人干擾素α2a注射液中對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯含量反相高效液相色譜檢測方法的建立及驗證

何珊，于雷，賈丹，靳征，袁杰，史新昌，裴德寧

1.沈陽三生制藥有限責(zé)任公司，遼寧 沈陽 100271；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

人干擾素α2a注射液是由高效表達人干擾素α2a基因的大腸埃希菌經(jīng)發(fā)酵、分離和高度純化后獲得的人干擾素α2a原液制成，輔料包括吐溫80、枸櫞酸鈉、枸櫞酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、乙二胺四乙酸二鈉等，臨床適應(yīng)癥為淋巴或造血系統(tǒng)腫瘤和某些病毒性疾病，已收錄于《中國藥典》三部（2020版）。

對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯為無色結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末，主要用作食品、化妝品、醫(yī)藥的殺菌防腐劑，可破壞微生物的細胞膜，使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性，并可抑制微生物細胞的呼吸酶系及電子傳遞酶系的活性，從而起到殺菌防腐的作用［1-3］。在人干擾素α2a注射液的生產(chǎn)中，常聯(lián)合使用對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯，以提高其防腐效能［4-5］。藥品中防腐劑含量過低起不到抑菌效果，過高則會對人體產(chǎn)生毒害作用，因此應(yīng)嚴格控制其含量。根據(jù)《中國藥典》三部（2020版）《重組人干擾素α2a注射液》項下規(guī)定：如制劑中含有對羥基苯甲酸甲酯，其含量應(yīng)為0.04%～0.10%，如制劑中含有對羥基苯甲酸丙酯，其含量應(yīng)為0.004%～0.010%，測定方法為氣相色譜法（通則3116）［6］。檢定過程中，發(fā)現(xiàn)該方法存在精密度低、檢測時間長等缺點［7］，為克服這些缺點，本研究建立了測定人干擾素α2a注射液中對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯含量的反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法，并對其進行驗證［8-9］。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 重組人干擾素α2a注射液（批號：201804026、201807032、201904040、2019040-41、201904042和201904044）由沈陽三生制藥有限責(zé)任公司提供；對羥基苯甲酸甲酯對照品（批號：100278-201906）、對羥基苯甲酸丙酯對照品（批號：100444-201804）購自中國食品藥品檢定研究院；不含對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯的重組人干擾素α2a注射液空白制劑由沈陽三生制藥有限責(zé)任公司質(zhì)量檢驗部實驗室制備；冰乙酸（分析純）購自沈陽化學(xué)試劑廠；甲醇（色譜純）購自美國SIGMAAldrich公司；e2695高效液相色譜儀、e2489紫外檢測器購自美國Waters公司；Phenomenex C18色譜柱（5μm，250 mm×4.6 mm）購自美國Phenomenex公司；Grace C18色譜柱（5μm，250 mm×4.6 mm）購自美國Grace公司；Agilent C18色譜柱（5μm，250 mm×4.6 mm）、HP-1色譜柱（30 m×0.530 mm×2.65μm）、7890B氣相色譜儀購自美國Agilent公司。

1.2 R P-H PL C法的建立

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18柱（5μm，250 mm×4.6 mm），流動相：甲醇-1%冰醋酸（60∶40），流速：1.0 mL／min，進樣量：20μL，紫外檢測器波長：254 nm，柱溫：25℃。

1.2.2 混合對照品溶液 分別取對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯對照品，用流動相溶解并稀釋成含量為0.04%和0.004%的單一對照品儲備液。取0.04%的對羥基苯甲酸甲酯對照品儲備液和0.004%的對羥基苯甲酸丙酯對照品儲備液等體積混合，即得對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯含量分別為0.02%和0.002%的混合對照品儲備液。取混合對照品儲備液，制備系列濃度的混合對照品溶液，其中對羥基苯甲酸甲酯的系列濃度為0、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.010%和0.012%，對羥基苯甲酸丙酯的系列濃度為：0、0.000 2%、0.000 4%、0.000 6%、0.000 8%、0.001 0%和0.001 2%，按

1.2.1 項條件進樣測定，以測定的峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)對照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

1.2.3 供試品溶液 取重組人干擾素α2a注射液樣品，用流動相進行10倍稀釋，按1.2.1項條件進樣測定，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計算樣品中對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯含量。

1.2.4 供試品基質(zhì)溶液 取不含對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯重組人干擾素α2a注射液空白制劑，用流動相進行10倍稀釋，按1.2.1項條件進樣測定。

1.3 方法的驗證

1.3.1 系統(tǒng)適用性和專屬性 分別取混合對照品溶液（對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯的濃度分別為0.01%和0.001%）、供試品溶液和供試品基質(zhì)溶液，按1.2.1項條件進樣測定，分析待測成分色譜峰的理論塔板數(shù)、待測成分色譜峰與其他色譜法的分離度，比較不同進樣的色譜圖。

1.3.2 線性 取1.2.2項系列濃度的的混合對照品溶液，按1.2.1項條件進樣測定，以測定的峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)對照品濃度為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算R2值。

1.3.3 準(zhǔn)確度 向供試品基質(zhì)溶液中加入混合對照品溶液，充分混勻，使對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯的含量分別為0.006%和0.000 6%，平行制備6份，按1.2.1項條件進樣測定，計算對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯的加標(biāo)回收率。

1.3.4 重復(fù)性 取1批供試品溶液，連續(xù)進樣6次，按1.2.1項條件進樣測定，記錄對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯的峰面積，計算RSD。

1.3.5 耐用性 取1批供試品溶液，分別采用不同品牌的色譜柱：Phenomenex C18色譜柱（5μm，250 mm×4.6 mm）、Grace C18色譜柱（5μm，250 mm×4.6 mm）和Agilent C18色譜柱（5μm，250 mm×4.6 mm）；不同的流動相甲醇-1%冰乙酸比例：55∶45、60∶40和65∶35；不同的柱溫：25、30和35℃。按1.2項方法進行測定，考察試驗條件變化對測定結(jié)果的影響。

1.4 氣相色譜法 按《中國藥典》三部（2020版）通則3116《對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯含量測定法》進行測定。

1.5 方法的初步應(yīng)用 分別采用1.2和1.4項方法測定6批重組人干擾素α2a注射液中對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯的含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用Minitab軟件，兩種方法檢測結(jié)果差異的比較采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性和專屬性 混合對照品溶液色譜圖顯示，對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯色譜峰的理論塔板數(shù)均大于9 000，待測成分色譜峰之間的分離度大于1.5，系統(tǒng)適用性良好；供試品基質(zhì)溶液色譜圖顯示，未檢出待測色譜峰；供試品溶液色譜圖顯示，2個待測成分（對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯）色譜峰的保留時間與混合對照品溶液的色譜圖一致，待測成分色譜峰之間、待測成分色譜峰與其他色譜峰之間分離度均大于1.5，對待測成分的含量測定無干擾，方法的專屬性良好。見圖1。

圖1 混合對照品溶液（A）、供試品溶液（B）和供試品基質(zhì)溶液（C）色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed reference（A），test sample（B）and base material（C）solutions

2.2 線性 對羥基苯甲酸甲酯濃度在0.002%～0.012%時，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：y=1 204 693 661 x+45 682，R2為0.999 9；對羥基苯甲酸丙酯濃度在0.0002%～0.001 2%時，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：y=1 043 508 571 x+9 771，R2為0.999 0。見圖2。

圖2 對羥基苯甲酸甲酯（A）和對羥基苯甲酸丙酯（B）標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of methyl p-hydroxybenzoate（A）and propyl p-hydroxybenzoate（B）

2.3 準(zhǔn)確度 對羥基苯甲酸甲酯6次加標(biāo)回收率平均值為99.6%，RSD為0.13%；對羥基苯甲酸丙酯6次加標(biāo)回收率平均值為99.2%，RSD為0.11%，方法準(zhǔn)確度良好。見表1。

表1 加標(biāo)回收率測定結(jié)果（%）Tab.1 Determination results of spike recovery（%）

2.4 重復(fù)性 連續(xù)進樣6次，對羥基苯甲酸甲酯峰面積的RSD為0.05%，對羥基苯甲酸丙酯峰面積的RSD為0.07%，方法重復(fù)性良好，見表2。

表2 重復(fù)性測定結(jié)果Tab.2 Test for reproducibility

2.5 耐用性 在不同測定條件下，各色譜峰的峰型無顯著變化，對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯含量測定結(jié)果的RSD均不超過2.0%，方法耐用性良好，見表3。

表3 耐用性測定結(jié)果（%）Tab.3 Test for durability（%）

2.6 方法的初步應(yīng)用 對羥基苯甲酸甲酯含量的RP-HPLC法測定結(jié)果與氣相色譜法相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.087，P＜0.001），對羥基苯甲酸丙酯含量的RP-HPLC法測定結(jié)果與氣相色譜法相比差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.708，P＜0.002）。對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯的實際投料量分別為0.06%和0.006%，RP-HPLC法測定結(jié)果與投料量非常接近，而氣相色譜法測定結(jié)果明顯高于投料量。見表4。

表4 HPLC和氣相色譜法測定結(jié)果對比（%）Tab.4 Determination results by HPLC and GC（%）

3 討論

氣相色譜法具有分離效率高、靈敏度高、選擇性高等優(yōu)點，主要用于分析氣體和易揮發(fā)的有機物，進樣方式包括直接進樣和頂空進樣［10］。氣相色譜法用于對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯含量測定時，由于兩者沸點較高，不易揮發(fā)，因此只能采用直接進樣法。干擾素樣品直接進樣后，其中的蛋白和輔料容易污染色譜儀的隔墊、襯管和色譜柱［11］，造成色譜圖基線不穩(wěn)定，色譜峰分叉，因此，進樣2～3次后，需對色譜柱進行長時間的沖洗和平衡，隔墊、襯管等也需經(jīng)常更換，這些均增加了檢測時間和檢測成本。另外，為了減少進樣誤差，《中國藥典》三部（2020版）要求使用對苯二酚作為內(nèi)標(biāo)物。對苯二酚具有較強的毒性，對皮膚、黏膜有強烈的腐蝕作用，可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)或損害肝、皮膚功能，屬于三類致癌物，影響操作人員健康，引起環(huán)境污染［12］。HPLC法具有靈敏度高、分離效率高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點［13］，HPLC系統(tǒng)受樣品中蛋白和輔料的影響也較小，因此，本研究使用HPLC法代替氣相色譜法測定人干擾素α2a注射液中對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯的含量，由于對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯的疏水性不同，因此使用反相色譜柱進行分離。建立的HPLC法具有良好的專屬性、線性、準(zhǔn)確度、精密度和耐用性，與氣相色譜法相比，具有操作簡便、安全、準(zhǔn)確度高的優(yōu)勢，可作為氣相色譜法的替代方法。本方法的建立為《中國藥典》方法的完善提供了技術(shù)支撐，也為其他蛋白藥物中同類防腐劑含量的測定提供了參考。