單核細胞增生性李斯特菌化學(xué)發(fā)光免疫檢測法的建立及驗證

栗克文，魯倩茹，黃鳳玲，邢珂慧，邵佩蘭

1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.河南美凱生物科技有限公司，河南 漯河 462001

食品安全關(guān)系著國民身體健康，近年來，食品安全事件頻發(fā)，成為全世界共同關(guān)注的話題之一［1-3］。食品檢測作為保障食品安全的有效途徑，對于民生的保障發(fā)揮著巨大的作用。在食源性疾病中，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌及單核細胞增生性李斯特菌（簡稱單增李斯特菌）4種致病菌的常規(guī)檢測方法需進行增菌、分離、初篩及鑒定，耗時常達72 h以上［4］，同時，現(xiàn)階段的監(jiān)測體系過于依賴儀器設(shè)備，操作復(fù)雜、耗時長，且設(shè)備價格昂貴，對于基層市場監(jiān)管及食品流通的控制具有一定難度。因此，對于食源性病原菌而言，開發(fā)快速、高效、簡便的檢測方法具有較強的現(xiàn)實意義。

單增李斯特菌是一種不形成芽胞、不產(chǎn)生莢膜的革蘭陽性短桿菌，作為一種人畜共患病致病原，在污水、土壤、動物糞便等介質(zhì)中廣泛存在。單增李斯特菌感染分為侵襲性及非侵襲性，侵襲性感染多感染妊娠期婦女，表現(xiàn)為流產(chǎn)、早產(chǎn)、甚至死產(chǎn)，胎兒則表現(xiàn)為新生兒敗血癥及新生兒腦膜炎，具有較高的死亡率。非侵襲性感染是由于該菌能在4℃環(huán)境繁殖，成為冰箱冷藏食品如冰激凌、蔬菜、水果、肉類等的主要致病菌，當(dāng)大量誤食該菌污染的食品會引起感染，出現(xiàn)發(fā)熱、嘔吐、腹瀉、胃腸炎等癥狀，而這種類型感染易被人忽視。因此，WHO食品安全工作計劃將該菌作為重點檢測的食源性病原菌之一，我國食品安全風(fēng)險監(jiān)測網(wǎng)也將該菌列為常規(guī)監(jiān)測的致病菌項目之一［5］，多個國家就致病菌限量標準進行了規(guī)定，其中熟肉制品及發(fā)酵肉制品中為不得檢出［6］。北京、河南、海南等多個地區(qū)進行李斯特菌調(diào)查發(fā)現(xiàn)，食品、刀具、砧板、冰箱等均存在不同程度的污染［7-13］。目前，單增李斯特菌的檢驗仍以培養(yǎng)方法為主，不能實現(xiàn)快速篩檢及批量樣本檢測。

本研究制備單增李斯特菌鼠源單抗及兔血清多抗，采用包被兔血清多抗-檢測單增李斯特菌-鼠源單抗-催化底物顯色雙抗體夾心反應(yīng)體系，建立優(yōu)化檢測單增李斯特菌的化學(xué)發(fā)光免疫法，以期為食品安全檢測提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及細胞 單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC19115、英諾克李斯特菌（Listeria innocua）ATCC33090購自上海復(fù)祥生物科技有限公司；單增李斯特菌CMCC54003及CMCC54004購自上海索寶生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923、大腸埃希菌（Escherichia coli）ATCC25922及沙門菌（Salmonella）ATCC-14028均購自河南美凱生物科技有限公司；SP／20骨髓瘤細胞購自鄭州恒德堂生物科技有限公司。

1.2 實驗動物 普通級健康新西蘭大白兔［4只，雄性，體重（2.3±0.3）kg，6周齡］及清潔級BALB／c小鼠［8只，雌雄各半，體重（17±2）g，4周齡］購自河北省實驗動物中心，合格證編號：1709035。

1.3 主要試劑及儀器 DMEM、RPMI1640及TSAYE平板培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；角鯊烯、斯盤85、吐溫-80、PEG-6000、魯米諾及牛血清白蛋白（BSA）均購自美國Sigma公司；羊抗鼠抗體-HRP購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；化學(xué)發(fā)光板購自深圳金燦華實業(yè)有限公司；Simplicity型超純水發(fā)生器購自美國密理博公司；Smartline型化學(xué)發(fā)光儀購自德國拜耳托德公司；MS3 Digital型混勻器購自德國艾卡儀器公司。

1.4 抗體制備

1.4.1 免疫原制備 將單增李斯特菌ATCC19115接種至100 mL TSA-YE培養(yǎng)基中，37℃，150 r／min搖床培養(yǎng)24 h；將菌液裝入離心管，1 816×g離心20 min，棄上清，收集沉淀菌體。用無菌生理鹽水懸浮，1 816×g離心20 min，棄上清，以上操作重復(fù)2次，收集沉淀菌體，加入100 mL含0.35%甲醛的無菌生理鹽水，37℃滅活24 h，1 816×g離心20 min，棄上清，收集菌體。用50 mL無菌生理鹽水重懸菌體，采用麥氏比濁法計數(shù)，5 mL／管分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。使用前?管免疫原用無菌生理鹽水稀釋至1×109CFU／mL，取5.0 mL稀釋菌液加入5.0 mL MF59佐劑［14-15］，充分混勻，制成免疫原，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 兔血清多抗的制備 新西蘭大白兔4只，經(jīng)背部5個注射點皮下注射免疫原，每點0.2 mL，1 mL／只。首免后每隔14 d加強免疫1次，每點0.1 mL，0.5 mL／只，共加強免疫3次。第2次加強免疫7 d后耳緣靜脈采血，分離血清，檢測抗體效價。選擇抗體效價最高的1只白兔，于末次免疫第7天進行頸動脈取血，分離血清，采用飽和硫酸銨兩步法純化抗體，純化后按1∶1加入甘油，于-20℃保存。

1.4.3 鼠源單抗的制備 BALB／c小鼠8只，經(jīng)脊柱兩側(cè)皮下免疫，免疫方法及周期同1.4.2項，初免劑量為0.2 mL／只，加強免疫劑量為0.1 mL／只。挑選抗體效價最高的小鼠，于末次免疫第3天進行脾細胞融合，單抗制備方法參考文獻［16-17］。將收集的腹水，用辛酸-硫酸銨方法進行純化，純化后按1∶1加入甘油，于-20℃保存。

1.5 方法的建立 將不同濃度兔血清多抗分別加入化學(xué)發(fā)光板進行包被，洗板，封閉后，依次加入1×105CFU／mL單增李斯特菌ATCC19115菌液50μL及鼠源單抗（1∶200稀釋）50μL，37℃反應(yīng)不同時間；PBST洗滌5次，加入0.02 mol／mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）稀釋1 000倍的羊抗鼠抗體-HRP 100μL，37℃孵育60 min；PBST洗滌5次，加入含0.1 mg／mL魯米諾及0.01 mg／mL過氧化脲的磷酸鹽溶液（pH 8.0）100μL，室溫反應(yīng)5 min；用化學(xué)發(fā)儀檢測化學(xué)發(fā)光強度值（RLU）。

1.6 方法的優(yōu)化

1.6.1 包被抗體濃度的優(yōu)化 將0.015 mol／L碳酸鹽緩沖液（pH 9.5）稀釋的1.0、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.000 5 mg／mL兔血清多抗分別加入化學(xué)發(fā)光板，進行包被，其余操作按1.5項。

1.6.2 樣本反應(yīng)時間的優(yōu)化 用0.05 mg／mL兔血清多抗包被化學(xué)發(fā)光板，依次加入1×105CFU／mL單增李斯特菌ATCC19115菌液50μL及鼠源單抗（1∶200稀釋）50μL，于37℃分別孵育30、35、40、45、50、55、60 min，其余操作按1.5項。

1.7 方法的驗證

1.7.1 檢測范圍及靈敏度 用0.05 mg／mL兔血清多抗包被化學(xué)發(fā)光板，分別加入濃度為1×100、1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108CFU／mL單增李斯特菌50μL，其余操作按1.5項。

1.7.2 特異性 用0.05 mg／mL兔血清多抗包被化學(xué)發(fā)光板，分別加入1×104CFU／mL的單增李斯特菌ATCC19115、CMCC54003、CMCC54004、英諾克李斯特菌ATCC33090、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922及沙門菌ATCC14028各50μL，其余操作按1.5項。

1.7.3 準確性 在無菌環(huán)境下，將切碎的火腿腸及冰激凌各10 g分別置研缽中，加入90 mL無菌生理鹽水研磨成漿，4 650×g離心5 min，收集上清液；10 mL牛奶加入90 mL無菌生理鹽水充分混勻，4 650×g離心5 min，收集上清液。分別取3種樣本上清液各0.9 mL，加入1×105CFU／mL單增李斯特菌菌懸液0.1 mL，作為載體添加溶液；取生理鹽水0.9 mL，加入1×105CFU／mL單增李斯特菌菌懸液0.1 mL，作為陽性對照，同時以生理鹽水為陰性對照，以無菌的火腿腸、牛奶、冰激凌提取液作為空白對照。用0.05 mg／mL兔血清多抗包被化學(xué)發(fā)光板，分別加入陽性及陰性對照及3種載體添加溶液及其空白對照各50μL，其余操作按1.5項。按下式計算不同介質(zhì)中單增李斯特菌的回收率。

回收率（%）=樣本檢測值／陽性對照值×100%

1.7.4 穩(wěn)定性 用0.1 mg／mL多抗包被化學(xué)發(fā)光板，用鋁箔袋封裝并熱封閉，37℃分別放置7、14、21、28 d后取出，分別加入1×104CFU／mL單增李斯特菌菌懸液50μL，其余操作按1.5項。

2 結(jié)果

2.1 抗體效價 兔血清多抗效價為1∶256 000，鼠源單抗效價為1∶128 000。

2.2 方法的優(yōu)化

2.2.1 兔血清多抗包被濃度 結(jié)果顯示，隨著兔血清多抗包被濃度的增加，單增李斯特菌發(fā)光值也增高，當(dāng)包被濃度＞0.1 mg／mL時，單增李斯特菌發(fā)光值增加減緩，見圖1。選擇兔血清多抗包被濃度為0.05 mg／mL。

圖1 抗體不同包被濃度對單增李斯特菌發(fā)光值的影響Fig.1 Effect of antibody concentration for coating on chemiluminescence value of L.monocytogenes

2.2.2 反應(yīng)時間 結(jié)果顯示，反應(yīng)30～40 min，單增李斯特菌發(fā)光值較低，反應(yīng)40 min后進入平臺期，見圖2。根據(jù)時間最短操作最優(yōu)的原則，選擇40 min為最適反應(yīng)時間。

圖2 不同反應(yīng)時間對單增李斯特菌發(fā)光值的影響Fig.2 Effect of reaction time on chemiluminescence value of L.monocytogenes

2.3 方法的驗證

2.3.1 檢測范圍及靈敏度 結(jié)果顯示，隨著單增李斯特菌濃度增加，其發(fā)光值逐漸增高，當(dāng)單增李斯特菌數(shù)濃度為1×106CFU／mL時，其發(fā)光值增加緩慢，大于1×107CFU／mL時，發(fā)光值進入平臺期，見圖3。該方法檢測單增李斯特菌濃度范圍為1×101～1×107CFU／mL，靈敏度小于10 CFU／mL。

圖3 不同濃度單增李斯特菌對發(fā)光值的影響Fig.3 Effect of L.monocytogenes concentration on chemiluminescence value

2.3.2 特異性 結(jié)果顯示，除單增李斯特菌ATCC-19115外，單增李斯特菌CMCC54003、CMCC54004、英諾克李斯特菌也可檢測到，而金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及沙門菌檢測不到，見圖4。表明該方法除單增李斯特菌外，對英諾克李斯特菌有部分交叉反應(yīng)，對其他菌無交叉反應(yīng)。

圖4 不同菌株的發(fā)光值Fig.4 Chemiluminescence valuesof various bacterial strains

2.3.3 準確性 結(jié)果顯示，添加菌液的冰激凌、火腿腸、牛奶均檢出單增李斯特菌，回收率分別為96.3%、90.3%和101.6%，陰性及空白對照均未檢出，見圖5。

圖5 不同介質(zhì)對單增李斯特菌發(fā)光值的影響Fig.5 Effect of media on chemiluminescence value of L.monocytogenes

2.3.4 穩(wěn)定性 結(jié)果顯示，隨放置時間增加，單增李斯特菌發(fā)光值逐漸降低，14 d后降速較緩，28 d發(fā)光值為初始包被值的75.3%，見圖6。方法的穩(wěn)定性良好。

圖6 不同保存時間對單增李斯特菌發(fā)光值的影響Fig.6 Effect of time for storage on chemiluminescence value of L.monocytogenes

3 討論

免疫學(xué)檢測方法具有良好的特異性及重復(fù)性，可同時對多個樣品進行檢測，實現(xiàn)檢測自動化，而單一免疫學(xué)檢測法穩(wěn)定性較差?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析方法是將高特異性的免疫分析法與高靈敏度的化學(xué)發(fā)光分析法結(jié)合后形成的一種新的測定方法，該方法可提高檢測的靈敏度及特異性。

本研究以單增李斯特菌為抗原制備鼠源單抗和兔血清多抗，構(gòu)建“兔血清多抗載體-單增李斯特菌-鼠源單抗”雙抗體夾心反應(yīng)體系，采用魯米諾作為發(fā)光底物，建立檢測單增李斯特菌化學(xué)發(fā)光免疫法，通過優(yōu)化抗體包被濃度、樣本反應(yīng)時間，該方法的檢測范圍達1×101～1×107CFU／mL，較傳統(tǒng)免疫學(xué)方法有顯著優(yōu)勢［18-19］；通對化學(xué)發(fā)光板的穩(wěn)定試驗，為理論貨架期提供了依據(jù)；除單增李斯特菌外，對英諾克李斯特菌有部分交叉反應(yīng)，對其他菌無交叉反應(yīng)，關(guān)于同菌屬的英諾克李斯特菌，可結(jié)合分子生物學(xué)方法作進一步的種屬篩查。

本研究成功建立了檢測單增李斯特菌化學(xué)發(fā)光免疫法，該方法特異性高、操作簡單、反應(yīng)時間短、可批量檢測，能滿足普通的食品單增李斯特菌的快速檢測要求［20-21］，為開展食品風(fēng)險評估，進行風(fēng)險預(yù)警，促進食品安全檢測提供參考依據(jù)。