SARS-CoV-2亞單位疫苗研究現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)

楊柏峰，張家友，李啟明

1.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430207；2.國家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430207；3.國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司，北京 101111

20世紀(jì)60年代第1次發(fā)現(xiàn)了人類冠狀病毒，因其形似皇冠而得名［1］。由重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的2019冠狀病毒?。–oronavirus Disease 2019，COVID-19）大流行給全球社區(qū)、醫(yī)療系統(tǒng)和經(jīng)濟(jì)帶來前所未有的壓力［2］，SARSCoV-2成為第7種可感染人的冠狀病毒［3］。截至2021年6月7日，WHO公布數(shù)據(jù)顯示，全球223個國家和地區(qū)累計(jì)確診病例達(dá)173 005 553例，其中死亡病例3 727 605例［4］。COVID-19疫苗是預(yù)防和控制SARS-CoV-2感染最有效和經(jīng)濟(jì)的干預(yù)性手段，因此，加速開發(fā)安全有效的COVID-19疫苗已成為全球研發(fā)的重點(diǎn)。目前正在研發(fā)的COVID-19候選疫苗根據(jù)技術(shù)路線大致分為病毒類疫苗、蛋白類疫苗、核酸類疫苗和載體類疫苗，各類疫苗均有其優(yōu)缺點(diǎn)［5］。已有101種候選疫苗進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)，其中亞單位疫苗有37種。世界各國已獲得緊急使用的疫苗有15種，包括2種基因工程重組亞單位疫苗：ZF2001（安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司）、Epi VacCorona（俄羅斯“矢量”國家病毒學(xué)與生物技術(shù)研究中心）。

本文重點(diǎn)對臨床試驗(yàn)的亞單位疫苗、構(gòu)建平臺技術(shù)和最新進(jìn)展作一綜述。

1 SARS-CoV-2蛋白特征

SARS-CoV-2是單股正鏈RNA包膜病毒，基因組長度約30 000 bp，與SARS-CoV-1的基因同源性高達(dá)79.6%［6］。以SARS-CoV-2參考序列（NC_045512.2）為例，包含11個基因，分別對應(yīng)11個開放閱讀框（open reading frames，ORFs）：1個編碼多聚蛋白ORFs（ORF1ab）、4個編碼結(jié)構(gòu)蛋白ORFs（ORF2、ORF4、ORF5和ORF9）（表1）、6個編碼輔助蛋白ORFs（ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8和ORF10）［7］。

表1 SARS-CoV-2（NC_045512.2）結(jié)構(gòu)蛋白Tab.1 Structural proteins of SARS-CoV-2（NC_045512.2）

1.1 S蛋白 SARS-CoV-2S蛋白是病毒表面的一種高糖基化的Ⅰ型膜蛋白，呈三聚體結(jié)構(gòu)，很大程度上決定了細(xì)胞的趨性和宿主范圍［8］。S蛋白相對分子質(zhì)量約140 000，由S1和S2亞基兩部分組成。S1亞基包括N-端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD）和C-端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）［8］。從COVID-19康復(fù)者體內(nèi)可篩選出多個靶向NTD的中和抗體，均有很強(qiáng)的中和活性［9］。CTD中有一個關(guān)鍵蛋白，即受體結(jié)合域（receptor-binding domain，RBD），約含193個氨基酸，相對分子質(zhì)量大小約為52 900，含8個半胱氨酸，形成4個二硫鍵，3個位于RBD核心，1個位于受體結(jié)合基序內(nèi)，RBD與人上皮細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（human angiotensin-converting enzyme 2，hACE2）結(jié)合，介導(dǎo)病毒對宿主細(xì)胞的黏附［8］。電鏡發(fā)現(xiàn)［9］，RBD含有多種構(gòu)象表位，是研發(fā)新冠候選疫苗最具潛力的抗原之一，但RBD單體誘導(dǎo)的免疫原性低。目前可通過增加抗原大小、多聚體形式或使單體富集在顆粒表面等方法提高單體RBD的免疫原性。S2亞基含有1個furin切割位點(diǎn)，由138個氨基酸組成，介導(dǎo)病毒膜與宿主細(xì)胞膜的融合，是病毒侵襲宿主細(xì)胞的一個關(guān)鍵步驟。S2亞基含有誘導(dǎo)中和抗體的表位或不同免疫優(yōu)勢的T細(xì)胞表位，由內(nèi)部膜融合肽、2個七肽重復(fù)序列（heptad repeat region，HR1／2）、近膜端外部區(qū)域（membrane proximal external region，MPER）和轉(zhuǎn)膜基序組成，是當(dāng)前候選疫苗開發(fā)的最主要靶點(diǎn)。

1.2 M蛋白 M蛋白是位于病毒表面的一種轉(zhuǎn)膜糖蛋白，有N-端胞外結(jié)構(gòu)域、三次跨膜結(jié)構(gòu)域和內(nèi)部C-端結(jié)構(gòu)域，相對分子質(zhì)量大小約為25 000，促進(jìn)病毒膜的完整性［10］。N-端和C-端分別各有1個免疫優(yōu)勢表位，在三次跨膜結(jié)構(gòu)域中有1個T細(xì)胞表位簇，能誘導(dǎo)較強(qiáng)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)［10］。在動物模型中證明［11］，畢赤酵母表達(dá)的M蛋白可誘導(dǎo)具有保護(hù)性的體液免疫反應(yīng)，可作為疫苗的候選抗原之一。

1.3 N蛋白 N蛋白相對分子質(zhì)量大小約為50 000，有分子伴侶活性，與RNA結(jié)合促進(jìn)核衣殼的形成，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的病毒出芽、RNA復(fù)制和mRNA轉(zhuǎn)錄等［12］。研究發(fā)現(xiàn)［13］，在N蛋白的C-端有不同的免疫優(yōu)勢表位。在COVID-19患者中，89%可檢測到針對N蛋白的抗體，是疫苗中誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)的代表性抗原，誘導(dǎo)SARS-CoV-2特異性T細(xì)胞的浸入和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），可作為疫苗研發(fā)的候選抗原之一。

1.4 E蛋白 當(dāng)前對于SARS-CoV-2 E蛋白的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制了解較少。E蛋白是冠狀病毒的小分子完整膜蛋白，助力于病毒生命周期的各方面，如病毒組裝、出芽、包膜形成以及致?。?4］。E蛋白具有離子通道的活性，單獨(dú)E蛋白免疫原性較弱，是其不能作為疫苗候選抗原的一個重要原因。研究發(fā)現(xiàn)［15］，SARS-CoV-1 E蛋白可誘導(dǎo)IL-1、TNF和IL-6等炎性因子的產(chǎn)生，因此，E蛋白或許是該病毒的一種重要毒力因子。

2 亞單位疫苗

亞單位疫苗是利用微生物的某種表面結(jié)構(gòu)成分（抗原）制成不含有核酸、能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體的疫苗，抗原成分明確，安全性好，但需添加佐劑來增強(qiáng)疫苗效果。亞單位疫苗的成功制備，需要高效的體外表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗原，常用表達(dá)系統(tǒng)有原核表達(dá)系統(tǒng)（prokaryotic expression system）、酵母表達(dá)系統(tǒng)（yeast expression system）、桿狀病毒／昆蟲表達(dá)系統(tǒng)（baculovirus／insect cell expression system）和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（mammalian expression system）。當(dāng)前進(jìn)入臨床階段的新冠亞單位疫苗有蛋白和病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP）兩類，分別有32和5種，大多數(shù)是基于S蛋白或S蛋白的一些特殊結(jié)構(gòu)蛋白設(shè)計(jì)的候選疫苗，也有多組分亞單位候選疫苗（表2）。下面以不同表達(dá)系統(tǒng)為例介紹新冠亞單位疫苗的研究進(jìn)展。

表2 正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的新冠亞單位疫苗Tab.2 SARS-CoV-2 subunit vaccines candidates in clinic

2.1 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供準(zhǔn)確的糖基化等多種翻譯后加工修飾，是最具潛力的表達(dá)系統(tǒng)之一。常用表達(dá)細(xì)胞有中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）、人胚腎細(xì)胞（HEK293）和COS細(xì)胞等，其中CHO細(xì)胞易培養(yǎng)、成本低且安全性好，已成為最常用的表達(dá)細(xì)胞系之一［16］。應(yīng)用實(shí)例如下。

中國科學(xué)院微生物研究所與安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司合作，體外構(gòu)建含MERS-CoV SP序列→RBD_1（R319-K537）-RBD_2（R319-K537）的cDNA序列載體，利用CHO細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)由二硫鍵相連的RBD串聯(lián)重復(fù)序列（RBD二聚體），與氫氧化鋁佐劑配伍制成亞單位疫苗（ZF2001）［17］。該RBD二聚體充分暴露了與中和抗體（NAb）結(jié)合的雙受體結(jié)合基序，與hACE2的親和力和RBD單體一樣好。Ⅰ／Ⅱ期臨床數(shù)據(jù)顯示，該疫苗具有良好的安全性和免疫原性，在中國和烏茲別克斯坦已批準(zhǔn)緊急使用。

SCB-2019是三葉草生物制藥公司利用其獨(dú)有的專利技術(shù)Trimer-Tag?（蛋白質(zhì)三聚體化）開發(fā)的新冠重組亞單位疫苗［18］。利用基因工程方法構(gòu)建“S-Trimer”重組蛋白基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞表達(dá)目的蛋白。因Protein A樹脂與人IgG1 Fc段具有高親和力，將Endo180-Fc融合蛋白負(fù)載到Protein A樹脂上，制成“特制”層析柱，再利用Trimer-Tag與Endo180（Endocytic 180）之間的高親和力純化出與冠狀病毒S蛋白構(gòu)象高度相似的共價(jià)三聚體融合蛋白重組抗原“S-Trimer”。Ⅰ期臨床結(jié)果顯示［19］，含AS03或CpG／氫氧化鋁佐劑的SCB-2019疫苗均誘導(dǎo)了較強(qiáng)的體液免疫和CD4+Th1型細(xì)胞免疫，具有較好的病毒中和活性，且耐受性好。目前正在開展Ⅱ／Ⅲ期（NCT04672395）臨床實(shí)驗(yàn)。

SARS-CoV-2 Sclamp是澳洲昆士蘭大學(xué)利用新型分子鉗“molecular clamp”疫苗平臺技術(shù)開發(fā)的一種新冠亞單位疫苗［20］。該平臺技術(shù)通過了2018年由流行病防范創(chuàng)新聯(lián)盟（The Coalition for Epidemic Preparedness Innovations，CEPI）發(fā)起的針對不同病原體引起的疾病的快速反應(yīng)評審會。其優(yōu)勢是無需增加其他位點(diǎn)特異性突變即可使目標(biāo)抗原穩(wěn)定在融合前構(gòu)象，誘導(dǎo)的高水平中和抗體具有廣譜性，可針對病毒粒子表面的一些構(gòu)象表位。該“分子鉗”三聚域來自人類免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）糖蛋白41（gp41）的七肽重復(fù)區(qū)1和2（HR1／2，氨基酸540-576和619-656），可組裝成一個極其穩(wěn)定的六螺旋束。通過基因工程手段用甘氨酸linker（GSG）取代680-SPRRARSVASQ-690中的RS，之后，用“分子鉗”三聚域序列替換S蛋白的TM基序，構(gòu)建目的基因+“分子鉗”三聚域的表達(dá)載體，瞬時轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，表達(dá)具有融合前構(gòu)象的Sclamp三聚體蛋白。研究證實(shí)，該三聚體蛋白構(gòu)象在4℃下可保持3個月，甚至長時間暴露在熱應(yīng)激下也能很好地維持其構(gòu)象，與MF59佐劑配伍制成新冠亞單位候選疫苗。Ⅰ期臨床研究結(jié)果表明［21］，該疫苗具有良好的耐受性，誘導(dǎo)的中和抗體水平與輕度至中度COVID-19康復(fù)者血清抗體水平類似。但“分子鉗”中HIV-1 gp41誘導(dǎo)的抗體干擾了HIV陽性的篩查，因此停止了Sclamp疫苗的進(jìn)一步臨床研究。該研究小組已用新的三聚域代替gp41，正在重新開展Ⅰ期臨床研究。

芬蘭疫苗研究所開發(fā)的RBD-TT新冠亞單位候選疫苗也是利用CHO細(xì)胞來表達(dá)RBD抗原［22］。該重組RBD是從319-541增加了1個Cys538，該Cys通常與S蛋白中C590相連，還增加了2個N-糖基化位點(diǎn)（Asn331和Asn343）和2個O-糖基化位點(diǎn)（Thr323和Ser325）。由于發(fā)酵過程中Cys538與培養(yǎng)基中存在的Cys通過1個S-SCys自然加成反應(yīng)被保護(hù)起來，不會與其他8個Cys殘基競爭性結(jié)合。ESI-MS結(jié)果顯示，該重組RBD含有4個二硫鍵，表明多余的Cys538不影響RBD的正確折疊。使用三（2-羧乙基）膦（TCEP）可將半胱氨?；腃ys538還原為硫醇，之后與用交聯(lián)劑3-馬來酰亞胺丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（SMP）處理過的含多個馬來酰亞胺基的TT相連，得到RBDn-TT結(jié)合物，利用該技術(shù)可獲得表面呈現(xiàn)多價(jià)RBD的大分子結(jié)構(gòu)，更好地暴露受體結(jié)合基序，利于免疫系統(tǒng)識別。TT作為載體蛋白已成功應(yīng)用于Hib和肺炎等多糖蛋白結(jié)合疫苗中，這是首次用于冠狀病毒蛋白疫苗中。與單獨(dú)RBD相比，高免疫原性的載體蛋白攜帶的多個T和B細(xì)胞表位可潛在激活細(xì)胞免疫反應(yīng)。臨床前研究發(fā)現(xiàn)［22］，過繼轉(zhuǎn)移RBD6-TT疫苗誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞后，用3μg RBD／Alum加強(qiáng)免疫，誘導(dǎo)的RBD特異性IgG水平更高，在轉(zhuǎn)移RBD／Alum的淋巴細(xì)胞的小鼠組未觀察到此現(xiàn)象。該疫苗還誘導(dǎo)了高水平的IFNγ（Th1），未檢測到IL-4和IL-17A，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測到分泌IFNγ、TNF-α和顆粒酶（細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞釋放的細(xì)胞漿顆粒）的CD8+CD44high記憶T細(xì)胞。該疫苗已完成Ⅰ期、Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)，正在開展Ⅲ期臨床研究，至今未公布Ⅰ／Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

美國沃爾特·里德陸軍研究所（Walter Reed Army Institute of Research，WRAIR）基于幽門螺旋桿菌鐵蛋白（Helicobacter pylori ferritin）的多聚化平臺技術(shù)，利用人HEK293細(xì)胞系表達(dá)研發(fā)了新冠重組亞單位納米顆粒疫苗（SpFN_1B-06-PL）［23］。該平臺技術(shù)已應(yīng)用于流感病毒［24］、HIV［25］和EB病毒［26］等其他病毒的抗原。H.pylori鐵蛋白自組裝成具有8個三重對稱軸的24亞基顆粒，將病毒糖蛋白的單個原聚體融合到H.pylori鐵蛋白亞基的N-末端區(qū)域有助于組裝蛋白質(zhì)納米顆粒，該蛋白質(zhì)納米顆粒在3倍軸的表面上可顯示8個三聚體抗原拷貝［27］。與單獨(dú)抗原相比，該蛋白質(zhì)納米顆粒誘導(dǎo)了更強(qiáng)的中和抗體反應(yīng)［23］。已有兩種基于H.pylori鐵蛋白的流感疫苗［28］在臨床試驗(yàn)中證明了其安全性和免疫原性（NCT03186781，NCT03814720）。通過基因手段構(gòu)建的表達(dá)載體包括：刪除了C-末端70個殘基的截短S蛋白（SΔC）、一個突變的fulin裂解位點(diǎn)：精氨酸-精氨酸-丙氨酸-精氨酸突變?yōu)橐粋€丙氨酸、在986和987位置增加了2個脯氨酸，穩(wěn)定S蛋白處于融合前的構(gòu)象，用人HEK293細(xì)胞系表達(dá)SΔC-Fer，與QS-21佐劑配伍制成新冠亞單位疫苗。該疫苗正在進(jìn)行Ⅰ期臨床研究。

2.2 桿狀病毒／昆蟲表達(dá)系統(tǒng) 昆蟲細(xì)胞具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器，可對桿狀病毒表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行加工修飾，因此，桿狀病毒／昆蟲表達(dá)系統(tǒng)已發(fā)展為一個生產(chǎn)功能性或免疫原性重組蛋白的常用真核表達(dá)系統(tǒng)［29］。該系統(tǒng)還可容載大片段基因，使多個基因共表達(dá)，是表達(dá)VLP多價(jià)疫苗的最佳表達(dá)系統(tǒng)。第一個利用該表達(dá)系統(tǒng)（粉蚊夜娥細(xì)胞系，High Five）生產(chǎn)的人用疫苗是GSK研發(fā)的用于預(yù)防子宮癌的Cervarix?［30］。應(yīng)用實(shí)例如下。

美國Novavax公司利用該系統(tǒng)（草地貪夜蛾細(xì)胞，Spodoptera frugiperda cellline9，Sf9細(xì)胞）開發(fā)了一款基于全長S蛋白的重組納米顆粒疫苗（VNXCoV2373）［31］。該S蛋白序列進(jìn)行了2處改造，一處是在S1／S2裂解位點(diǎn)將682-RRAR-685突變?yōu)?82-QQAQ-685，使重組蛋白具有蛋白酶抗性；另一處是在S2亞基的七肽重復(fù)序列1／中心螺旋（HR1／CH）頂端處將986-KV-987突變?yōu)?86-PP-987，使S蛋白穩(wěn)定在融合前構(gòu)象，不僅與hACE2具有高親和力，還顯示出耐熱穩(wěn)定性。與基于皂甙的佐劑（Matrix-M1）配伍制成納米顆粒疫苗。1／2期臨床結(jié)果顯示，NVX-CoV2373疫苗接種后35 d，表現(xiàn)出安全性良好，誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)超過COVID-19患者康復(fù)期血清水平，含Matrix-M1佐劑組疫苗誘導(dǎo)了偏向Th1型的CD4+T細(xì)胞免疫。

賽諾菲公司對S蛋白序列進(jìn)行改造，在S2亞基C-端序列引入2個脯氨酸突變，該修飾使S蛋白穩(wěn)定在融合前構(gòu)象，增加了蛋白的穩(wěn)定性和三聚化，利用expresSF+昆蟲細(xì)胞表達(dá)重組preSdTM抗原，與GSK公司的AS03佐劑配伍制成亞單位疫苗（VAT-00002）［32］。Ⅰ／Ⅱ期臨床結(jié)果顯示，該疫苗在老年組誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)低于預(yù)期，加強(qiáng)免疫后副反應(yīng)較高。分析發(fā)現(xiàn)，用于定量S蛋白抗原的試劑（一種單克隆抗體）與配方中存在的糖基化的宿主蛋白（桿狀病毒蛋白）發(fā)生交叉反應(yīng)，使得抗原定量濃度低估4～6倍，導(dǎo)致制品中預(yù)期抗原含量低。但該臨床實(shí)驗(yàn)得出的積極結(jié)論是在preS dTM中需要添加佐劑，且AS03效果優(yōu)于AF03佐劑，需進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)工藝及對含AS03佐劑的疫苗進(jìn)行配方和劑量研究。目前正在19～44歲、45～64歲、65～80歲和80歲以上人群中開展Ⅲ期（PACTR202011523101903）臨床實(shí)驗(yàn)。

2.3 原核表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng) 原核表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清晰、操作簡單、表達(dá)量高、成本低和周期短等特點(diǎn)，是生物制品生產(chǎn)的首選表達(dá)系統(tǒng)，缺點(diǎn)是原核細(xì)胞缺少真核細(xì)胞翻譯后修飾（糖基化、磷酸化等）所需的細(xì)胞器和酶，對病毒類復(fù)雜性蛋白的表達(dá)較困難。成功的標(biāo)志性事件是2012年全球首個戊型肝炎疫苗（VLP）在中國上市［33-34］。酵母表達(dá)系統(tǒng)也具有遺傳背景清晰、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制清楚、不產(chǎn)內(nèi)毒素等優(yōu)勢，被美國FDA認(rèn)定為安全的基因工程表達(dá)系統(tǒng)，缺點(diǎn)是具有超糖基化能力，表達(dá)的外源蛋白易被酵母蛋白酶系統(tǒng)降解影響產(chǎn)量，已成功應(yīng)用于乙肝等疫苗的生產(chǎn)［35］。SARS-CoV-2的S蛋白是高糖基化的膜蛋白，為了不影響S蛋白的生物活性，目前臨床的亞單位疫苗均未采用這兩種表達(dá)系統(tǒng)。

2.4 VLP疫苗 VLP由病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白在表達(dá)宿主中自組裝或在體外裝配而成，形態(tài)學(xué)和結(jié)構(gòu)上與病毒相似，不攜帶遺傳物質(zhì)，無感染性，不能自我復(fù)制。VLP可將靶抗原遞送到免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)體液和細(xì)胞（CD4+T細(xì)胞）免疫，已成功應(yīng)用于HBV［36］和HPV［37］疫苗。目前已上市的HBV和HPV疫苗是基于哺乳動物、昆蟲細(xì)胞和酵母表達(dá)系統(tǒng)。Medicago公司利用植物（煙草煙葉）生產(chǎn)新冠VLP疫苗（Co-VLP）［38］，主要過程是將構(gòu)建的含目的基因的質(zhì)粒導(dǎo)入到農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）載體中，轉(zhuǎn)染煙草后生產(chǎn)出VLP。Medicago公司利用煙草開發(fā)的四價(jià)流感VLP疫苗［39］已完成了Ⅲ期（NCT0330-1051，NCT03739112）臨床研究，結(jié)果顯示耐受性良好，可提供實(shí)質(zhì)性保護(hù)。CoVLP候選疫苗的S蛋白也經(jīng)過多處修飾，一處是在S1／S2裂解位點(diǎn)進(jìn)行了3個氨基酸的替換以提高蛋白穩(wěn)定性，R667G、R6-68S和R670S；一處發(fā)生在K971P和V972P，提高蛋白的融合前構(gòu)象；用苜蓿的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶代替信號肽，用流感毒株（H5 A／Indonesia／5／2005）的TM／CT（轉(zhuǎn)膜基序／胞質(zhì)尾）代替S蛋白的TM／CT，該替換提高了VLP的組裝和出芽；使用雙35S啟動子和專有的5′和3′非翻譯區(qū)來驅(qū)動S蛋白的表達(dá)，以最大限度地提高mRNA的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)的翻譯；添加番茄叢矮病毒（TBSV）P19基因沉默抑制物，以最大化S蛋白的瞬時表達(dá)。目前已在18～55歲人群中完成了CoVLP候選疫苗的Ⅰ期（NCT0-4450004）臨床試驗(yàn)［40］，結(jié)果顯示，CoVLP候選疫苗安全性良好，血清中和抗體水平無劑量遞增效應(yīng)（3.75、7.5和15μg），CoVLP+AS03組加強(qiáng)免疫后誘導(dǎo)的中和抗體水平是COVID-19康復(fù)者血清的10倍，并誘導(dǎo)了S蛋白特異性的IFNγ和IL-4細(xì)胞免疫。目前正在18歲以上人群中開展CoVLP候選疫苗安全性、有效性和免疫原性的Ⅱ／Ⅲ期（NCT0463-6697）臨床研究。

其他幾款VLP疫苗，如印度血清研究所開發(fā)的基于乙型肝炎表面抗原組成的新冠亞單位VLP（RBD）正在進(jìn)行Ⅰ期（ACTRN12620000817943）臨床試驗(yàn)；VBI疫苗公司利用包膜類病毒顆粒（eVLP）疫苗技術(shù)開發(fā)的VBI-2902a疫苗正在進(jìn)行Ⅰ／Ⅱ期（NCT04773665）臨床試驗(yàn)；土耳其科學(xué)技術(shù)研究委員會（Scientific and Technological Research Council of Turkey，TBITAK）開發(fā)的SARS-CoV-2 VLP疫苗正在進(jìn)行Ⅰ期（NCT04818281）臨床試驗(yàn)；拉德堡大學(xué)開發(fā)的ABNCoV2（VLP）正在進(jìn)行Ⅰ期（NCT04839146）臨床試驗(yàn)。

續(xù)表2正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的新冠亞單位疫苗Tab.2（Continued）SARS-CoV-2 subunit vaccines candidates in clinic

3 我國新冠亞單位疫苗臨床現(xiàn)狀

截止目前，我國已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的候選亞單位疫苗有6款，其中進(jìn)入Ⅲ期的有2款（ZF2001、SCB-2019）。國藥中生生物技術(shù)研究院利用CHO細(xì)胞表達(dá)的針對RBD天然結(jié)構(gòu)的亞單位疫苗正在開展Ⅰ／Ⅱ期（NCT04869592）臨床試驗(yàn)，未見臨床前研究報(bào)道。中國四川大學(xué)華西醫(yī)院利用Sf細(xì)胞表達(dá)的針對RBD的亞單位疫苗［41］，在猴子等動物中未見明顯副作用，可較好地預(yù)防SARS-CoV-2感染，已完成Ⅰ期（ChiCTR2000037518）臨床試驗(yàn)，正在進(jìn)行Ⅱ期（ChiCTR2000039994）臨床研究。中科院生物物理所與麗珠單抗生物技術(shù)有限公司合作開發(fā)的V-01疫苗［42］，是將通用型DR輔助T細(xì)胞表位（pan-DR helper Tcell epitopes，PADRE）插入IFNα和RBD蛋白序列之間，表達(dá)形成I-P-R-F融合蛋白（IFNα-PADRERBD-Fc），進(jìn)一步加強(qiáng)疫苗的T／B細(xì)胞應(yīng)答，與人群常見HLA-DR分子結(jié)合，較少受MHC限制性；V-01免疫恒河猴誘導(dǎo)產(chǎn)生了高水平病毒中和抗體，免疫256 d后，血清RBD結(jié)合抗體仍維持高水平。江蘇省疾病預(yù)防控制中心基于基因工程疫苗概念設(shè)計(jì)開發(fā)了針對S蛋白RBD+NTD雙組分亞單位新冠疫苗［43］，臨床前研究結(jié)果表明，有較好的保護(hù)作用；與江蘇瑞科生物科技有限公司合作，已進(jìn)入Ⅰ期（NCT04818801）臨床研究。

4 挑戰(zhàn)與展望

4.1 病毒變異株 截止2021年5月26日，國家生物信息中心共收錄1 741 494條新冠病毒序列，發(fā)現(xiàn)35 016個變異，主要為單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）變異（28 558），變異主要位于ORF1ab區(qū)（核苷酸20334個，氨基酸14987個），其次在S蛋白共有3 692個核苷酸位點(diǎn)發(fā)生突變，引起氨基酸變化的突變共2 717個，位于RBD的氨基酸407個，其中在已報(bào)道蛋白互作中關(guān)鍵的17個氨基酸中發(fā)生非同義突變的氨基酸41個（https：／／bigd.big.ac.cn／ncov／variation／spike）。自2020年1月發(fā)現(xiàn)D614G突變株后［44］，其已成為全球主要流行株。目前主要的流行突變株有4種：英國株（B.1.1.7）［45］，具有高傳染、高致病的特點(diǎn)；南非株（B.1.351）［46］和印度株（B.1.617）［47］，傳染性強(qiáng)，還可能削弱疫苗效果；巴西株（P.1）［48］，具有很強(qiáng)的二次感染性。發(fā)生在S蛋白RBD和NTD上的突變可引起免疫逃逸，對基于S蛋白的亞單位疫苗提出了挑戰(zhàn)。因此，根據(jù)抗原變異特征，通過靶抗原的選擇設(shè)計(jì)，利用現(xiàn)有平臺技術(shù)研發(fā)具有廣譜保護(hù)性的疫苗是有效預(yù)防COVID-19的最具潛力的疫苗。

4.2 S蛋白糖基化 蛋白質(zhì)糖基化是生物體內(nèi)最重要的翻譯后修飾之一，可改變多肽的構(gòu)象和增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而使不同的蛋白質(zhì)具有不同構(gòu)象，主要以N-糖基化和O-糖基化形式呈現(xiàn)。當(dāng)前SARSCoV-2疫苗的候選抗原主要集中在S蛋白，而S蛋白是一種高度糖基化的蛋白質(zhì)，糖基化作為關(guān)鍵屬性決定著蛋白的空間構(gòu)象和化學(xué)性質(zhì)，甚至作為突變的潛在靶點(diǎn)［49］。

ANDERSEN等［50］預(yù)測，每個單體S蛋白有22個潛在N-鏈接糖基化位點(diǎn)，3個潛在O-鏈接糖基化位點(diǎn)，O-糖基化位點(diǎn)是接近furin裂解位點(diǎn)（S1／S2）的位點(diǎn)。WATANABE等［51］用質(zhì)譜方法鑒定出293F細(xì)胞表達(dá)的S蛋白有22個N-糖基化位點(diǎn)，其中18個具有保守性，糖基化修飾包括高甘露糖型、雜合型和復(fù)合型3種，其中復(fù)合型糖鏈占比較高，不同糖基化位點(diǎn)的多糖種類和豐度具有較大差別。WALLS等［52］通過Cryo-electron microscopy（Cryo-EM）技術(shù)證明，22個糖基化位點(diǎn)中有14～16個發(fā)生了N-糖基化，并證明這種N-糖基化在蛋白的正確折疊中起重要作用，有利于病毒逃避宿主的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。SHAJAHAN等［53］在HEK293細(xì)胞表達(dá)的S蛋白中觀察到22個潛在N-糖基化位點(diǎn)中有17個發(fā)生了N-糖基化修飾，并在S1亞基RBD中首次確認(rèn)存在2個O-糖基化（O323／O325）。ZHANG等［54］對昆蟲細(xì)胞表達(dá)的S蛋白和293細(xì)胞表達(dá)的S1亞基的糖基化進(jìn)行特征分析，在昆蟲細(xì)胞表達(dá)的S蛋白中鑒定出22個N-糖基化位點(diǎn)，糖鏈修飾主要是高甘露糖型，含38種多糖；而293細(xì)胞表達(dá)的S1蛋白其糖鏈修飾主要是復(fù)合型糖鏈，多糖多達(dá)140種。這些研究表明，不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白糖鏈修飾類型和多糖組成差異很大。值得注意的是，同樣是用293細(xì)胞表達(dá)體系，表達(dá)的S蛋白其糖基化水平和糖鏈種類也有較大差別，表明重組S蛋白的糖基化修飾具有多樣性和異質(zhì)性。因此，根據(jù)設(shè)計(jì)需要選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)對于亞單位疫苗抗原的生產(chǎn)至關(guān)重要。

4.3 安全性和保護(hù)持久性 安全性和持久性與靶抗原選擇、非天然序列／片段的引入、抗原穩(wěn)定性以及佐劑選擇均具有相關(guān)性。2019年，LIU等［55］通過靈長類動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了SARS-CoV-1病毒疫苗的“抗體依賴增強(qiáng)效應(yīng)”（antibody-dependent enhancement，ADE）。最近，日本學(xué)者YAFEI等［56］在感染SARSCoV-2的患者中發(fā)現(xiàn)，一系列S蛋白的NTD表位抗體（如8D2）可誘導(dǎo)RBD呈現(xiàn)開放型構(gòu)象，增強(qiáng)SARS-CoV-2的感染性，雖然增強(qiáng)機(jī)制與Fc介導(dǎo)的ADE不同，但存在潛在ADE效應(yīng)。至今雖未出現(xiàn)疫苗接種會誘導(dǎo)這種類型抗體的證據(jù)，但鑒于SARSCoV-2與SARS-CoV-1病毒S蛋白的結(jié)構(gòu)和感染機(jī)制有較高的相似性，應(yīng)對SARS-CoV-2疫苗的安全性持續(xù)關(guān)注和跟蹤［57-58］。

亞單位疫苗由于抗原成分明確、純度高、免疫原性弱，需加入佐劑來增強(qiáng)免疫效果。目前批準(zhǔn)用于人用疫苗的佐劑有鋁鹽佐劑、AS系列佐劑、MF59和CpG等佐劑［59］。當(dāng)前進(jìn)入臨床試驗(yàn)的新冠亞單位疫苗除氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑外，還有新型佐劑，如Matrix-M、MF59、CpG、Advax-SM、TLR1／2配 體（XS15）和QS-21佐劑。雖然新型佐劑可顯著提高疫苗誘導(dǎo)的體液或（和）細(xì)胞免疫，但也伴隨著不良反應(yīng)事件的增加，因此佐劑的選擇需謹(jǐn)慎考慮疫苗安全性和有效性之間的平衡。

4.4 展望 一種高效和安全的COVID-19疫苗不僅需要誘導(dǎo)機(jī)體所需的體液和細(xì)胞免疫，同時應(yīng)盡量減少如細(xì)胞因子風(fēng)暴等不良副作用，還可快速開發(fā)和部署針對病毒突變的疫苗，因此，需對抗原、劑型、接種途徑和接種時機(jī)進(jìn)行多方面綜合考慮。疫苗研發(fā)過程中遇到困難，或?qū)σ呙缭O(shè)計(jì)、接種方案重新評估并不罕見，重要的是要從失敗的試驗(yàn)中確定疫苗成分或生產(chǎn)中需要優(yōu)化的方面，從而使產(chǎn)品研發(fā)得以恢復(fù)。成功預(yù)防COVID-19大流行的疫苗應(yīng)具有以下優(yōu)勢：提供長期保護(hù)性，可接受的安全性和有效性，易于快速大規(guī)模生產(chǎn)，可利用現(xiàn)有冷鏈設(shè)施進(jìn)行廣泛分發(fā)等。疫苗種類多樣性將減少因疫苗原材料有限而產(chǎn)生的疫苗供應(yīng)不足等負(fù)面影響。雖然目前滅活疫苗、亞單位疫苗、腺病毒載體和mRNA疫苗已廣泛使用，但臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)征集時間短，是否存在長期不良反應(yīng)等仍不明確，需進(jìn)一步跟蹤和評價(jià)，加之全球流行加速了病毒的變異，因此不排除特別是在免疫反應(yīng)協(xié)調(diào)性差和向炎癥狀態(tài)發(fā)展的老年人群中進(jìn)行加強(qiáng)免疫，而重組亞單位疫苗能有效增強(qiáng)已有的免疫反應(yīng)。因此，重組亞單位疫苗是最具潛力的候選疫苗之一，相信該類疫苗在有效預(yù)防和控制SARS-CoV-2感染中能發(fā)揮重要作用。

志謝衷心感謝中國生物武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司黃仕和研究員指導(dǎo)