森林腦炎病毒單克隆抗體的研制及抗原定量雙抗體夾心E L I SA檢測方法的建立和應(yīng)用

吳月，韓順子，唐劍光，張秀霞，吳曉娟，孫宏亮，曹玉鋒，常軍亮，鄒勇

長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長春 130012

森林腦炎又稱蜱傳腦炎（tick-borne encephalitis，TBE），是由森林腦炎病毒（tick-borne encephalitis virus，TBEV）引起的以侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的一種自然疫源性疾?。?］。TBEV包含3種結(jié)構(gòu)蛋白（C、prM、E），其中E蛋白是病毒最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性抗體［2-3］，參與宿主的保護(hù)性免疫應(yīng)答［4-6］。接種森林腦炎疫苗是預(yù)防TBE的最有效手段。

TBEV抗原含量是森林腦炎疫苗原液檢定的主要指標(biāo)之一［7］。在疫苗生產(chǎn)過程中，需對不同階段病毒抗原含量進(jìn)行監(jiān)測。目前，國內(nèi)尚未見商品化TBEV抗原ELISA檢測試劑盒上市。本研究用滅活純化TBEV“森張”株免疫BALB／c小鼠，采用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)篩選抗TBEV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，制備抗TBEV單克隆抗體，并建立單克隆抗體雙抗體夾心ELISA病毒抗原定量檢測方法，為森林腦炎疫苗生產(chǎn)過程中TBEV抗原含量檢測及疫苗原液檢定提供一種快速簡便的病毒抗原定量方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及病毒株 小鼠骨髓瘤細(xì)胞NS-1株由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司（以下簡稱長春公司）生物技術(shù)研究室保存；TBEV“森張”株滅活純化全病毒由長春公司疫苗三室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)BALB／c小鼠，雌性，6～8周齡，體重16～18 g，由長春公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（吉）-2017-0005。

1.3 疫苗原液、標(biāo)準(zhǔn)品及工藝過程相關(guān)蛋白 TBEV滅活疫苗原液（批號(hào)：Y201909、Y201915、Y201916、Y201917、Y201918）、TBEV疫苗標(biāo)準(zhǔn)品（10.0μg／mL）及PHK細(xì)胞培養(yǎng)上清均由長春公司疫苗三室提供。

1.4 主要試劑及儀器 RPMI1640培養(yǎng)基（cat：3187-0074）購自美國Gibco公司；新生牛血清及胎牛血清購自武漢三利生物技術(shù)有限公司；人血白蛋白為成都蓉生藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；弗氏佐劑（cat：F5881、F5506）、PEG4000（cat：95904）、HAT（cat：H0262）、HT（cat：H0137）、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）（cat：87748）和降植烷（cat：T2280-2）購自美國Sigma公司；硝酸纖維素膜（NC膜）（cat：10600001）、nProtein A SepharoseTM4FastFlow（cat：17-5280-01）和?KTA purifierTMUPC 100購自美國GE公司；AP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（cat：BL021A）購自北京蘭杰柯科技有限公司；Goat Anti-Mouse IgG／HRP（cat：bs-0296G-HRP）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；BCIP／NBT底物顯色試劑盒（cat：PR1100）購自北京索萊寶科技有限公司；HRP快速標(biāo)記試劑盒（cat：EL0156）購自湖州英創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；Folin-酚試劑購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酶標(biāo)儀（iMarkTM）購自美國BIO-RAD公司。

1.5 雜交瘤細(xì)胞株的制備 以TBEV滅活純化全病毒作為免疫原經(jīng)皮下免疫小鼠，50μg／只，初次免疫使用弗氏完全佐劑，間隔7 d，再次免疫使用弗氏不完全佐劑，基礎(chǔ)免疫共免疫4次。融合前3 d，經(jīng)尾靜脈加強(qiáng)免疫，100μg／只。采用PEG4000化學(xué)法進(jìn)行細(xì)胞融合。間接ELISA法檢測融合雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)，有限稀釋法對陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆，細(xì)胞株經(jīng)反復(fù)凍存、復(fù)蘇及連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體效價(jià)，驗(yàn)證雜交瘤細(xì)胞株的穩(wěn)定性。

1.6 單克隆抗體的制備及純化 采用小鼠體內(nèi)誘生法制備單抗腹水。接種雜交瘤細(xì)胞前1周，經(jīng)小鼠腹腔注射降植烷，0.5 mL／只；1周后經(jīng)小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞懸液，0.2 mL／只，逐天觀察小鼠腹部，待小鼠腹部出現(xiàn)明顯漲大后，引流采集腹水。單抗腹水經(jīng)50%飽和硫酸銨沉淀、除鹽后，采用nProtein A SepharoseTM4FastFlow親和層析法進(jìn)行純化，12%SDSPAGE分析抗體蛋白純度，Lowry法測定抗體蛋白濃度。

1.7 單克隆抗體的鑒定

1.7.1 特異性 采用Western blot法。將TBEV全病毒抗原進(jìn)行還原性SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至NC膜，以制備的單抗為一抗、AP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行孵育，加BCIP／NBT底物顯色后，分析抗體反應(yīng)特異性。

1.7.2 相對親和力 采用間接ELISA法。將4株純化單抗從2mg／mL開始進(jìn)行2倍系列稀釋，以2.0μg／mL TBEV抗原包被酶標(biāo)板，分別測定系列稀釋的單抗的A450值，以與包被抗原出現(xiàn)50%結(jié)合時(shí)單抗的蛋白濃度為該株單抗的相對親和力［8-9］。

1.8 雙抗體夾心EL I S A檢測方法的建立

1.8.1 抗體配對 采用疊加ELISA法［10］。以0.25μg／mL TBEV抗原包被酶標(biāo)板，分別測定單株飽和單抗及兩兩組合后的單抗的吸光度值，并按下式計(jì)算疊加系數(shù)（additivity index，A.I）。

A.I（%）=［（A1+A2）／2 A（1+2）-1］×100%

式中A1、A2和A（1+2）分別為第1、第2和兩個(gè)組合在一起的單抗在ELISA試驗(yàn)中測得的A450值，當(dāng)A.I>40%時(shí)認(rèn)為兩株單抗識(shí)別不同的抗原位點(diǎn)，即選為配對抗體，用于本方法的建立。

1.8.2 方法的建立 采用棋盤滴定法。將包被抗體按照5、10、20μg／mL包被酶標(biāo)板，按1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400稀釋酶標(biāo)抗體，檢測20倍稀釋標(biāo)準(zhǔn)品及陰性對照（樣品稀釋液：含2%BSA的PBS溶液），以陽性值（P）／陰性值（N）為最大值時(shí)所對應(yīng)的包被抗體濃度和酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)作為最佳工作濃度，優(yōu)化包被條件和封閉條件，建立雙抗體夾心ELISA檢測方法。

1.9 方法的驗(yàn)證

1.9.1 最低檢測限 取2倍系列稀釋的TBEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品，用建立的方法進(jìn)行定量檢測，以陰性對照孔A450值的2.1倍作為Cut-off值，大于Cut-off值判為陽性，確定最低檢測限，即方法的敏感度。

1.9.2 線性相關(guān)性 將TBEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品2倍系列稀釋，共6個(gè)稀釋度，用建立的方法進(jìn)行3次重復(fù)檢測；分別以標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度為橫坐標(biāo)，A450平均值為縱坐標(biāo)建立線性回歸方程，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)（R2）。

1.9.3 特異性 采用建立的方法檢測TBEV滅活疫苗生產(chǎn)過程中可能存在雜質(zhì)和使用的主要原輔料（新生牛血清、PHK細(xì)胞培養(yǎng)上清、人血清白蛋白），以TBEV疫苗原液作為陽性對照，驗(yàn)證方法的特異性。

1.9.4 準(zhǔn)確性 取Y201909批TBEV滅活疫苗原液500μL，加入相同體積、濃度分別為10、5、2.5μg／mL的TBEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品，使標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為5、2.5、1.25μg／mL，用建立的方法定量測定3份樣品中TBEV標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度，重復(fù)測定3次，按下式計(jì)算TBEV標(biāo)準(zhǔn)抗原回收率，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。

標(biāo)準(zhǔn)抗原回收率（%）=（待回收樣本測定濃度-基礎(chǔ)樣本測定濃度）／加入濃度×100%

1.9.5 精密性 配制3個(gè)不同濃度TBEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品：8.0、3.0和1.0μg／mL，用建立的方法分別檢測3個(gè)濃度樣品中TBEV抗原含量，每個(gè)濃度檢測10個(gè)復(fù)孔，重復(fù)檢測3次，分別計(jì)算試驗(yàn)內(nèi)、試驗(yàn)間抗原濃度平均值（Mean）、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）及試驗(yàn)內(nèi)和試驗(yàn)間變異系數(shù)（CV），驗(yàn)證方法的精密性。

1.9.6 適用性 采用建立的方法檢測本公司生產(chǎn)的5批TBEV滅活疫苗原液（批號(hào)：Y201909、Y201915、Y201916、Y201917、Y201918）中TBEV抗原含量，每次檢測均將疫苗原液2倍系列稀釋。

1.10 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用EXCEL 2016軟件計(jì)算樣本的Mean、SD、回收率、CV值以及進(jìn)行線性回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 單克隆抗體的制備 共制備4株抗TBEV單抗雜交瘤細(xì)胞株：5F5、2G12、5E1及2H9，細(xì)胞株經(jīng)反復(fù)凍存、復(fù)蘇3次及連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月，培養(yǎng)上清ELISA效價(jià)均在104～105，腹水效價(jià)為106～107，見表1。

表1 單克隆抗體的效價(jià)Tab.1 Titers of mAbs

2.2 單克隆抗體的鑒定

2.2.1 純度及濃度 12%SDS-PAGE分析顯示，純化抗體純度>95%，見圖1。經(jīng)Lowry法測定，純化單抗5F5、2G12、5E1、2H9的濃度分別為5.3、7.2、4.5、6.1 mg／mL。

圖1 純化單抗的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE profile of purified mAb

2.2.2 特異性 Western blot分析顯示，4株單抗均與TBEV包膜E蛋白產(chǎn)生了特異性反應(yīng)，見圖2。

圖2 4株單抗的Western blot鑒定Fig.2 Western blotting of four mAbs

2.2.3 相對親和力 ELISA結(jié)果顯示，4株單抗的相對親和能力：2G12＞5F5＞2H9＞5E1，見圖3。

圖3 4株單抗的相對親和力Fig.3 Relative affinity of four mAbs

2.3 雙抗體夾心EL I S A檢測方法的建立 采用疊加ELISA法，首先確定5F5與2G12作為最佳配對抗體，用于檢測方法的建立，見表2。根據(jù)棋盤滴定法檢測結(jié)果，包被抗體濃度為10μg／mL，酶標(biāo)抗體稀釋度為1∶3 200時(shí)，P／N值最大，見表3。確定5F5作為包被抗體，最佳包被濃度為10μg／mL；2G12作為酶標(biāo)抗體，最佳工作濃度為1∶3 200。通過條件優(yōu)化，確定抗體包被條件為：2～8℃過夜（大于24 h）；3%小牛血清白蛋白2～8℃封閉過夜（大于16 h）；檢測溫度37℃，檢測時(shí)間1 h。

表2 4株單抗的A.I（%）Tab.2 A.I of four mAbs（%）

表3 抗體最佳工作濃度的選擇（A450）Tab.3 Optimization of working concentration of antibody（A450）

2.4 方法的驗(yàn)證

2.4.1 最低檢測限 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至1 024倍時(shí)，A450值為0.109，大于Cut-off值，結(jié)果為陽性，此時(shí)抗原含量為0.009 8μg／mL，初步確定該方法的最低檢測限為0.009 8μg／mL，見表4。

表4 最低檢測限驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Verification for minimum detection limit

2.4.2 線性相關(guān)性 檢測6個(gè)稀釋度TBEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程為y=0.706 x+0.646 3，R2=0.994 3。當(dāng)TBEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度在0.078 1～2.5μg／mL之間時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度與A450值具有良好的線性關(guān)系，見圖4。

圖4 線性相關(guān)性驗(yàn)證Fig.4 Verification for linear correlation

2.4.3 特異性 采用建立的方法能特異性檢測出TBEV滅活疫苗，而與疫苗生產(chǎn)過程中可能存在的雜質(zhì)和使用的主要原輔料無交叉反應(yīng)，見圖5。表明該方法特異性良好。

圖5 特異性驗(yàn)證Fig.5 Verification for specificity

2.4.4 準(zhǔn)確性 采用建立的方法檢測3種不同濃度TBEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品的加樣回收率在96.2%～109.2%之間，見表5。表明該方法準(zhǔn)確性良好。

表5 準(zhǔn)確性驗(yàn)證Tab.5 Verification for accuracy

2.4.5 精密性 采用建立的方法檢測3個(gè)濃度的TBEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品，試驗(yàn)內(nèi)CV在7.37%～8.40%之間，試驗(yàn)間CV在8.66%～9.38%之間，見表6。表明該方法精密性良好。

表6 試驗(yàn)內(nèi)與試驗(yàn)間精密性驗(yàn)證Tab.6 Verification for precisions in intra-and inter-assays

2.4.6 適用性 采用建立的方法檢測5批TBEV滅活疫苗原液，A450值與疫苗稀釋度呈良好的劑量依賴關(guān)系，見圖6。表明該方法適用性良好。

圖6 5批TBEV滅活疫苗原液抗原含量檢測結(jié)果Fig.6 Determination results of antigen content of five batches bulks of inactivated TBEV vaccine

3 討論

TBE是林區(qū)常見和多發(fā)的傳染性疾病，人群普遍易感［1，11］，并呈明顯的區(qū)域性和季節(jié)流行性。東北地區(qū)是我國TBE主要自然疫源地，另外，云南和新疆代表我國西南、西北疑似自然疫源地，根據(jù)血清流行病學(xué)調(diào)查，也存在既往TBEV感染的報(bào)道［12］。TBEV為嗜神經(jīng)包膜病毒，可侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致病變［13］。TBEV包含3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白以及7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白［14-15］。E蛋白是病毒主要毒力和抗原位點(diǎn)，參與病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，決定著病毒的細(xì)胞噬性，是疫苗主要的保護(hù)性位點(diǎn)；另外，E蛋白也是TBEV特異性診斷抗原，用于病毒的特異性鑒定和疾病診斷［16-17］。

目前，在臨床上尚無有效的抗病毒治療手段，主要通過對癥治療，緩解癥狀等措施治療TBE疾??；在流行區(qū)域，高發(fā)人群進(jìn)行疫苗接種是預(yù)防TBE最有效的手段，可顯著降低感染率和發(fā)病率［18-19］。

在TBEV滅活疫苗生產(chǎn)過程中，檢測病毒滴度和有效抗原含量是保證疫苗有效性的重要環(huán)節(jié)；TBEV E蛋白是誘導(dǎo)保護(hù)性中和抗體的主要蛋白，即疫苗最有效的保護(hù)性抗原，理論上檢測E蛋白含量可間接評價(jià)疫苗的保護(hù)性?，F(xiàn)有疫苗的免疫原性檢測，是通過動(dòng)物免疫和攻毒實(shí)驗(yàn)計(jì)算免疫保護(hù)性指數(shù)進(jìn)行疫苗評價(jià)［7］，需在特殊環(huán)境下操作活病毒，存在安全風(fēng)險(xiǎn)，且疫苗檢測周期長，亟待建立一種簡便、有效、快速的檢測方法用于疫苗生產(chǎn)過程抗原含量檢測。

本研究采用小鼠雜交瘤融合技術(shù)，以“森張”株滅活全病毒為免疫原，制備TBEV特異性單抗，經(jīng)Western blot鑒定，制備的單抗均與TBEV包膜E蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，經(jīng)抗體配對、相對親和力測定等，利用選出的單抗建立了雙抗體夾心ELISA抗原定量檢測方法。經(jīng)方法的驗(yàn)證，確定建立的ELISA法具有較高的敏感度、特異性、精密性和線性相關(guān)性。利用建立的方法檢測5批TBEV滅活疫苗原液，抗原含量與吸光度值呈劑量依賴相關(guān)性，表明所建立的方法具有良好的適用性。本方法可特異性檢測TBEV包膜E蛋白，應(yīng)用于生產(chǎn)過程中病毒抗原含量監(jiān)測。雖然目前本方法尚不能簡單代替疫苗效力檢測，但隨著對單抗研究如中和特性等研究的深入，以及與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)比對，存在替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測疫苗免疫保護(hù)性的可能。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功制備了抗TBEV單克隆抗體，其特異性針對病毒保護(hù)性包膜E蛋白；并在此基礎(chǔ)上建立了TBEV雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法，經(jīng)初步適用性研究，可用于TBEV疫苗生產(chǎn)過程中病毒抗原含量檢測。