18F標(biāo)記的苯乙烯基嘧啶類Aβ顯像劑的制備與初步生物評價(jià)

李忠勇，沈浪濤，喬來成，王成志，梁 巍，沈 忱，崔海平

(1.原子高科股份有限公司，北京 102413；2.中國原子能科學(xué)研究院，北京 102413)

阿茲海默病(AD)是影響人類，特別是老年人健康的重大疾病。許多研究證實(shí)，β淀粉樣蛋白(Aβ)在AD發(fā)病中起著關(guān)鍵作用，因此，以Aβ為生物標(biāo)志物，利用PET等分子影像學(xué)技術(shù)及相應(yīng)的放射性藥物，在臨床癥狀發(fā)生之前進(jìn)行Aβ顯像，已成為早期無創(chuàng)診斷AD的重要技術(shù)手段[1-3]。近年來，大量小分子被設(shè)計(jì)用于Aβ顯像，如18F-FDDNP、11C-PIB、18F-AZD4694、18F-GE67、18F-BAY94-9172、18F-AV45等，其中18F-AV45(即[18F]Florbetapir，商品名Amyvid，Eli lilly公司)、18F-GE67(即[18F]Flutemetamol，商品名Vizamyl，GE公司)和18F-BAY94-9172(即[18F]Florbetaben，商品名Neuraceq，Piramal公司)分別于2012年、2013年和2014年獲得FDA上市許可，用于輔助診斷AD。這使得PET技術(shù)在早期無創(chuàng)診斷AD中表現(xiàn)出了極大潛力[3-5]。盡管如此，由于AD本身發(fā)病機(jī)理仍不明確，機(jī)理研究仍需深入，同時(shí)，新型Aβ顯像劑的研發(fā)仍需繼續(xù)，以期更好地解決AD的早期診斷[6-7]。在三種已獲FDA上市許可的Aβ顯像劑中，有兩種(18F-BAY94-9172和18F-AV45)屬于二苯乙烯類衍生物，對于該類Aβ顯像劑，整個(gè)分子呈大共軛結(jié)構(gòu)，其中一個(gè)芳環(huán)單元的對位通常含有給電子基團(tuán)，如-NH2、-NHMe、-NMe2、-OH、-OMe等，對于保持與Aβ的高親和性起重要作用，而另一個(gè)芳環(huán)單元有較大的可修飾性，如改變芳環(huán)結(jié)構(gòu)(引入N、S等原子)、N甲基個(gè)數(shù)、聚乙二醇鏈長度等，苯乙烯基吡啶衍生物18F-AV45就是在18F-BAY94-9172的相應(yīng)苯環(huán)結(jié)構(gòu)中引入N原子，既保持了對Aβ的高親和性，又能更快的達(dá)到高信噪比[8]。如果在18F-AV45的吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)中再引入氮原子，可以得到苯乙烯基嘧啶衍生物18F-SPm2和18F-SPm5，相關(guān)理論模型研究結(jié)果顯示，18F-SPm2和18F-SPm5具有適宜的親脂性(LogP=0.9～3.0)，可能具有作為Aβ顯像劑的潛力[9]。本工作將18F-SPm2和18F-SPm5作為潛在的Aβ顯像劑，進(jìn)行相關(guān)研究，探討其用作Aβ顯像劑的可能性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-5203A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海振捷試驗(yàn)設(shè)備有限公司；CRC-25R型活度計(jì)：美國CAPINTEC公司；6224型液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)：美國AGILENT公司；400 MHz核磁共振波譜儀：德國BRUKER 公司；WIZARD2 2470型自動(dòng)伽馬計(jì)數(shù)儀：美國PERKINELMER公司；M-48型多頭細(xì)胞收集器：美國BRANDEL公司；EVOS Fl型熒光顯微鏡：美國LIFE TECHNOLOGIES公司。

1.2 主要材料與試劑

C18液相色譜柱：美國AGILENT公司；Light C18柱、Light QMA柱：美國WATERS公司；18F離子溶液：原子高科股份有限公司；氨基聚醚K2.2.2：德國MERCK公司；色譜純乙腈：美國SIGMA-ALDRICH公司；滅菌注射用水、氯化鈉注射液：石家莊四藥有限公司；其他試劑均為市售分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑(北京)有限公司；除特別說明外，所用化學(xué)試劑均直接使用。

1.3 18F-SPm2和18F-SPm5的制備

1.3.118F-SPm2和18F-SPm5的結(jié)構(gòu)

18F-SPm2和18F-SPm5的結(jié)構(gòu)示于圖1。

圖1 18F-BAY94-9172、18F-AV45、18F-SPm2和18F-SPm5的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of 18F-BAY94-9172, 18F-AV45, 18F-SPm2 and 18F-SPm5

1.3.2標(biāo)記前體化合物Boc-SPm2-OTs和Boc-SPm5-OTs的合成[10-11]

標(biāo)記前體化合物Boc-SPm2-OTs和Boc-SPm5-OTs的合成路線示于圖2。

圖2 Boc-SPm2-OTs和Boc-SPm5-OTs的合成路線Fig.2 Synthetic scheme of Boc-SPm2-OTs and Boc-SPm5-OTs

1) 化合物1的合成。10 mL水中加入1.2 g 4-氨基苯乙烯和2.91 g二碳酸二叔丁酯，35 ℃條件下攪拌4 h，用50 mL二氯甲烷萃取2次，混合有機(jī)相，依次用50 mL水、50 mL鹵水清洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，剩余物用柱層析色譜(200～300目硅膠，VEA:VPE=1∶4作為淋洗劑)純化，真空干燥。

2) 化合物2的合成。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，30 mL無水N,N-二甲基甲酰胺中加入0.65 g氫化鈉(70%)，0 ℃下滴加10 mL含2.19 g化合物1的無水N,N-二甲基甲酰胺溶液，0 ℃下攪拌1 h，30 ℃下攪拌1 h，0 ℃下滴加12.9 g碘甲烷，0 ℃下攪拌1 h，自然升溫至室溫，攪拌過夜，體系傾入40 mL 0 ℃飽和氯化銨溶液中淬滅，用120 mL乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次用40 mL水、40 mL鹵水清洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，剩余物用柱層析色譜(200～300目硅膠，VEA∶VPE=1∶4作為淋洗劑)純化，真空干燥。

3) 化合物3的合成。50 mL無水四氫呋喃中加入2.09 g 2-氯-5-碘吡啶和6.76 g三乙二醇，分次加入1.11 g叔丁醇鉀，70 ℃油浴加熱回流10 h，減壓除去溶劑，加入100 mL水，用100 mL乙酸乙酯萃取3次，混合有機(jī)相，用100 mL鹵水清洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，剩余物用柱層析色譜(200～300目硅膠，VEA∶VPE=4∶1作為淋洗劑)純化，真空干燥。

4) 化合物4的合成。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，100 mL無水N,N-二甲基甲酰胺中加入1.66 g化合物2和2.49 g化合物3，并加入4.14 g四丁基溴化銨、4.9 g碳酸鉀和103.92 mg乙酸鈀，體系通氮排氣20 min，然后100 ℃下攪拌20 h，減壓除去溶劑，加入100 mL水，用100 mL乙酸乙酯萃取3次，混合有機(jī)相，依次用100 mL水、100 mL鹵水清洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，剩余物用柱層析色譜(200～300目硅膠，VEA∶VPE=15∶1作為淋洗劑)純化，真空干燥。

5) 化合物5的合成。20 mL二氯甲烷中加入497 mg化合物4，0 ℃下加入467.32 mg甲苯-4-磺酰氯，并加入726 mg三乙胺和34.98 mg 4-二甲胺基吡啶，30 ℃下攪拌10 h，加入30 mL二氯甲烷和50 mL水萃取，水相用50 mL二氯甲烷萃取，混合有機(jī)相，依次用50 mL水、50 mL鹵水清洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，剩余物用柱層析色譜(200～300目硅膠，VEA∶VPE=2∶1作為淋洗劑)純化，真空干燥。

6) 化合物6的合成。方法同化合物3。

7) 化合物7的合成。方法同化合物4。

8) 化合物8的合成。方法同化合物5。

1.3.3參比化合物19F-SPm2和19F-SPm5的合成[12-13]

參比化合物19F-SPm2和19F-SPm5的合成路線示于圖3。

圖3 19F-SPm2和19F-SPm5的合成路線Fig.3 Synthetic scheme of 19F-SPm2 and 19F-SPm5

1) 化合物9的合成。在氬氣保護(hù)下，2.5 mL無水四氫呋喃中加入350.5 mg化合物5，0 ℃下滴加0.9 mL 1 mol/L的四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液，60 ℃下攪拌5 h，減壓除去溶劑，加入25 mL水，用25 mL二氯甲烷萃取2次，混合有機(jī)相，依次用25 mL水、25 mL鹵水清洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，剩余物用柱層析色譜(200～300目硅膠，VEA∶VPE=2∶1作為淋洗劑)純化，真空干燥。

2) 化合物10的合成。4 mL乙酸乙酯中加入179.2 mg化合物9，0 ℃下滴加0.4 mL濃鹽酸，30 ℃下攪拌5 h，減壓除去溶劑，加入5 mL二氯甲烷，0 ℃下滴加2.5 mL三乙胺，30 ℃下攪拌0.5 h，減壓除去溶劑，加入25 mL水，用25 mL二氯甲烷萃取2次，混合有機(jī)相，依次用25 mL水、25 mL鹵水清洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，剩余物用柱層析色譜(200～300目硅膠，VEA∶VPE=2∶1作為淋洗劑)純化，真空干燥。

3) 化合物11的合成。方法同化合物9。

4) 化合物12的合成。方法同化合物10。

1.3.418F-SPm2和18F-SPm5的放化合成

18F-SPm2和18F-SPm5的放化合成路線示于圖4。

圖4 18F-SPm2和18F-SPm5的放化合成路線Fig.4 Radiosynthetic scheme of 18F-SPm2 and 18F-SPm5

將由回旋加速器制備的[18F]F-水溶液通過活化的QMA柱，用1 mL K2.2.2/K2CO3溶液(體積比為96∶4的乙腈和水中含有K2.2.214.4 mg/mL和K2CO33 mg/mL)淋洗QMA柱，淋洗液接收入5 mL V底反應(yīng)瓶中，密封，100 ℃加熱及氬氣流條件下蒸干溶液，加入1 mL無水乙腈，100 ℃加熱及氬氣流條件下蒸干溶液。V底反應(yīng)瓶中加入1 mL 1 mg/mL Boc-SPm2-OTs或Boc-SPm5-OTs的無水DMSO溶液，120 ℃油浴加熱10 min，加入0.25 mL 10% HCl溶液，120 ℃油浴加熱8 min，加入0.825 mL 1 mol/L NaOH溶液，混合均勻后轉(zhuǎn)移入10 mL小瓶中，再用4 mL H2O清洗V底反應(yīng)瓶，洗液轉(zhuǎn)移入同一小瓶中。

將得到的混合溶液通過活化的C18柱，用1 mL HPLC-CH3CN淋洗C18柱，淋洗液通過半制備HPLC(55% CH3CN和45% 20 mmol/L NH4OAc,流速:4 mL/min, 時(shí)間:20 min)進(jìn)行純化，收集需要組分并加入2倍的水，混合均勻，然后通過活化的C18柱，用0.5 mL乙醇淋洗，淋洗液加入4.5 mL NaCl注射液，混合均勻，最后通過0.22 μm無菌濾膜過濾。

1.4 18F-SPm2和18F-SPm5的脂水分配系數(shù)

在2支10 mL離心管中分別依次加入0.2 mL18F-SPm2或18F-SPm5的制劑溶液(約20 μCi)、2.0 mL PBS飽和的正辛醇和1.8 mL正辛醇飽和的PBS，渦旋5 min，5 000 r/min離心10 min，靜置分層，分別取上層PBS飽和的正辛醇(OA相)和下層正辛醇飽和的PBS(PBS相)各0.2 mL于計(jì)數(shù)管中，平行取4次，測量放射性計(jì)數(shù)N，計(jì)算脂水分配系數(shù)LogP=Log(NOA相/NPBS相)值。

1.5 18F-SPm2和18F-SPm5的體外穩(wěn)定性

取100 μL18F-SPm2或18F-SPm5的制劑溶液(約100 μCi)，加入1 mL生理鹽水中，置于室溫下，孵育5、30、60、120、180 min，采用Radio-HPLC法測定放化純度，以觀察穩(wěn)定性。

1.6 體外熒光染色

AD患者腦切片(女性,64歲，顳葉)和轉(zhuǎn)基因小鼠腦切片(C57BL6,APP/PS1,雌性,14月齡)各一張，經(jīng)過3×20 min的二甲苯脫蠟，然后依次經(jīng)過2×5 min的無水乙醇、2×5 min的95%乙醇、5 min的80%乙醇和5 min的70%乙醇洗滌，再經(jīng)過流水沖洗10 min后，置于10 mmol/L的PBS中。將處理過的AD患者腦切片和轉(zhuǎn)基因小鼠腦切片分別浸于5 μmol/L19F-SPm2或19F-SPm5的溶液(溶劑為20%乙醇溶液)中10 min，然后依次經(jīng)過5 min的40%乙醇和2 min的去離子水洗滌，干燥后用熒光顯微鏡觀察。

1.7 體外競爭結(jié)合

在12 mm×75 mm硼硅玻璃管中分別加入100 μL不同濃度19F-SPm2或19F-SPm5的乙醇溶液(10-3～10-9mol/L)、100 μL125I-IMPY溶液(計(jì)數(shù)率106min-1·mL-1)[14]、700 μL PBS和100 μL Aβ1-42水溶液(30 nmol/L)[15]，用封口膜密封，渦旋，在37 ℃恒溫水浴中振蕩孵育2 h，用0 ℃的PBS終止反應(yīng)，多頭細(xì)胞收集器收集反應(yīng)液，用玻璃纖維濾膜分離結(jié)合復(fù)合物與游離的放射性配基，用3 mL 0 ℃的PBS沖洗三次，測量濾膜上的放射性計(jì)數(shù)。利用Graphpad Prism 4.0 分析數(shù)據(jù)得到半抑制常數(shù)IC50，根據(jù)Cheng-Prusoff方程計(jì)算抑制常數(shù)Ki。

1.8 體內(nèi)生物分布

將100 μL18F-SPm2或18F-SPm5的制劑溶液(約100 μCi)經(jīng)尾靜脈注射到20只正常ICR小鼠(每組4只，20～25 g，雌性，北京華阜康生物科技股份有限公司)體內(nèi)，分別于注射后5、30、60、120、180 min時(shí)，從眼部取血并迅速處死，解剖后取肺、心、肝、脾、胃、腸、腎、肌肉、腿骨、頭骨、腦等器官，分別置于事先稱重的計(jì)數(shù)管底部，測量放射性計(jì)數(shù)并稱重，計(jì)算放射性攝取率(%ID/g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 18F-SPm2和18F-SPm5的制備

2.1.1標(biāo)記前體化合物Boc-SPm2-OTs和Boc-SPm5-OTs的合成

化合物1的合成。得到白色固體，產(chǎn)率為100%。HRMS(EI):m/zC13H17NO2219.125 9(M),219。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ7.34(s,4H),6.66(dd,J=17.6,10.9Hz,1H),6.47(s,1H),5.65(d,J=17.6 Hz,1H),5.16(d,J=10.9 Hz,1H),1.52(s,9H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 152.63,137.93,136.19,132.49,126.83,118.40,112.36,80.58,28.33。

化合物2的合成。得到淡黃色液體，產(chǎn)率為89%。HRMS(EI):m/zC14H19NO2233.141 6(M),233。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ7.36(d,J=8.6 Hz,2H),7.17(d,J=8.5 Hz,2H),6.69(dd,J=17.6,10.9 Hz,1H),5.70(d,J=17.6 Hz,1H),5.23(d,J=10.9 Hz,1H),3.25(s,3H),1.45(s,9H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ154.66,143.32,136.13,134.60,126.30,125.35,113.55,80.35,37.20,28.33。

化合物3的合成。得到白色固體，產(chǎn)率為83%。HRMS(ESI+):m/zC10H15IN2O4(M+H)+355.014 9,355.022 3;m/zC10H15IN2O4(M+Na)+376.996 9,376.999 5。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.64(s,2H),4.50(t,J=4.8 Hz,2H),3.88(t,J=4.8 Hz,2H),3.77-3.70(m,4H),3.70-3.65(m,2H),3.65-3.57(m,2H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ164.29,163.96,82.55,72.51,70.86,70.37,69.08,67.25,61.74。

化合物4的合成。得到白色固體，產(chǎn)率為48%。HRMS(ESI+):m/zC24H33N3O6(M+H)+460.244 2,460.248 8;m/zC24H33N3O6(M+Na)+482.226 2,482.231 0。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.63(s,2H),7.45(d,J=8.6 Hz,2H),7.26(d,J=8.5 Hz,2H),7.05(d,J=16.4 Hz,1H),6.90(d,J=16.5 Hz,1H),4.56(t,J=4.8 Hz,2H),3.91(t,J=4.8 Hz,2H),3.78-3.72(m,4H),3.72-3.67(m,2H),3.66-3.59(m,2H),3.28(s,3H),2.60(s,1H),1.47(s,9H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ164.15,156.68,154.55,143.72,133.31,129.28,126.65,125.47,125.21,20.62,80.57,72.57,70.89,70.39,9.27,66.99,61.76,37.13,28.34。

化合物5的合成。得到淡黃色膠狀體，產(chǎn)率為81%。HRMS(ESI+):m/zC31H39N3O8S(M+H)+614.253 1,614.256 8;m/zC31H39N3O8S(M+Na)+636.235 0,636.237 9。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.63(s,2H),7.80(d,J=8.3 Hz,2H),7.46(d,J=8.6 Hz,2H),7.34(d,J=8.1 Hz,2H),7.25 (s,1H),7.06 (d,J=16.5 Hz,1H),6.90(d,J=16.4 Hz,1H),4.53(t,J=4.8 Hz,2H),4.16(t,J=4.8 Hz,2H),3.85(t,J=4.8 Hz,2H),3.74-3.63(m,4H),3.62-3.57(m,2H),3.28(s,3H),2.44(s,3H),1.47(s,9H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ164.26,156.69,154.56,144.76,143.71,133.33,133.00,129.81,129.22,127.98,126.64,125.47,125.17,120.69,80.57,70.78,70.75,69.35,69.25,68.71,66.98,37.13,28.34,21.64。

化合物6的合成。得到白色固體，產(chǎn)率為62%。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.53(s,2H),4.51(t,J=4.8 Hz,2H),3.88(t,J=4.8 Hz,2H),3.77-3.70(m,4H),3.70-3.65(m,2H),3.65-3.57(m,2H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ163.62,159.59,111.96,72.57,70.84,70.34,69.09,67.38,61.73。

化合物7的合成。得到白色固體，產(chǎn)率為72%。HRMS(ESI+):m/zC24H33N3O6(M+H)+460.244 2,460.249 4;m/zC24H33N3O6(M+Na)+482.226 2, 482.231 7。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.63(s,2H),7.45(d,J=8.6 Hz,2H),7.26(d,J=8.5 Hz,2H),7.05(d,J=16.5 Hz,1H),6.90(d,J=16.5 Hz,1H),4.57(t,J=4.8 Hz,2H),3.91(t,J=4.8 Hz,2H),3.78-3.72(m,4H),3.72-3.66(m,2H),3.66-3.59(m,2H),3.28(s,3H),2.72(s,1H),1.47(s,9H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ164.12,156.67,154.54,143.72,133.29,129.30,126.66,125.46,125.21,20.60,80.57,72.55,70.90,70.40,69.27,67.02,1.76,37.13,28.34。

化合物8的合成。得到淡黃色膠狀體，產(chǎn)率為85%。HRMS(ESI+):m/zC31H39N3O8S(M+H)+614.253 1,614.256 8;m/zC31H39N3O8S(M+Na)+636.235 0,636.237 8。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.63(s,2H),7.80(d,J=8.4 Hz,2H),7.46(d,J=8.6 Hz,2H),7.34(d,J=8.0 Hz,2H),7.25(s,1H),7.06(d,J=16.5 Hz,1H),6.90(d,J=16.5 Hz,1H),4.53(t,J=4.8 Hz,2H),4.16(t,J=4.8 Hz,2H),3.85(t,J=4.8 Hz,2H),3.73-3.63(m,4H),3.63-3.53(m,2H),3.28(s,3H),2.44(s,3H),1.47(s,9H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ164.22,156.68,154.56,144.76,143.72,133.32,133.00,129.81,129.24,127.98,126.65,125.47,125.18,120.66,80.57,70.78,70.75,69.34,69.25,68.71,67.00,37.13,28.34,21.64。

2.1.2參比化合物19F-SPm2和19F-SPm5的合成

化合物9的合成。得到白色固體，產(chǎn)率為81%。HRMS(ESI+):m/zC24H32FN3O5(M+H)+462.239 9,462.247 2;m/zC24H32FN3O5(M+Na)+484.221 8,484.229 1。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.63(s,2H),7.45(d,J=8.2 Hz,2H),7.25(s,1H),7.05(d,J=16.4 Hz,1H),6.90(d,J=16.4 Hz,1H),4.62(t,J=4.0 Hz,1H),4.56(t,J=4.9 Hz,2H),4.50(t,J=4.0 Hz,1H),3.91(t,J=4.8 Hz,2H),3.79(t,J=4.0 Hz,1H),3.79-3.65(m,5H),3.28(s,3H),1.47(s,9H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ164.29,156.68,154.55,143.71,133.34,129.18,126.64,125.47,125.14,120.71,83.99,82.31,80.56,70.85,70.54,70.34,69.37,67.03,37.13,28.34。

化合物10的合成。得到黃色固體，產(chǎn)率為88%。HRMS(ESI+):m/zC19H24FN3O3(M+H)+362.187 5,362.192 3;m/zC19H24FN3O3(M+Na)+384.169 4,384.171 2。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.57(s,2H),7.34(d,J=8.2 Hz,2H),6.97(d,J=16.4 Hz,1H),6.71(d,J=16.4 Hz,1H),6.59(d,J=8.2 Hz,2H),4.61(t,J=4.0 Hz,1H),4.54(t,J=4.9 Hz,2H),4.49(t,J=4.0 Hz,1H),3.99(s,1H),3.89(t,J=4.9 Hz,2H),3.78(t,J=4.1 Hz,1H),3.78-3.65(m,5H),2.86(s,3H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ163.80,156.14,149.42,130.14,127.83,25.95,125.64,116.30,112.38,83.99,82.31,70.83,70.52,70.32,69.40,66.87,30.54。

化合物11的合成。得到白色固體，產(chǎn)率為77%。HRMS(ESI+):m/zC24H32FN3O5(M+H)+462.239 9,462.246 7;m/zC24H32FN3O5(M+Na)+484.221 8,484.229 2。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.63(s,2H),7.46(d,J=8.3 Hz,2H),7.25(s,1H),7.05(d,J=16.4 Hz,1H),6.90(d,J=16.5 Hz,1H),4.62(t,J=4.0 Hz,1H),4.56(t,J=4.9 Hz,2H),4.50(t,J=4.0 Hz,1H),3.91(t,J=4.9 Hz,2H),3.79(t,J=4.2 Hz,1H),3.77-3.67(m,5H),3.28(s,3H),1.47(s,9H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ164.28,156.68,154.55,143.70,133.33,129.17, 126.63,125.46,125.13,120.71,83.99,82.31,80.56,70.85,70.53,70.34,9.36,67.03,37.13,28.34。

化合物12的合成。得到黃色固體，產(chǎn)率為81%。HRMS(ESI+):m/zC19H24FN3O3(M+H)+362.187 5,362.191 3;m/zC19H24FN3O3(M+Na)+384.169 4, 384.171 0。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.57(s,2H),7.34(d,J=8.7 Hz,2H),6.97(d,J=16.4 Hz,1H),6.71(d,J=16.4 Hz,1H),6.59(d,J=8.7 Hz,2H),4.62(t,J=4.1 Hz,1H),4.54(t,J=4.8 Hz,2H),4.50(t,J=4.1 Hz,1H),3.97(s,1H),3.90(t,J=4.9 Hz,2H),3.78(t,J=4.2 Hz,1H),3.78-3.67(m,5H),2.86(s,3H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ163.79,156.13,149.43,130.15,127.83,125.95,125.63,116.30,112.37,83.99,82.31,70.83,70.52,70.32,69.40,66.87,30.53。

2.1.318F-SPm2和18F-SPm5的放化合成

從[18F]F-起，至純化結(jié)束，18F-SPm2和18F-SPm5放化合成總時(shí)間分別為170和190 min，衰減校正后的放化產(chǎn)率分別為20%和15%，放化純度均大于99%，比活度均約10 GBq/mol。18F-SPm2和18F-SPm5保留時(shí)間均為8.4 min(如圖5)，與相應(yīng)的參比化合物19F-SPm2和19F-SPm5一致。

圖5 18F-SPm2和18F-SPm5的HPLC譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of 18F-SPm2 and 18F-SPm5

2.2 18F-SPm2和18F-SPm5的脂水分配系數(shù)

18F-SPm2和18F-SPm5的脂水分配系數(shù)(LogP)分別為2.04和1.84，說明18F-Spm2和18F-Spm5具有適宜的親脂性。

2.3 18F-SPm2和18F-SPm5的體外穩(wěn)定性

18F-SPm2和18F-SPm5在生理鹽水中室溫放置3 h后的HPLC譜圖見圖6。由圖6可知，18F-SPm2和18F-SPm5在生理鹽水中室溫放置3 h后，放化純度仍大于99%，說明兩者在生理鹽水中的穩(wěn)定性良好。

圖6 18F-SPm2和18F-SPm5在生理鹽水中室溫放置3 h后的HPLC譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of 18F-SPm2 and 18F-SPm5 incubated in normal saline for 3 h at room temperature

2.4 體外熒光染色

每張切片染色后用靶向于Aβ的近紅外染料DANIR-3b(1 μmol/L)染色定位[16]，體外熒光染色結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，19F-SPm2和19F-SPm5均能標(biāo)記出Aβ沉積的位置，但是與DANIR-3b相比，清晰度較差，說明雖然19F-SPm2和19F-SPm5與Aβ具有一定的親和性和選擇性，但18F-SPm2和18F-SPm5可能不是理想的Aβ顯像劑。

圖7 體外熒光染色結(jié)果Fig.7 Results of in vitro fluorescent staining

2.5 體外競爭結(jié)合

體外競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)采用125I-IMPY為放射性配基，Aβ1-42聚集體為受體蛋白，相關(guān)競爭結(jié)合曲線示于圖8，結(jié)果表明19F-SPm2和19F-SPm5對125I-IMPY與Aβ1-42聚集體的結(jié)合均能產(chǎn)生抑制作用，經(jīng)過定量計(jì)算得到兩者的Ki值分別為246.6 nmol/L和318.2 nmol/L，表明19F-SPm2和19F-SPm5對Aβ1-42聚集體的親和力較弱。

圖8 相關(guān)競爭結(jié)合曲線Fig.8 Competitive binding curves

2.6 體內(nèi)生物分布

18F-SPm2和18F-SPm5在正常小鼠體內(nèi)生物分布如圖9所示。18F-SPm2在注射后5 min時(shí)，肝、腎和腸放射性攝取率分別為32.73%ID/g、11.77%ID/g和15.85%ID/g，分別為血液放射性攝取率的5.83、2.10和2.83倍；18F-SPm5在注射后5 min時(shí)，肝、腎和腸放射性攝取率分別為24.42%ID/g、10.92%ID/g和9.83%ID/g，分別為血液放射性攝取率的5.90、2.64和2.37倍；說明18F-SPm2和18F-SPm5體內(nèi)吸收迅速，除主要經(jīng)肝代謝外，還經(jīng)腎和腸等代謝。

圖9 18F-SPm2和18F-SPm5在正常小鼠體內(nèi)的生物分布Fig.9 Biodistribution of 18F-SPm2 and 18F-SPm5 in normal mice (n=4,

18F-SPm2在注射后5 min時(shí)，血和腦放射性攝取率分別為5.61%ID/g和4.29%ID/g，注射后60 min時(shí)分別為3.19%ID/g和2.58%ID/g，腦/血比分別為0.76和0.81，5 min和60 min腦放射性攝取比為1.66；18F-SPm5在注射后5 min時(shí)，血和腦放射性攝取值分別為4.14%ID/g和3.91%ID/g，注射后60 min時(shí)分別為2.83%ID/g和2.28%ID/g，腦/血比分別為0.94和0.81，5 min和60 min腦放射性攝取比為1.71；說明正常腦組織對18F-SPm2和18F-SPm5的放射性攝取能力較弱且清除較慢。另外，雖然18F-SPm2和18F-SPm5在骨中的初始放射性攝取水平較低，但隨著時(shí)間的延長，腿骨和頭骨中放射性攝取率均明顯增加，說明18F-SPm2和18F-SPm5在體內(nèi)存在明顯脫氟現(xiàn)象，這會嚴(yán)重影響18F-SPm2和18F-SPm5作為Aβ顯像劑的應(yīng)用。

3 結(jié)論

本工作合成了兩種18F標(biāo)記的苯乙烯基嘧啶化合物18F-SPm2和18F-SPm5，兩者放化純度均大于99%，親脂性和體外穩(wěn)定性良好，體外實(shí)驗(yàn)表明19F-SPm2和19F-SPm5雖然能選擇性結(jié)合Aβ，但對Aβ親和力較弱，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明18F-SPm2和18F-SPm5的正常腦放射性攝取能力較弱且清除較慢，而且存在明顯脫氟現(xiàn)象，這些結(jié)果都說明18F-SPm2和18F-SPm5不是理想的Aβ顯像劑，也說明兩種分子的設(shè)計(jì)存在缺陷。另外，苯乙烯基嘧啶結(jié)構(gòu)中的二價(jià)鍵是否會受光作用影響、是否存在異構(gòu)體等因素也可能對研究結(jié)果產(chǎn)生影響，應(yīng)當(dāng)納入考慮。針對兩者缺點(diǎn)的分子結(jié)構(gòu)改造研究工作正在進(jìn)行中。