甲型肝炎病毒L-A-1株在人胚肺二倍體細(xì)胞2B S株上的遺傳穩(wěn)定性

徐艷玲，李昊堃，王藝博，夏青娟，岳立廣，劉令九

長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林長春130012

甲型肝炎是由甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）引起的一種急性自限性疾病，主要經(jīng)糞-口途徑傳播，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡［1］，其發(fā)病率與社會經(jīng)濟(jì)生活水平和環(huán)境衛(wèi)生情況密切相關(guān)［2-3］。目前，甲型肝炎在全球部分地區(qū)仍有暴發(fā)［4-5］，接種甲型肝炎疫苗是預(yù)防和控制該病的有效措施［6］。近年，隨著疫苗接種率的提高，我國甲型肝炎發(fā)病率呈逐年遞減趨勢，流行特征呈地區(qū)性分布［7］，但局部暴發(fā)時(shí)有發(fā)生。

HAV基因組是一條長約7 500 bp的單鏈線性正股RNA，分為5′端非編碼區(qū)、開放性讀碼框（open reading frame，ORF）和含有Poly（A）尾的3′端UTR。HAV ORF較長，可編碼1個(gè)2 227個(gè)氨基酸殘基的多聚蛋白，該多聚蛋白可分為P1、P2和P3區(qū)。其中P1區(qū)編碼結(jié)構(gòu)蛋白，包括VP4（1A）、VP2（1B）、VP3（1C）、VP1（1D）；P2和P3區(qū)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。HAV的衣殼蛋白由VP1～VP4組成，其中VP1、VP2、VP3是構(gòu)成病毒衣殼蛋白的主要部分。研究表明，HAV的抗原性與病毒蛋白的立體結(jié)構(gòu)有關(guān)，VP3和VP1在衣殼上的天然構(gòu)象形成單個(gè)抗原表位，可誘發(fā)中和抗體反應(yīng)［8-9］。目前，國內(nèi)凍干甲型肝炎減毒活疫苗使用的毒株為L-A-1和H2減毒株，這兩種病毒株生產(chǎn)的疫苗均具有良好的安全性和免疫原性［10］。疫苗生產(chǎn)過程中，毒株傳代的穩(wěn)定性與疫苗質(zhì)量密切相關(guān)，因此，本研究對甲型肝炎病毒L-A-1株在人胚肺二倍體細(xì)胞2BS株（簡稱2BS細(xì)胞）上連續(xù)傳代的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)，為疫苗的質(zhì)量控制及滅活疫苗的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及病毒株 2BS細(xì)胞和HAVL-A-1株（23代）由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗二室提供。

1.2 主要試劑 MEM培養(yǎng)基購自日本日水制藥株式會社；新生牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司；胰蛋白酶購自美國Gibco公司；定性甲肝抗原（hepatitis A antigen，HAAg）診斷試劑盒和HAV抗體診斷試劑盒購自北京萬泰生物藥業(yè)有限公司；病毒基因組RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA marker DL2000和One Step RNA PCR kit（AMV）購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級ICR小鼠，雌雄各半，體重14～16 g，購自北京華阜康生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為：SCXK（京）2014-0004。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出2BS細(xì)胞，37℃水浴中復(fù)蘇，用10 mL含10%新生牛血清的MEM培養(yǎng)液按1∶2的比例傳代，37℃培養(yǎng)至細(xì)胞長成單層后，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶4的比例傳代培養(yǎng)至31代。

1.5 病毒培養(yǎng)及傳代 將第23代HAV L-A-1株采用混懸感染的方式，按MOI=0.2接種至31代2BS細(xì)胞，35℃培養(yǎng)7 d；更換含2%新生牛血清的MEM培養(yǎng)液，于接種后21 d收獲病毒液，-60℃以下凍存。按該方法連續(xù)傳10代，取第23、24、26、28和32代病毒（分別命名為L-A-1-23、L-A-1-24、L-A-1-26、L-A-1-28、L-A-1-32），采用HAAg診斷試劑盒檢測病毒抗原含量，Reed-Muench法［11］計(jì)算病毒滴度。

1.6 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中登錄的HAV減毒株基因序列（AF314208），應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)7對引物，各擴(kuò)增片段大小約1 000 bp，片段間約有200 bp重疊，并用Oligo 7.0軟件驗(yàn)證引物。引物序列見表1，由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

表1 HAV L-A-1株基因組擴(kuò)增的引物序列Tab.1 Primer sequences for amplification of genome of L-A-1 strain

1.7 基因序列分析 用病毒基因組RNA提取試劑盒提取5代病毒基因組RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，HAV1～HAV7為引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃30 s，45～60℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送吉林省庫美生物科技有限公司測序。采用DNAMAN軟件對病毒基因序列片段進(jìn)行拼接，得到全基因組核苷酸序列，并對不同代次病毒的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行多序列對比分析；將L-A-1-32代次病毒與GenBank中登錄的國內(nèi)外其他主要HAV毒株核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對及同源性分析，并比較分析L-A-1-32代次病毒與國內(nèi)外主要HAV毒株的VP1和VP3蛋白的氨基酸序列，國內(nèi)外主要HAV毒株的相關(guān)信息見表2。

表2 國內(nèi)外主要HAV毒株的相關(guān)信息Tab.2 Data on major HAV strains at home and abroad

1.8 HA V L-A-1株免疫原性的檢測 取L-A-1-23、L-A-1-24、L-A-1-26、L-A-1-28、L-A-1-32代 次 病 毒收獲液，4 058×g離心15 min，棄上清，用5 mLHank′s液收集沉淀，混勻，加入5 mL三氯甲烷，振蕩30 min；4 058×g離心30 min，取上清。重復(fù)操作1次，將兩次的上清液混合，即為病毒純化液。將ICR小鼠隨機(jī)分為L-A-1-23組、L-A-1-24組、L-A-1-26組、L-A-1-28組、L-A-1-32組、陰性對照組和空白對照組，每組10只。試驗(yàn)組分別經(jīng)小鼠腹腔免疫各代次病毒純化液，陰性對照組免疫生理鹽水，均0.5 mL／只；空白對照組小鼠不免疫。免疫后28 d經(jīng)心臟采血，分離血清，采用HAV抗體診斷試劑盒檢測血清抗體效價(jià)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSSStatistics 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，免疫原性檢測結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HA V L-A-1株病毒抗原含量及病毒滴度 各代次HAV L-A-1株病毒在2BS細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，抗原含量在10 240～20 480 EU／mL之間，病毒滴度為7.00～7.50 lgCCID50／mL，見表3。表明HAV L-A-1株在2BS細(xì)胞上傳代穩(wěn)定性較好。

表3 各代次HAV L-A-1株病毒抗原含量及病毒滴度Tab.3 Antigen contents and virus titers of HAV L-A-1 strain of various passages

2.2 HA V L-A-1株基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 各代次HAV L-A-1株病毒基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，均可見約1 000 bp的HAV1～HAV7目的基因片段，大小均與預(yù)期相符，L-A-1-23代次病毒結(jié)果見圖1（其他代次結(jié)果略）。

圖1 HAV L-A-1-23代次病毒各基因片段PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of HAV L-A-1 strain of passage 23

2.3 各代次HA V L-A-1株基因組核苷酸及氨基酸序列的同源性 各代次HAV L-A-1株基因組序列全長均為7 420 bp，5′UTR的核苷酸為1～736 bp，ORF以737 nt處的ATG為起始密碼子，編碼2 225個(gè)氨基酸，包括862個(gè)疏水性氨基酸、790個(gè)親水性氨基酸、278個(gè)堿性氨基酸、248個(gè)酸性氨基酸及較短的3′UTR區(qū)。各代次HAV L-A-1株間核苷酸和氨基酸序列同源性均為100%。

2.4 HA V L-A-1株與國內(nèi)外主要HA V毒株核苷酸及氨基酸序列的同源性 國內(nèi)外主要HAV毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分別達(dá)91%和98%以上。L-A-1-32代次毒株與國內(nèi)外其他主要HAV毒株核苷酸序列同源性為91.40%～99.70%，氨基酸序列同源性為98.20%～99.69%；與L-A-1參考株（AF314208）比較，核苷酸和氨基酸序列同源性最高，分別為99.70%和99.69%；與MBB、LV8和H2K25株核苷酸序列同源性分別為98.84%、94.74%和98.13%，與H2W株核苷酸序列同源性最低，為91.40%；與H2K25株氨基酸序列同源性最高，為99.69%，與GBM和H2W株氨基酸序列同源性最低，為98.20%。見表4和表5。

表4 L-A-1-32代次病毒與國內(nèi)外主要HAV毒株核苷酸序列的同源性（%）Tab.4 Homologies of nucleotide sequences of L-A-1 strain of passage 32 to those of major virus strains at home and abroad（%）

表5 L-A-1-32代次病毒與國內(nèi)外主要病毒株氨基酸的同源性（%）Tab.5 Homologies of amino acids of L-A-1 strain of passage 32 to those of major virus strains at home and abroad（%）

2.5 HA V L-A-1株與國內(nèi)外主要HA V病毒株VP1區(qū)氨基酸序列比對 各毒株間有5處氨基酸序列不一致。其中，有2處發(fā)生在GBM株及H2W株VP1的第28及296位氨基酸，均由K變?yōu)镽；LV8株VP1的第17位氨基酸由V變?yōu)镈；MBB株VP1的第147位氨基酸由T變?yōu)镮；HM175減毒株和LV8株VP1的第272位氨基酸由E變?yōu)閂。L-A-1-32代次病毒與參考株（AF314208）和H2K25減毒株VP1區(qū)氨基酸序列完全一致，表明HAV L-A-1株VP1蛋白具有良好的遺傳穩(wěn)定性，見圖2。

圖2 HAV L-A-1株與國內(nèi)外主要HAV毒株VP1區(qū)的氨基酸序列Fig.2 Comparison of VP1 amino acid sequences in VP1 region of L-A-1 with those of major virus strains at home and abroad

2.6 HA V L-A-1株與國內(nèi)外主要HA V毒株VP3區(qū)氨基酸序列比對 各毒株VP3間有2處氨基酸序列不一致，H2W株VP3的第32位氨基酸由Q變?yōu)镻；H2W株和GBM株的第144位氨基酸由S變?yōu)門；L-A-1-32代次病毒與參考株（AF314208）和H2K25減毒株VP3區(qū)氨基酸序列完全一致，見圖3。表明HAV L-A-1株VP3蛋白具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖3 HAV L-A-1株與國內(nèi)外主要HAV毒株VP3區(qū)的氨基酸序列Fig.3 Comparison of VP1 amino acid sequences in VP3 region of L-A-1 with those of major virus strains at home and abroad

2.7 HA V L-A-1株的免疫原性 L-A-1-23組、L-A-1-24組、L-A-1-26組、L-A-1-28組、L-A-1-32組免疫后小鼠血清抗體效價(jià)分別為（684.69±5.95）、（750.93±14.47）、（997.84±2.60）、（854.16±15.60）、（850.11±6.20）m IU／mL，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.491，P＞0.05），陽轉(zhuǎn)率均為100%，陰性對照組和空白對照組小鼠血清抗體檢測均為陰性。

3 討論

HAV L-A-1株的傳代穩(wěn)定性在疫苗質(zhì)量控制中具有重要意義。本研究將HAV L-A-1株在2BS細(xì)胞上連續(xù)傳代至32代，采用RT-PCR法對不同代次病毒全基因組序列進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示，HAV L-A-1株23、24、26、28和32代次病毒間核苷酸和氨基酸序列同源性均為100%；病毒滴度均在7.00 lgCCID50／mL以上，符合《中國藥典》三部（2015版）［12］相關(guān)要求，且抗原含量相對比較穩(wěn)定。表明HAV L-A-1株在傳代過程中保持了良好的抗原性和感染性，且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

將L-A-1-32代次病毒與GenBank中登錄的目前國內(nèi)外主要HAV毒株進(jìn)行基因序列比對，結(jié)果表明，國內(nèi)外主要的HAV毒株氨基酸序列同源性達(dá)98%以上，L-A-1-32代次病毒與L-A-1株參考株（AF314208）核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.70%和99.69，與MBB和H2K25核苷酸序列同源性分別為98.84%和98.13%，與H2W株核苷酸序列同源性最低，為91.40%；L-A-1-32代次病毒與H2K25株氨基酸序列同源性最高，為99.69%，與GBM和H2W株氨基酸序列同源性最低，為98.20%。表明國內(nèi)外主要的HAV株間氨基酸序列同源性較高。

HAV只有一個(gè)血清型，其基因組VP1和VP3區(qū)是主要的抗原區(qū)域，本研究進(jìn)一步對HAV L-A-1株與國內(nèi)外主要HAV株基因組VP1和VP3蛋白區(qū)域的氨基酸序列進(jìn)行分析比較，結(jié)果表明，在VP1區(qū)HAV L-A-1株與各病毒株之間有5處氨基酸序列不一致，其中2處發(fā)生在GBM和H2W株，LV8株、MBB株和HM175減毒株和LV8株各1處；在VP3區(qū)各病毒株間有2處氨基酸序列不一致，L-A-1-32代次病毒與參考株（AF314208）和H2K25株VP1和VP3區(qū)氨基酸序列完全一致。表明國內(nèi)使用的甲型肝炎減毒活疫苗株的主要抗原位點(diǎn)氨基酸序列保守，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道［9，13-15］一致，且VP1和VP3區(qū)基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性極少由于細(xì)胞株更改而發(fā)生變異。

為進(jìn)一步評價(jià)HAV L-A-1株不同代次的免疫原性，用L-A-1株23、24、26、28和32代次病毒液的純化產(chǎn)物免疫小鼠，結(jié)果表明，均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體，陽轉(zhuǎn)率為100%，表明不同代次L-A-1株病毒具有良好的免疫原性。綜上所述，HAV L-A-1株在2BS細(xì)胞連續(xù)傳代后，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。本研究為疫苗的質(zhì)量控制及滅活疫苗的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。