尿液S100A6蛋白與細(xì)菌／真菌性尿路感染的相關(guān)性

藍(lán)子權(quán)，曾李婷，肖儀，黃奕橋，張智銘，肖劍，江先漢，彭亮

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東 廣州 510700

尿路感染（urinary tract infection，UTI）是臨床最常見的感染性疾病之一，發(fā)病率僅次于呼吸道感染［1］，其中尤以細(xì)菌或真菌引起的UTI多見。目前臨床主要通過結(jié)合病史、臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行診斷。尿常規(guī)分析可作為判斷UTI的重要手段，而尿液培養(yǎng)則是確診UTI的金標(biāo)準(zhǔn)。但尿常規(guī)分析存在靈敏度和特異度不高、干擾因素較多的缺點(diǎn)，尿液培養(yǎng)檢測速度較慢，不適于大規(guī)模篩查。因此，開發(fā)新的UTI檢測指標(biāo)具有重要的臨床價(jià)值。

S100A6蛋白是鈣結(jié)合蛋白S100家族的一員，已證實(shí)其可與鈣離子結(jié)合，且可調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期［2］。有報(bào)道表明，S100A6蛋白通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的微絲蛋白，參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。目前關(guān)于S100A6蛋白的研究主要集中于腫瘤發(fā)病機(jī)制方面，包括胃腸、肝膽、乳腺、子宮、卵巢、骨及泌尿系腫瘤等［3-8］。S100A6蛋白在一些非感染性炎癥和自身免疫病的血清中升高［9-10］，但其與感染性疾病的相關(guān)性罕見報(bào)道，僅有少量研究提示其與動(dòng)物病毒感染相關(guān)［11-12］。S100A6蛋白可在尿路組織中表達(dá)，作用尚未明確，本研究對細(xì)菌或真菌性UTI患者尿液中S100A6蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，并采用ELISA法及ROC曲線評價(jià)該蛋白作為UTI初篩指標(biāo)的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 樣本 選取2019年4—12月期間，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院行尿液培養(yǎng)的UTI患者及來自體檢中心的健康人群尿液樣本，感染組和正常對照組各110份。感染組患者來自門診及住院部，具有典型的UTI癥狀，尿常規(guī)檢測及尿液培養(yǎng)（細(xì)菌或真菌培養(yǎng)）結(jié)果均為陽性；正常對照組樣本的尿液生化檢查及培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 所有患者均排除患有良、惡性腫瘤；排除患有心肺疾病；排除患有自身免疫性疾??；排除患有結(jié)石病及尿路梗阻等疾病。

1.3 主要試劑 S100A6蛋白ELISA試劑盒（貨號：CSBE13089h）購自武漢華美生物科技有限公司；兔抗S100A6單克隆抗體（貨號：ab181975）購自美國Abcam公司；HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG（貨號：BA-1060）購自中國武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 S100A6蛋白含量的檢測 將尿液樣本經(jīng)573×g離心10 min，取上清液，采用S100A6蛋白ELISA試劑盒檢測尿液中S100A6蛋白A450值，應(yīng)用Curve Expert軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并取擬合度最佳的曲線方程，將A450值代入方程，計(jì)算尿液中S100A6的蛋白濃度；以尿液S100A6蛋白濃度為自變量，分組作為因變量，應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行Logistic回歸分析，并以1-特異度為橫坐標(biāo)，敏感度為縱坐標(biāo)，繪制ROC曲線，分析S100A6蛋白在UTI中的診斷價(jià)值。

1.5 尿液中S100A6蛋白穩(wěn)定性的檢測 采用Western blot法。隨機(jī)從兩組尿液樣本中各取2份，100μL／份，經(jīng)10%SDS-PAGE分離蛋白后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶于室溫封閉1 h；加入兔抗S100A6單克隆抗體（1∶10 000稀釋），4℃孵育過夜；PBST洗滌3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h；PBST洗滌3次，每次10 min，DAB法顯色，通過Image J測量灰度值，以與正常對照組灰度值均值的比值為相對蛋白含量。選取感染組尿液樣本，于室溫分別放置2、4、8、10、12、24、48、96 h，各時(shí)間點(diǎn)分別取100μL，進(jìn)行Western blot檢測，方法同上，通過Image J測量灰度值，以與室溫放置2 h的正常對照組灰度值的比值為各時(shí)間點(diǎn)的相對蛋白含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料中滿足正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用T檢驗(yàn)或方差分析；呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）或構(gòu)成比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料統(tǒng)計(jì) 正常對照組健康人群及感染組患者的平均年齡分別為（55.01±19.97）和（50.68±19.67）歲，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.090，P=0.920）；正常對照組及感染組男性分別為56和49人，女性分別為54及61人，兩組性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.893，P=0.345）。

2.2 S100A6蛋白的含量 感染組及正常對照組的S100A6蛋白濃度分別為39.44～1 153.3和13.61～28.07 pg／mL，中位數(shù)分別為128.96和16.77 pg／mL，感染組明顯高于正常對照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-7.092，P=0.000）。見圖1。

圖1 ELISA法檢測兩組尿液樣本S100A6蛋白的含量Fig.1 ELISA of S100A6 protein content in urine samples of two groups

2.3 Logistic回歸分析結(jié)果 以尿液S100A6蛋白濃度為自變量，分組作為因變量得出二元Logistic回歸方程為y=-0.971+0.04 x，其中OR值為1.004，P=0.001。表明S100A6蛋白與UTI的相關(guān)性較高，即S100A6蛋白對UTI有顯著影響。

2.4 S100A6蛋白的R O C曲線 S100A6蛋白濃度的ROC曲線下面積（AUC）=0.862，P=0.000，95%CI：0.799～0.925，約登指數(shù)=0.628，S100A6取臨界值=23.277 pg／mL，靈敏度為91.2%，特異度為71.6%，診斷陽性率達(dá)71.2%，漏診率8.6%，見圖2。

圖2 S1006A6蛋白的ROC曲線Fig.2 ROC curve of S1006A6 protein

2.5 尿液中S100A6蛋白的穩(wěn)定性 感染組尿液樣本中S100A6蛋白含量明顯高于正常對照組（t=-7.33，P=0.03），見圖3和圖4。感染組尿液樣本室溫放置2、4、8、10、12、24、48、96 h時(shí)，S100A6蛋白含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.60，P=0.21），見圖5和圖6。

圖3 Western blot法檢測尿液樣本中S100A6蛋白的水平Fig.3 Western blotting of S100A6 protein level in urine samples

圖4 兩組尿液樣本中S100A6蛋白的含量Fig.4 Urinary S100A6 protein contents in two groups

圖5 Western blot法檢測尿液在室溫放置不同時(shí)間后S100A6蛋白的穩(wěn)定性Fig.5 Western blottingof stability of S100A6 protein content in urine samples after storage at room temperature for various hours

圖6 尿液于室溫放置不同時(shí)間后S100A6蛋白的含量Fig.6 S100A6 protein contents in urine samples after storage at room temperature for various hours

3 討論

UTI作為一種高發(fā)性的感染性疾病，不僅應(yīng)在治療上給予最佳的治療措施，也需要高效、準(zhǔn)確、便捷的診斷方法。目前，臨床使用最多的UTI診斷輔助方法是尿常規(guī)檢測及尿液培養(yǎng)。尿常規(guī)中亞硝酸鹽易受空氣等因素影響，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另外，許多病原菌由于不含硝酸鹽還原酶，在感染時(shí)并不會出現(xiàn)亞硝酸鹽陽性。白細(xì)胞酯酶陽性多是膿尿信號，但一些非感染性炎癥也會引起白細(xì)胞酯酶升高，如尿路結(jié)石、移植排斥反應(yīng)、非感染性腎炎等。尿液培養(yǎng)仍存在許多不足，如UTI中尿液培養(yǎng)陽性率低（約50%）［13-14］，且培養(yǎng)至少需要2～3 d。正常尿液是無菌的，當(dāng)定值菌超過一定計(jì)數(shù)就是細(xì)菌尿，細(xì)菌尿患者不一定有癥狀［1］。因此，為避免采集尿液時(shí)引起的樣本污染或非炎癥性的細(xì)菌尿，臨床采用不同的細(xì)菌計(jì)數(shù)方式來診斷UTI。

KUZNICKI等［15］于1987年在患者腹水的腫瘤細(xì)胞中分離并純化獲得S100A6蛋白，其可分布在細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)、胞膜和細(xì)胞核中，但在人體各組織表達(dá)不一，主要分布在人體的成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞中。S100A6蛋白結(jié)合鈣離子來改變分子構(gòu)象，暴露隱藏的疏水區(qū)域，與蛋白配體結(jié)合后發(fā)揮生物調(diào)節(jié)作用［16］。S100A6蛋白在多種腫瘤表達(dá)升高，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移密切相關(guān)，具備作為潛在的腫瘤標(biāo)志物的檢測價(jià)值。另外，S100A6蛋白與炎癥的相關(guān)性也是近年的研究熱點(diǎn)，WANG等［12］于2012年發(fā)現(xiàn)，S100A6蛋白與感染密切相關(guān)，可能通過NF-κB調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，但尚無足夠證據(jù)。

本研究取健康者尿液作為正常對照組，與確診UTI的患者尿液的S100A6蛋白含量進(jìn)行比較。ELISA法檢測結(jié)果表明，感染組的尿液中S100A6蛋白含量明顯高于正常對照組（P＜0.01）。Logistic回歸分析表明，S100A6蛋白與UTI存在相關(guān)性，提示S100A6蛋白對UTI有顯著影響。ROC曲線顯示，AUC=0.862，在0.5～0.9之間，表明診斷準(zhǔn)確性高；當(dāng)約登指數(shù)為0.628，S100A6取臨界值23.277 pg／mL時(shí)，靈敏度為91.2%，特異度為71.6%，此時(shí)S100A6蛋白的診斷效能最高。為探討S100A6蛋白與尿液放置時(shí)間的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)將感染組樣本置室溫放置2、4、8、10、12、24、48、96 h，觀察比較尿液中S100A6蛋白濃度發(fā)生的變化。Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各時(shí)間點(diǎn)蛋白含量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），S100A6蛋白可在尿液中保持穩(wěn)定的抗原性，表明S100A6蛋白可作為穩(wěn)定的檢測指標(biāo)。作為一種分泌蛋白，S100A6蛋白相對分子質(zhì)量為10 500，是酸性小分子，其穩(wěn)定性源于S100A6翻譯后糖基化修飾。糖基化可使S100A6蛋白抵抗消化酶的降解作用，影響多肽的構(gòu)象，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性［17］。

綜上所述，S100A6蛋白在細(xì)菌或真菌性感染患者的尿液和健康者尿液的差異表達(dá)對UTI有較高的輔助診斷價(jià)值，且S100A6蛋白穩(wěn)定的抗原性有利于減少對尿液的保存時(shí)間和溫度等條件限制，在樣本檢測方面有較好優(yōu)勢。本研究為S100A6蛋白在病原菌感染中意義的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。