囊形態(tài)、皮膚真皮層厚度。結果：中藥育發(fā)洗劑組可減少小鼠皮膚由粉色到黑色的變化時間，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。第18天毛發(fā)長度，中藥育發(fā)洗劑組與米諾地爾組相當（P>0.05），且較其他各組長，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組、生理鹽水組、空白洗劑組相比較，中藥育發(fā)洗劑組皮膚真皮層厚度明顯增加，毛囊數目增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：中藥育發(fā)洗劑可加快小鼠毛發(fā)生長、促進小鼠毛囊生長期轉化進程，且其療效與米諾地爾相當。

[關鍵詞]中醫(yī)藥;洗劑;米諾地爾;C57BL/6小鼠;毛發(fā);毛囊;脫發(fā)

[中圖分類號]R285.5? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）07-0089-05

Effects of Traditional Chinese Medicine Yufa Lotion on Hair Growth of C57BL/6 Mice

WANG Ai-juan1，HU Hui2，F(xiàn)ENG Fang1，LUO Sha1，QU Bao-quan1，WU Rui-ying1，YANG Ding-quan3

（1.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China;2.Department of Acupuncture， Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China;3.Department of Dermatology and Venereology， China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China）

Abstract： Objective? To observe the effect of traditional Chinese medicine Yufa lotion on hair growth of C57BL/6 mice. Methods? 40 C57BL/6 mice were depilated with an area of 2cm×4cm to induce the mouse hair follicles to enter the growth phase from the resting phase. The next day was divided into 5 groups （n=8）： the model group， the normal saline group， the blank lotion group， the minoxidil group， and the traditional Chinese medicine Yufa lotion group. They were applied once a day for 18 days. Taked pictures each day to observe the skin color changes and hair growth of the mice. On the 18th day， the back hair of the mice was taken to measure the hair length， and the back tissue was taken for HE staining to observe the number of hair follicles， the shape of hair follicles， and the thickness of the skin dermis. Results? The traditional Chinese medicine Yufa lotion group can shorten the change time of mouse skin from pink to black， and the differences were statistically significant （P<0.05）. After compared the hair length on the 18th day， the traditional Chinese medicine Yufa lotion group and the minoxidil group was equivalent （P>0.05）. And longer than the other groups （P<0.05）. Compared with the model group， the normal saline group， and the blank lotion group， the thickness of the skin dermis and the number of hair follicles in the traditional Chinese medicine Yufa lotion group were significantly increased （P<0.05）. Conclusion? Traditional Chinese medicine Yufa lotion can promote mouse hair follicles to enter the growth phase earlier， and its curative effect is equivalent to minoxidil.

Key words： traditional Chinese medicine; lotion; minoxidil; C57BL/6 mice; hair; hair follicle; alopecia

中藥育發(fā)洗劑是以中日友好醫(yī)院科內經驗組方為核心藥物制作的外用洗劑，具有活血化瘀、除濕殺蟲、生發(fā)烏發(fā)之效，用于各種脫發(fā)性疾病的局部治療，其藥物組成為丹參、苦參、川芎、白鮮皮、補骨脂、制首烏、薄荷、甘草。目前脫發(fā)性疾病的外用治療藥物只有米諾地爾被廣泛使用[1]，但是單一的局部用藥遠不能滿足臨床需求，尋求更加積極的外用藥以擴充臨床治療手段是非常具有現(xiàn)實意義的。中藥育發(fā)洗劑經前期臨床驗證治療脫發(fā)性疾病安全有效，本研究主要從小鼠皮膚顏色變化、毛發(fā)生長速度、毛囊形態(tài)、真皮層厚度以及毛囊數量幾個方面觀察中藥育發(fā)洗劑對毛發(fā)生長的作用從而為臨床治療提供一些思路。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物：40只雌性C57BL/6小鼠，體質量（20±2）g，6～8周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[編號：SCXK（京）2012-0001]。飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床研究所動物飼養(yǎng)室（SPF級），溫度（22±1）℃，濕度（50土5）%，每日通風1～2次，每次持續(xù)1h左右，小鼠有足夠的活動空間、正常飲水及進食，適應性飼養(yǎng)1周后實驗。

1.2 藥品及試劑：中藥育發(fā)洗劑，200克/瓶，洗劑藥物組成：丹參3份、苦參3份、川芎2份、白鮮皮2份、補骨脂2份、制首烏2份、薄荷1份、甘草1份。藥物加工委托中日友好醫(yī)院制劑中心，劑型委托北京麗倍生科技有限責任公司制作;空白洗劑，200克/瓶，無中藥成分，與中藥育發(fā)洗劑同批次同生產方制作;米諾地爾酊5%（90ml：4.5g），浙江萬晟藥業(yè)有限公司（生產批號：國藥準字H20010714）;組織固定液，湖北泰康醫(yī)療設備有限公司（生產批號：20150039）;Veet脫毛膏，100克/瓶，利潔時（法國）有限公司（生產批號：2013-12-04 173）。

1.3 主要儀器：正置熒光顯微鏡（廣東艾斯拓鼎，型號：ASTD）;電子數顯游標卡尺（桂林廣陸，型號：211-102F）;皮膚毛發(fā)觀察儀（南京倍寧，型號：BN-PFMF-8001）。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組：將小鼠隨機分為5組，每組8只。分別為①模型組;②生理鹽水組（陰性對照組）;③空白洗劑組（劑型對照組）;④中藥育發(fā)洗劑組（實驗組）;⑤米諾地爾組（陽性對照組）。

1.4.2 動物模型的建立及干預方案：以平行脊椎為長軸方向，將小鼠背部毛發(fā)先剪短，再涂抹脫毛劑，然后擦掉脫毛劑以及脫落的毛發(fā)制作2cm×4cm的脫毛區(qū)進行造模，造模成功的小鼠皮膚顏色粉紅，表面光滑，無破潰、黑色素沉著等現(xiàn)象。造模次日進行干預，模型組不予處理，其他各組局部皮膚直接用棉簽涂抹給藥，涂擦5min后生理鹽水清洗干凈。藥物用量遵循實驗動物與人體間的等效劑量換算標準，約0.4毫升/只，每日定時給藥1次，連續(xù)給藥18d。

1.5 指標檢測

1.5.1 觀察結果：每日觀察并記錄小鼠皮膚顏色變化，并于同一光源下進行拍照，記錄各組小鼠背部觀察區(qū)皮膚狀況，包括皮膚基本生理特征以及顏色變化;每日固定時間毛發(fā)鏡檢測4次，記錄毛發(fā)鏡下皮膚顏色變化直至小鼠毛發(fā)長度影響檢測效果;第18天隨機取10處新生毛發(fā)，使用百分電子數顯游標卡尺進行測量并記錄。

1.5.2 HE染色：在涂藥第18天，取小鼠觀察區(qū)皮膚約2cm×2cm面積大小，進行常規(guī)組織脫水、石蠟包埋、切片、HE染色（蘇木精-伊紅染色），通過電子顯微鏡與NIS-Elements BR軟件聯(lián)用，在顯微鏡下觀察小鼠真皮層厚度、毛囊個數以及形態(tài)學變化。觀察毛囊橫斷面和縱切面，制片時取同一水平面的皮膚橫斷面統(tǒng)計毛囊總數，每張切片取3個視野。

1.6 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均值±標準差（x?±s）表示，采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1 五組小鼠皮膚顏色變化：給藥后經照片與毛發(fā)鏡雙重檢測，各組小鼠皮膚顏色均由粉色轉為灰色再到黑色，除模型組外其余各組皮膚顏色變化均有不同程度的加快。經比較各組皮膚顏色由粉色到黑色的時間，中藥育發(fā)洗劑與米諾地爾變色時間相當（P>0.05），這兩組較其他三組變色時間短，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 五組小鼠第18天毛發(fā)長度：第18天各組隨機收集觀察區(qū)10處毛發(fā)，除模型組外其余4組毛發(fā)長度均顯著增長（P<0.05）;中藥育發(fā)洗劑與米諾地爾這兩組明顯長于其他三組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3 五組小鼠真皮厚度、毛囊數量：HE染色后，于顯微鏡下觀察毛囊縱切面及同一水平橫斷面。觀察縱切面模型組毛囊稀疏，位于表皮和真皮交界處，黑色素稀疏;而中藥育發(fā)洗劑組真皮變厚，毛囊根部向下長至真皮層深處。同一水平橫斷面比較各組毛囊數量，中藥育發(fā)洗劑與米諾地爾兩組明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3? 討論

脫發(fā)為皮膚科常見病，其臨床現(xiàn)狀整體呈高發(fā)病率低有效率、治療療程長藥物種類單一、投入遠大于獲益等特點。由于口服藥品種的單一性和各種副作用的局限性[2-3]，目前脫發(fā)性疾病的研究熱點趨向外治法。本研究所用中藥育發(fā)洗劑藥物組成為丹參、苦參、川芎、白鮮皮、補骨脂、制首烏、薄荷、甘草，全方共奏活血化瘀、除濕殺蟲、生發(fā)烏發(fā)之效?，F(xiàn)代藥理學研究表明，丹參有明顯降低血液粘稠度的作用，可加快局部代謝擴張微血管促進細胞氧和能力[4]，能有效為毛囊提供營養(yǎng)成分。丹參甲醇水提物丹參酮有類雌激素樣作用可抗雄激素[5]，同時經研究發(fā)現(xiàn)丹參酮對免疫功能亦具有一定的調控作用[6]?？鄥⒏稍锔囊掖妓嵛锟赏ㄟ^誘導小鼠真皮乳頭中的生長因子來促進毛囊向生長期轉換，從而促進毛發(fā)生長，另外，苦參提取物還有抑制Ⅱ型5α-還原酶活性的作用[7]。川芎乙醇提取物具有調節(jié)血小板聚集速率的作用，如果用于局部治療，可改善局部血液循環(huán)起到活血祛瘀促進毛發(fā)生長的作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)首烏水提物作用于小鼠，可以改變毛發(fā)生長過程中的成纖維生長因子、β-連環(huán)蛋白等相關因子含量來阻止毛囊進入休止期從而促進小鼠背部毛發(fā)生長[9]，補骨脂能增加血液中雌二醇以及卵泡生成素達到抗雄作用[10]。薄荷具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗真菌、抗病毒等作用[11]，且其有效成分薄荷醇和薄荷腦可通過改變皮膚角質層的結構來促進藥物吸收，常常作為外用藥物的滲透劑使用[12]。

此次試驗選用的實驗動物為C57BL/6小鼠，小鼠表皮顏色呈現(xiàn)“黑色皮膚”、“灰色皮膚”、“粉紅色皮膚”可對應其毛囊的生長期、退行期、休止期，是觀察毛發(fā)生長、毛囊生長周期的天然模型之一。一般生長期是小鼠毛囊活動旺盛時期，代謝活躍，露出表皮的毛干飽含黑色素，休止期則代謝停止直至毛發(fā)自然脫落，這與人類的毛發(fā)生長規(guī)律相一致[13]。在C57BL/6小鼠表皮細胞中，所有黑色素只儲存于毛囊中，源自神經嵴的黑素干細胞在生長發(fā)育過成中經由真皮層轉移到表皮層再隨著退行期黑素細胞的凋亡而重新遷移到毛囊的次生區(qū)域[14]，這一系列反應可較直觀的經由小鼠皮膚顏色變化進行觀察。

本實驗通過設立不同的組別觀察對比中藥育發(fā)洗劑對小鼠毛發(fā)生長的影響，以小鼠皮膚粉色轉為黑色的時間、第18天毛發(fā)生長的長度、HE染色后真皮厚度以及毛囊個數為主要指標，比較分析后發(fā)現(xiàn)中藥育發(fā)洗劑可以減少小鼠皮膚顏色變化的時間，能促進毛發(fā)生長速度（P<0.05），HE染色后實驗各組的毛囊根部深入真皮層，而模型組的毛囊在真皮與表皮的交界處也與小鼠皮膚顏色變化、毛發(fā)長度表現(xiàn)一致，實驗組與模型組差異明顯（P<0.05），經小鼠拍攝照片、毛發(fā)鏡檢測與病理組織涂片相互驗證，說明中藥育發(fā)洗劑可以加快小鼠毛囊由休止期向生長期的轉化進程，促進小鼠毛發(fā)生長，且其療效與米諾地爾相當。

[參考文獻]

[1]Jimenez-Cauhe J，Saceda-Corralo D，Rodrigues-Barata R，et al.Safety of low-dose oral minoxidil treatment for hair loss. A systematic review and pooled-analysis of individual patient data[J].Dermatol Ther，2020，33（6）：e14106.

[2]Pallotti F，Senofonte G，Pelloni M，et al.Androgenetic alopecia： effects of oral finasteride on hormone profile，reproduction and sexual function[J].Endocrine，2020，68（3）：688-694.

[3]Traish AM.Post-finasteride syndrome： a surmountable challenge for clinicians[J]. Fertil Steril，2020，113（1）：21-50.

[4]占鉆，曹春水，江娟，等.復方丹參注射液對大鼠心肺復蘇后凝血功能及血液流變學的影響[J].重慶醫(yī)學，2019，48（15）：2524-2527.

[5]Jin J，Hu Qiao-Yun， Wen-wen Xu， et al.Tanshinone ⅡA attenuates estradiol-induced polycystic ovarian syndrome in mice by ameliorating FSHR expression in the ovary[J].Exp Ther Med，2019，17（5）：3501-3508.

[6]滕雅娟，張燕，譚志敏，等.丹參酮聯(lián)合優(yōu)甲樂對橋本甲狀腺炎伴甲狀腺功能減退患者免疫功能的影響[J].西部中醫(yī)藥，2019，32（3）：102-105.

[7]Roh SS，Kim CD，Lee MH，et al.The hair growth promoting effect of Sophora flavescens extract and its molecular regulation[J].J Dermatol Sci，2002，30（1）：43-49.

[8]姚藝新，華芳，洪遠林，等.川芎藥材、飲片及其中成藥抗血小板聚集活性的生物檢定方法學研究[J].中草藥，2017，48（11）：2249-2253.

[9]Li Y，Han M，Lin P，et al.Hair growth promotion activity and its mechanism of polygonum multiflorum[J].Evid Based Complement Alternat Med，2015，2015：517901.

[10]林桂濤，李榮偉，耿子凱，等.補骨脂水及乙醇提取物雌激素樣作用的比較[J].中成藥，2016，38（12）：2688-2691.

[11]劉琳玉，牛之函，任艷利.薄荷精油對幾種植物病原真菌的抑制作用研究[J].安徽農學通報，2020，26（21）：90-93，99.

[12]關波，皇甫俊茹，徐媛，等.不同促透劑對根皮素體外透皮吸收的影響[J].中國醫(yī)藥導報，2019，16（32）：4-8.

[13]Sennett R，Rendl M.Mesenchymal-epithelial interactions during hair follicle morphogenesis and cycling[J].Semin Cell Dev Biol，2012，23（8）：917-927.

[14]Nishimura EK，Suzuki M，Igras V，et al.Key roles for transforming growth factor beta in melanocyte stem cell maintenance[J].Cell Stem Cell，2010，6（2）：130-140.

[收稿日期]2020-09-24

本文引用格式：王愛娟，胡慧，馮放，等.中藥育發(fā)洗劑對C57BL/6小鼠毛發(fā)生長影響的實驗研究[J].中國美容醫(yī)學，2021，30（7）：89-93.