牛病毒性腹瀉病毒Npro基因克隆、生物信息學(xué)分析及其表達(dá)鑒定

王麗，馬駿，吳陳華，黃雯靜，高麗，付金蕾，趙童，劉思雨，岳山，劉宇，翟軍軍，朱戰(zhàn)波

1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省牛病防控工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319

牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea viruses，BVDV）屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，主要導(dǎo)致牛腹瀉、白細(xì)胞減少、持續(xù)性感染、免疫抑制、產(chǎn)奶量降低和生殖問題等［1］，該病呈世界性分布，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2］。BVDV為單股正鏈RNA，通常基于5′-UTR序列、基因組N-端自身蛋白酶（Npro）或包膜糖蛋白（E2）區(qū)域分為BVDV-1和BVDV-2型［3］。有報(bào)道，第3種遺傳物種BVDV-3被描述為非典型的BVDV［4］。BVDV-1進(jìn)一步分為21個(gè)亞型（1a～1u），BVDV-2分為3個(gè)亞型（2a～2c）。目前中國(guó)主要流行8個(gè)亞型：1a、1b、1c、1d、1m、1o、1p和1q［5］。

BVDV基因組包括4種結(jié)構(gòu)蛋白（C、E0、E1和E2）和8種非結(jié)構(gòu)蛋白（Npro、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）［6-7］。Npro蛋白為ORF中編碼的第1種蛋白質(zhì)，具有蛋白酶活性，可從多聚蛋白鏈上自我裂解下來發(fā)揮作用，其Cys69和His130是蛋白酶活性中心的2個(gè)位點(diǎn)，可催化Tyr164和Vail65間肽鍵的斷裂。Npro蛋白在瘟病毒屬中具有高度的保守性，可通過比較分析該基因序列對(duì)BVDV及瘟病毒屬其他成員的種、群、型進(jìn)行確定［8］，但目前尚不能完全解釋其蛋白水解作用及免疫抑制機(jī)理。本文對(duì)BVDV Npro基因進(jìn)行擴(kuò)增、生物信息學(xué)分析、原核表達(dá)及免疫原性檢測(cè)，旨在為研究Npro蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒株、菌株、細(xì)胞及質(zhì)粒 BVDV-1 NADL株、E.coli DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、pET-28a質(zhì)粒、pcDNA3.1-Npro質(zhì)粒、pcDNA3.1空載體、293T細(xì)胞均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物傳染病病原學(xué)與生物安全實(shí)驗(yàn)室保存并提供；pMD18-T購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠，6周齡，雌性，體重18～20 g，購自吉林省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK2016-0006。

1.3 主要試劑及儀器 高保真Taq酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒購自北京安諾倫生物科技有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自賽默飛世爾科技有限公司；鼠源單抗Anti-His標(biāo)簽抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；IPTG購自上海橋星貿(mào)易有限公司；Ni-NTA柱購自金斯瑞生物有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank上登錄的BVDV Npro基因（NC-001461.1）設(shè)計(jì)引物，序列如下：F：5′-CGGAATTCATGGAGTTGATCACAAATGAACTTTTATACAAAACATACA-3′（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）；R：5′-TGCTCGAGGCAAGTTGTGACCCATAGA-3′（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。BVDV Npro基因全長(zhǎng)為504 bp，編碼168 aa。

1.5 Npro基因的擴(kuò)增 以BVDV-1 NADL株基因組為模板擴(kuò)增Npro基因。反應(yīng)體系（50μL）：模板2μL，上下游引物各1μL，10×bufferⅡ5μL，dNTPs5μL，高保真Taq酶1μL，用無菌去離子水補(bǔ)足體積。以2μL無菌去離子水為模板作為陰性對(duì)照。反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃30 s，59℃30 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，按膠回收試劑盒說明書純化回收。

1.6 重組克隆質(zhì)粒p M D-18T-Npro的構(gòu)建 將純化回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接，構(gòu)建pMD18-T-Npro重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐抗性（終濃度100 mg／L）LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)后挑單個(gè)菌落繼續(xù)培養(yǎng)12 h；提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切（EcoRⅠ／XhoⅠ）鑒定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.7 Npro基因進(jìn)化樹的構(gòu)建及生物信息學(xué)分析 將目的基因測(cè)序進(jìn)行BLAST同源性分析，用MEGA 6.0軟件采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用ExPASy服務(wù)器上的ProtParam工具預(yù)測(cè)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量、原子組成、原子數(shù)、等電點(diǎn)、親水性或疏水性；采用TMHMM server 2.0在線工具進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)分析；使用SignalP 4.1服務(wù)器對(duì)蛋白序列進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)分析；運(yùn)用Raptor（http：／／raptorx.uchicago.edu／Structure Prediction／predict／）預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.8 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將測(cè)序正確的陽性質(zhì)粒pMD18-T-Npro及pET-28a載體分別經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，膠回收酶切產(chǎn)物，16℃連接過夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂布卡那抗性（終濃度100 mg／L）LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)13h；挑取菌落至卡那抗性（終濃度100mg／L）LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h；少量搖菌后小提質(zhì)粒，進(jìn)行PCR及雙酶切（EcoRⅠ／XhoⅠ）鑒定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。鑒定正確的陽性質(zhì)粒命名pET-28a-Npro。

江蘇鄉(xiāng)村旅游起步早，發(fā)展速度快，發(fā)展水平已經(jīng)從粗放復(fù)制走進(jìn)優(yōu)質(zhì)提升的新階段，呈現(xiàn)出品質(zhì)化、特色化、融合化發(fā)展的趨勢(shì)。江蘇具有深厚的文化底蘊(yùn)和得天獨(dú)厚的生態(tài)旅游資源，鄉(xiāng)村旅游產(chǎn)品已經(jīng)從“觀光農(nóng)家樂”的簡(jiǎn)單模式發(fā)展成為“休閑度假”的體驗(yàn)?zāi)Ｊ?，鄉(xiāng)村旅游已基本形成了依托江南文化底蘊(yùn)、經(jīng)營(yíng)農(nóng)事、特色農(nóng)耕文明與現(xiàn)代文明融合發(fā)展的格局，充分滿足了自駕旅游者自由休閑的度假需求。同時(shí)，今年清明和端午小長(zhǎng)假期間，江蘇各地鄉(xiāng)村旅游市場(chǎng)火爆，根據(jù)旅游大數(shù)據(jù)顯示，鄉(xiāng)村族游中跨省跨市出行比例達(dá)56%，每月到鄉(xiāng)村旅游一次的游客比例達(dá)46%。

1.9 Npro蛋白的表達(dá)及可溶性分析 將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落至氨芐抗性（終濃度100 mg／L）液體LB中，37℃，180 r／min振蕩培養(yǎng)至菌液A600約為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1 mmol／L，37℃培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)4 h；收集菌液，7 000×g離心10 min；棄上清，沉淀用PBS（pH 7.4）重懸，冰浴超聲破碎30 min；4℃，10 000×g離心10 min，收集上清及沉淀進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

1.10 重組蛋白的W es t e rn blot分析 將表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-PAGE分離后，經(jīng)半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂乳室溫封閉2 h；以鼠源單抗Anti-His標(biāo)簽抗體作為一抗（1∶2 000稀釋），4℃孵育過夜；TBST洗滌3次，加入HPR標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗（1∶8 000稀釋），室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，DAB顯色。

1.11 重組蛋白的純化及多抗制備 將細(xì)菌沉淀用1×PBS重懸，超聲法破碎，4℃，10000×g離心10 min；收集包涵體，1×PBS洗滌包涵體2～3次，LE Buffer溶解包涵體（100 mmol／L Na2HPO4，10 mmol／L Tris-HCl，8 mol／L Urea，pH 8.0），混勻，室溫孵育30～60 min；4℃，12 000×g離心30 min；收集上清，棄沉淀，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，加入平衡好的Ni-NTA樹脂中，讓樣品緩慢流出，先用5～10倍柱體積的LE Buffer沖洗柱子，再用5～10倍柱體積的Wash Buffer（100 mmol／L Na2HPO4，10 mmol／L Tris-HCl，20 mmol／L imidazole，8 mol／LUrea，pH 8.0）洗滌，最后用Elution Buffer（100 mmol／L Na2HPO4，10 mmol／L Tris-HCl，200 mmol／L imidazole，8 mol／L Urea，pH 8.0）洗脫，每次加入1 mL，收集洗脫液，洗脫至檢出無蛋白。取各管收集液進(jìn)行12%SDSPAGE分析。按Ni-NTA親和層析說明書純化蛋白。將純化的Npro蛋白與等體積完全弗氏佐劑混勻乳化后，按照50 ng劑量皮下注射小鼠進(jìn)行初免，每隔2周加強(qiáng)免疫1次，用50 ng重組Npro蛋白與不完全弗氏佐劑1∶1混合分別作為2、3免抗原。3次免疫后第7天，經(jīng)眼球采血，分離血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.12 多克隆抗體效價(jià)的檢測(cè)及其蛋白反應(yīng)原性鑒定 采用ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，以純化的Npro蛋白作為包被抗原，4℃過夜包被ELISA板，500 ng／孔；以制備的鼠抗Npro蛋白多克隆抗體為一抗（1∶8 000倍比稀釋），HPR標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶8 000稀釋）為二抗，用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450值。計(jì)算陽性血清與陰性血清的A450比（P／N），當(dāng)P／N≤1.5為陰性，1.5＜P／N＜2.1為可疑，P／N≥2.1為陽性。將P／N≥2.1時(shí)所對(duì)應(yīng)的抗體最高稀釋倍數(shù)作為抗體效價(jià)。采用Western blot法鑒定免疫原性，具體分析方法同1.10項(xiàng)，用分離血清作為一抗。

1.13 多克隆抗體的特異性鑒定 采用間接免疫熒光試驗(yàn)，將pcDNA3.1空載體和pcDNA3.1-Npro質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，用制備的鼠抗Npro多克隆抗體作為一抗（1∶500稀釋），室溫孵育1 h；以FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗（1∶100稀釋），室溫孵育1 h；封片，觀察熒光。

2 結(jié)果

2.1 Npro基因P C R擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在504 bp處可見明顯目的條帶，大小與預(yù)期相符，見圖1。

圖1 Npro基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of Npro gene

2.2 重組質(zhì)粒p M D-18T-Npro的鑒定 質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約3 000 bp的載體片段和504 bp的目的基因Npro片段，見圖2。測(cè)序結(jié)果與原序列一致。

圖2 重組質(zhì)粒pMD-18T-Npro的雙酶切（EcoRⅠ／XhoⅠ）鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pMD-18TNpro（EcoRⅠ／XhoⅠ）

2.3 Npro基因進(jìn)化樹的構(gòu)建及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 將BVDV NADL株Npro基因苷酸序列經(jīng)NCBI上的BLAST檢索比對(duì)，應(yīng)用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，NADL株的Npro基因與BVDV V026株Npro基因同源性最近，達(dá)99%，并在同一分支，表明NADL株的Npro基因與BVDV V026株Npro基因具有相似的生物學(xué)功能，見圖3。利用ExPASy服務(wù)器上的Prot-Param工具分析得知，Npro蛋白為親水性蛋白，原子組成C850H1333N239O243S8，原子總數(shù)2 673個(gè)，共有168個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為19 044.87，等電點(diǎn)為9.01；利用TMHMM server 2.0在線工具對(duì)Npro蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析，顯示Npro蛋白的全部氨基酸位于細(xì)胞膜表面，表明Npro是一種外膜蛋白；使用SignalP 4.1服務(wù)器對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白不存在信號(hào)肽；運(yùn)用Raptor在線工具對(duì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，α螺旋占1%，β折疊占30%，無規(guī)則卷曲占69%，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以β折疊與無規(guī)則卷曲為主，見圖4。

圖3 Npro基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Npro gene

圖4 Npro蛋白三維模型構(gòu)建示意圖Fig.4 Three-dimensional modeling of Npro protein

2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒p E T-28a-Npro的鑒定 質(zhì)粒經(jīng)PCR及雙酶切鑒定，在504 bp處可見明顯的目的條帶，大小與預(yù)期相符，見圖5。測(cè)序結(jié)果與原序列一致。

圖5 質(zhì)粒pET-28a-Npro的PCR及雙酶切（EcoRⅠ／XhoⅠ）鑒定Fig.5 Identification of plasmid pET-28a-Npro by PCR and restriction analysis（EcoRⅠ／XhoⅠ）

2.5 表達(dá)產(chǎn)物的S D S-P A G E鑒定 結(jié)果顯示，在沉淀樣品中能正確表達(dá)帶有His標(biāo)簽的重組Npro蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約25 000，與預(yù)期相符，見圖6。

圖6 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE profile of expressed protein

2.6 表達(dá)產(chǎn)物的W es t e rn blot鑒定 結(jié)果顯示，表達(dá)的重組Npro蛋白能被鼠源Anti-His標(biāo)簽抗體識(shí)別，見圖7。

圖7 Npro蛋白的Western blot鑒定Fig.7 Western blotting of Npro protein

2.7 純化產(chǎn)物的S D S-P A G E鑒定 結(jié)果顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約25 000處可見較單一的目的條帶，大小與重組Npro蛋白一致，純度達(dá)95%以上，見圖8。

圖8 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.8 SDS-PAGE profile of purified protein

2.8 鼠抗Npro蛋白多克隆抗體效價(jià) ELISA結(jié)果顯示，當(dāng)血清稀釋倍數(shù)達(dá)到1∶128 000時(shí)，鼠抗Npro蛋白多克隆抗體的A450為1.457，且P／N>2.1，抗體效價(jià)為128 000，見圖9，表明制備的鼠抗Npro蛋白多克隆抗體效價(jià)較高。

圖9 多克隆抗體效價(jià)的ELISA檢測(cè)Fig.9 ELISA of titer of polyclonal antibody

2.9 Npro蛋白的反應(yīng)原性 Western blot分析顯示，重組Npro蛋白能與鼠抗Npro多克隆抗體血清發(fā)生特異性反應(yīng)，反應(yīng)原性較好，而pET-28a誘導(dǎo)菌未發(fā)生特異性反應(yīng)，見圖10。

圖10 Npro蛋白反應(yīng)原性的Western blot鑒定Fig.10 Identification of reactogenicity of Npro protein by Western blot

2.10 鼠抗Npro多克隆抗體的特異性 間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，抗Npro蛋白能夠識(shí)別在293T細(xì)胞中表達(dá)的Npro蛋白，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的細(xì)胞中僅見少量非特異性的熒光標(biāo)記，見圖11。

圖11 鼠抗Npro多克隆抗體特異性的間接免疫熒光試驗(yàn)（×20）Fig.11 Indirect IFA of specificity of mouse polyclonal antibody against Npro（×20）

3 討論

BVDV屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬成員，包括4種結(jié)構(gòu)蛋白和8種非結(jié)構(gòu)蛋白［9］，而非結(jié)構(gòu)蛋白Npro是瘟病毒的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白，具有高度的保守性及蛋白酶活性，但不是病毒復(fù)制所必需的。研究表明，BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白Npro通過泛素化途徑降解BoELF4負(fù)調(diào)控Ⅰ型干擾素的表達(dá)［10］；使用CSFV Npro的細(xì)胞系驗(yàn)證Npro蛋白的存在使IRF3表達(dá)減少，表明瘟病毒特有的這種單一病毒蛋白可在先天免疫系統(tǒng)中抑制干擾素的產(chǎn)生［11］；Npro蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)中通過抑制Ⅰ型干擾素來干擾先天免疫抑制，這種免疫抑制可能與免疫耐受和BVDV中持續(xù)感染（persistent infection，PI）的發(fā)展有關(guān)［12］。但目前尚不能完全解釋其蛋白水解作用及免疫抑制機(jī)理。

李慧昕等［13］將BVDV Npro基因克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6p-1上，并轉(zhuǎn)化至相應(yīng)的宿主大腸埃希菌BL21（DE3）中，獲得了高效表達(dá)，但用Western blot法未能檢測(cè)到蛋白的反應(yīng)條帶，推測(cè)這種蛋白可能存在構(gòu)象表位。本研究通過PCR法擴(kuò)增BVDV Npro基因，并將該基因與表達(dá)載體pET-28a連接，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21（DE3）中。該基因在大腸埃希菌中高效表達(dá)，并形成包涵體。有研究表明，在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體，可能是由于重組蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的酶類和輔助因子、表達(dá)的溫度不適合、二硫鍵不能正確配對(duì)、蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等［14］。宮曉煒［15］通過間接免疫熒光試驗(yàn)和Western blot法檢測(cè)BVDV細(xì)胞中感染的病毒粒子和表達(dá)的病毒蛋白，結(jié)果證實(shí)兔抗Npro多克隆抗體具有較高的親和力。本研究用Npro蛋白免疫小鼠，制備Npro多克隆抗體，通過間接免疫熒光試驗(yàn)和Western blot法證明制備的鼠抗Npro多克隆抗體能與重組Npro蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，與宮曉煒［15］的研究結(jié)果一致。

本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)BVDV Npro蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并進(jìn)行了原核表達(dá)及多克隆抗體制備，結(jié)果表明，Npro是一種外膜蛋白，具有親水性，不存在信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以β折疊與無規(guī)則卷曲為主；成功構(gòu)建了pET-28a-Npro重組質(zhì)粒并表達(dá)了重組Npro蛋白，純化后蛋白純度達(dá)95%，可被鼠源Anti-his標(biāo)簽抗體識(shí)別；制備的多克隆抗體具有較好的特異性。但目的蛋白以包涵體形式存在，給后續(xù)蛋白純化及純化后蛋白的復(fù)性帶來難度，因此，在后續(xù)試驗(yàn)中，我們將對(duì)原核表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，如誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、誘導(dǎo)劑濃度及表達(dá)載體等，以期使目的蛋白以可溶性形式表達(dá)，為后續(xù)進(jìn)一步研究BVDV Npro蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。