生物信息學(xué)方法鑒定與腎透明細(xì)胞癌預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因△

何天基，陳翔，王偉，劉峰，蔡孟會(huì)，石海林#

1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院泌尿外科，廣西 柳州 545006

2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，廣西 桂林 541001

腎癌是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，據(jù)預(yù)測2021 年美國將發(fā)生約76 080 例腎癌病例，其中死亡病例約13 780 例，而腎透明細(xì)胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KΙRC）約占腎癌的85%。早期KΙRC 患者的生存率超過75%，但由于解剖位置隱蔽、患者認(rèn)知等因素影響，多數(shù)患者在確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，而Ⅳ期患者的生存率﹤10%。既往對(duì)KΙRC 的研究多涉及單個(gè)基因，但隨著研究的深入，單基因單疾病理論難以解析腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，并且KΙRC 存在較大的異質(zhì)性，靶向治療的效果在不同患者中差異很大，對(duì)個(gè)體治療藥物的選擇是臨床實(shí)踐中的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。因此，對(duì)KΙRC 患者的基因特征進(jìn)行系統(tǒng)分析以確定KΙRC新的生物標(biāo)志物是非常必要的，這不僅有利于提高KΙRC 的診斷率，還能夠?yàn)镵ΙRC 的治療提供新的藥物靶點(diǎn)。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）是在復(fù)雜數(shù)據(jù)中快速提取出與樣本特征相關(guān)的基因共表達(dá)模塊，計(jì)算基因之間的表達(dá)相關(guān)性，從而將具有表達(dá)相關(guān)性的基因聚類到一個(gè)模塊中，再分析模塊與樣本特征（包括臨床特征、手術(shù)方式、治療方法等）的相關(guān)性。本文通過WGCNA 對(duì)腫瘤基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）及基因 表 達(dá) 匯 編（Gene Expression Omnibus，GEO）（GSE66272、GSE3）中的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以期發(fā)現(xiàn)KΙRC 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因及信號(hào)通路，為KΙRC 患者的精準(zhǔn)治療提供新的靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與提取

分別從TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov/）和GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）中 下 載KΙRC 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及其對(duì)應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)，TCGA中含539 例KΙRC 組織和59 例正常腎組織；采用R語言（https://www.r-project.org/）中的“l(fā)imma”“edgeR”“pheatmap”“ggplot2”包對(duì)轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行提取，得到14 701 個(gè)表達(dá)譜基因，并篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）。通過GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE66272 及GSE3 芯片基因表達(dá)數(shù)據(jù)，分別包括27、171 例KΙRC 組織及其配對(duì)的正常組織，然后利用實(shí)用報(bào)表提取語言（practical extraction and report language，PERL）合并GEO 數(shù)據(jù)集，通過“ggplot2”“l(fā)imma”“pheatmap”包提取分析，共得到21 655 個(gè)DEG 用于后續(xù)研究。DEG篩選標(biāo)準(zhǔn)為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）﹤0.05 和對(duì)數(shù)化表達(dá)變化倍數(shù)（fold change，｜log2FC｜）﹥2.0。

1.2 構(gòu)建關(guān)鍵共表達(dá)模塊及基因富集分析

利用“WGCNA”包對(duì)方差前25%的基因構(gòu)建TCGA-KΙRC、GSE66272 及GSE3 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，通過分析所有基因表達(dá)量的Pearson 相關(guān)性，并轉(zhuǎn)化為拓?fù)渲丿B矩陣（topological overlap matrix，TOM）以及基因不相似性的矩陣（1-TOM），利用基因顯著性及模塊顯著性評(píng)估基因和臨床信息的相關(guān)性，高相關(guān)系數(shù)的模塊被認(rèn)為是與臨床性狀相關(guān)的候選模塊。利用R 語言中的“VennDiagram”包從TCGA 及GEO 數(shù)據(jù)庫的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)基因中提取重疊的預(yù)后基因。對(duì)預(yù)后基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析，主要分為3 個(gè)部分：細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）。通過這3 個(gè)功能大類，對(duì)一個(gè)基因的功能進(jìn)行多方面的限定和描述；再通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）對(duì)所得差異表達(dá)基因的通路進(jìn)行富集分析，用到的R 包為“org.Hs.eg.db”“clusterProfiler”“enrichplot”等。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI）的構(gòu)建及篩選關(guān)鍵基因

通 過STRΙNG（http://string-db.org/cgi/input.pl）在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，從而構(gòu)建KΙRC 預(yù)后相關(guān)基因的PPΙ 網(wǎng)絡(luò)；然后在STRΙNG 數(shù)據(jù)庫中選擇評(píng)分≥0.7 的基因且排除游離不相關(guān)的基因，所得基因應(yīng)用Cytoscape（v3.7.2）軟件中的cytoHubba插件以最大團(tuán)中心（maximal clique centrality，MCC）為原則，取前10個(gè)基因進(jìn)行排序并構(gòu)建可視化的網(wǎng)絡(luò)模型，從而篩選出KΙRC的關(guān)鍵基因。

1.4 關(guān)鍵基因的預(yù)后意義

結(jié)合TCGA 數(shù)據(jù)庫中的生存時(shí)間進(jìn)行預(yù)后分析，采用“survival”“survminer”包進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線分析，探討患者總生存期（overall survival，OS）與關(guān)鍵基因的關(guān)系。此外，使用在線工具GEPΙA2（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析患者無病生存期（disease-free survival，DFS）與關(guān)鍵基因的關(guān)系。以關(guān)鍵基因表達(dá)量的中位值分為高表達(dá)和低表達(dá)。以

P

﹤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 加權(quán)基因共表達(dá)模塊的構(gòu)建

通過R 語言的相關(guān)程序包（logFC 過濾條件為1，矯正后的

P

值為0.05）進(jìn)行篩選，在TCGA中得到DEG 3751 個(gè)，其中下調(diào)1862 個(gè)，上調(diào)1889 個(gè)；同樣對(duì)GEO數(shù)據(jù)集合并，提取得到DEG 3629個(gè)（設(shè)置矯正后的

P

值為0.05），其中下調(diào)1721 個(gè)，上調(diào)1908個(gè)。構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，TCGA-KΙRC中共有9個(gè)模塊，進(jìn)一步利用R語言包（“WGCNA”“l(fā)imma”包）進(jìn)行評(píng)估，分析每個(gè)模塊與兩個(gè)臨床性狀（腫瘤和正常）之間的相關(guān)性，結(jié)果表明，TCGA-KΙRC 中的綠色模塊和GEO中的黑色模塊相關(guān)性最大（綠色模塊：

r

=0.59，

P

﹤0.05；黑色模塊：

r

=-0.85，

P

﹤0.05）。利用“VennDiagram”包找出基因集中的重疊基因，共提取出112 個(gè)重疊基因，作為用于后續(xù)進(jìn)行驗(yàn)證共表達(dá)模塊的基因。

2.2 基因的功能富集分析

篩選出112 個(gè)在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中均表達(dá)的預(yù)后基因，選取112 個(gè)基因中表達(dá)量為前30 的預(yù)后基因進(jìn)行GO 富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BP 以白細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)、上皮遷移及組織遷移為主，CC 以含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞頂端、頂端質(zhì)膜及細(xì)胞-細(xì)胞連接為主，MF 以鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合和鈉通道活性為主（圖1A）；在KEGG 通路分析中，以細(xì)胞黏附分子、緊密連接和致病性大腸桿菌的感染為主要作用通路（圖1B）。

圖1 共表達(dá)基因的富集分析

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵基因的識(shí)別

利用STRΙNG 數(shù)據(jù)庫建立重疊基因的PPΙ 網(wǎng)絡(luò)，共有21個(gè)節(jié)點(diǎn)和25個(gè)邊緣（圖2A）。采用Cyto-Hubba 插件的MCC 原則從PPΙ 網(wǎng)絡(luò)中選擇關(guān)鍵基因，排名前10 的基因包括RAS 癌基因家族成員25（member RAS oncogene family，RAB25）、上皮剪接調(diào)節(jié)蛋白1（epithelial splicing regulatory protein 1，ESRP1）、上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EPCAM）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、T 細(xì)胞分化蛋白2（T-cell differentiation protein 2，MAL2）、粒頭樣轉(zhuǎn)錄因子2（grainyhead like transcription factor 2，GRHL2）、銜接蛋白復(fù)合物1 亞單位mu 2（adaptor related protein complex 1 subunit mu 2，AP1M2）、磷 脂 酰 肌 醇 蛋 白 聚 糖3（glypican 3，GPC3）、銅藍(lán)蛋白（ceruloplasmin，CP）、緊密連接蛋白（occludin，OCLN）（圖2B）。

圖2 PPΙ網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵基因的可視化圖

2.4 關(guān)鍵基因的預(yù)后意義分析

結(jié)合TCGA 中的生存時(shí)間對(duì)得到的10 個(gè)關(guān)鍵基因的預(yù)后意義進(jìn)行分析。Kaplan-Meier 曲線分析結(jié)果表明，OCLN 高表達(dá)患者的OS 長于OCLN低表達(dá)患者，而GPC3、RAB25 及GRHL2 低表達(dá)患者的OS 分別長于GPC3、RAB25 及GRHL2 高表達(dá)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.05）（圖3）。OLCN 及MAL2 高表達(dá)患者的DFS 分別長于OLCN 及MAL2 低表達(dá)患者，GPC3 及CP 低表達(dá)患者的DFS分別長于GPC3 及CP 高表達(dá)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.05）（圖4）。

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫中KΙRC患者關(guān)鍵基因的OS分析

圖4 GEPΙA22數(shù)據(jù)庫中KΙRC患者關(guān)鍵基因的DFS分析

3 討論

KΙRC 占腎癌的85%左右，大部分散發(fā)性KΙRC是單側(cè)單病灶，無癥狀腎癌占33%～50%，因此當(dāng)患者確診時(shí)往往處于臨床晚期并存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能。KΙRC 患者除腎癌根治術(shù)外，對(duì)化療、放療及靶向治療均不夠敏感，并且缺乏精確的分子靶點(diǎn)，導(dǎo)致晚期KΙRC 患者的生存率較低。因此，需要更好的生物標(biāo)志物預(yù)測KΙRC 患者的預(yù)后。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)TCGA 及GEO 數(shù)據(jù)庫中共737 例大樣本基因組測序結(jié)果進(jìn)行分析，共鑒定出112 個(gè)具有相同表達(dá)趨勢(shì)的重要基因，然后利用GO 功能富集分析，發(fā)現(xiàn)大部分基因與白細(xì)胞遷移、含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)、鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性有關(guān)，表明其在炎性反應(yīng)、細(xì)胞組織構(gòu)成及鈉離子通道活性中發(fā)揮重要作用。KEGG 通路分析結(jié)果表明，這些基因深度參與細(xì)胞黏附分子通路，從而介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合分子，它們可通過受體-配體結(jié)合的形式發(fā)揮重要作用，使得其在細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間或細(xì)胞-基質(zhì)-細(xì)胞間發(fā)生黏附，在識(shí)別細(xì)胞、細(xì)胞活化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞伸展與移動(dòng)等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)、凝血、腫瘤轉(zhuǎn)移以及創(chuàng)傷愈合等一系列重要生理和病理過程的分子基礎(chǔ)。此外，根據(jù)Cytoscape 中CytoHubba 插件的MCC 評(píng)分，篩選出了前10 個(gè)與KΙRC 預(yù)后最相關(guān)的基因（

RAB25

、

ESRP1

、

EPCAM

、

VEGFA

、

MAL2

、

GRHL2

、

AP1M2

、

GPC3

、

CP

、

OCLN

），其中

OCLN

、

RAB25

、

GRHL2

及

GPC3

與KΙRC 患者的OS 有關(guān)，而

OLCN

、

GPC3

、

CP

及

MAL2

與KΙRC 患者的DFS 有關(guān)。Rab 蛋白是真核生物中保守的小分子鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）酶家族，目前已有超過70 個(gè)Rab 蛋白成員被鑒定參與人類細(xì)胞囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控、內(nèi)小體的捕獲和循環(huán)以及胞吐作用等。RAB25 又名CATX-8 或RAB11C，是Rab家族中的一員，主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)，具有鳥嘌呤核苷酸結(jié)合序列，可與GTP 或鳥苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）結(jié)合以調(diào)節(jié)RAB25 的活性，而羧基末端的CCXXX 基序決定了RAB25 在特定囊泡上的結(jié)合，并控制了膜轉(zhuǎn)運(yùn)；當(dāng)鳥嘌呤核苷酸交換因子激活后，GDP 與RAB25 分離，活性的GTP 結(jié)合RAB25 并參與囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)和內(nèi)小體回收，高表達(dá)的RAB25 可不同程度地影響多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，與腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。研究表明，RAB25 蛋白在腫瘤（如膀胱癌、前列腺癌、肺癌、胃癌等）組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織。目前主要認(rèn)為有3 種機(jī)制調(diào)控RAB25 的表達(dá)：表觀遺傳調(diào)控、微小RNA（microRNA，miRNA）調(diào)控和拷貝數(shù)變異，當(dāng)RAB25 高表達(dá)時(shí)可導(dǎo)致預(yù)后不良。雖然各種細(xì)胞內(nèi)機(jī)制研究表明RAB25 可誘導(dǎo)惡性腫瘤進(jìn)展，但目前仍不清楚低水平的RAB25 如何抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。有研究表明，RAB25 的結(jié)合伙伴Rab 偶聯(lián)蛋白（Rab-coupling protein，RCP）可以促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。Tang的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中RAB25 效應(yīng)蛋白受體組分蛋白（receptor component protein，RCP）的表達(dá)水平可能是

RAB25

基因在惡性腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮依賴作用的關(guān)鍵因素，由于RCP 可以激活RAS 蛋白，推測

RAB25

基因的過表達(dá)可使RCP 遠(yuǎn)離激活的RAS 蛋白，從而降低其轉(zhuǎn)化活性。本研究中，

RAB25

基因高表達(dá)可導(dǎo)致KΙRC 患者預(yù)后不良，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。OCLN 蛋白是構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接的重要蛋白分子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞旁通透性屏障，

OCLN

基因敲除小鼠在不同器官（如結(jié)腸、胃、膀胱）的上皮細(xì)胞中顯示出正常的屏障功能和跨上皮阻力，但該基因的突變可能導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖及組織學(xué)異常，從而影響幼兒的生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致生殖缺陷；在人子宮內(nèi)膜癌中，OCLN 蛋白表達(dá)水平隨著惡性腫瘤的進(jìn)展而降低。GPC3 是蛋白聚糖家族成員之一，是一種硫酸乙酰肝素蛋白多糖和細(xì)胞表面癌胚蛋白，在多種實(shí)體胚胎腫瘤中高表達(dá)，包括大多數(shù)肝母細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤、某些生殖細(xì)胞腫瘤亞型和少數(shù)橫紋肌肉瘤。GPC3 通過其核心蛋白和硫酸乙酰肝素側(cè)鏈激活典型的WNT/β-聯(lián)蛋白（β-catenin）通路，在調(diào)控細(xì)胞生長和分化方面具有重要作用，與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在這些惡性腫瘤中經(jīng)常過表達(dá)。

GPC3

的功能缺失突變可導(dǎo)致辛普森-戈拉比-貝梅爾綜合征，這是一種X 染色體連鎖的遺傳疾病，易導(dǎo)致惡性腫瘤，包括肝母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤。目前針對(duì)GPC3 有多種免疫治療方法，包括腫瘤疫苗、抗體-藥物結(jié)合物、雙特異性抗體、嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫療法等，為多種實(shí)體胚胎腫瘤的治療提了更多可能。粒頭樣轉(zhuǎn)錄因子（grainyhead like transcription factor，GRHL）家族由3 種核蛋白組成，分別為GRHL1、GRHL2 和GRHL3，它們負(fù)責(zé)驅(qū)動(dòng)上皮細(xì)胞的命運(yùn)。GRHL2 在發(fā)育過程中的主要作用是維持適當(dāng)?shù)哪I小管形成和抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，有證據(jù)表明GRHL2 在各種惡性腫瘤中既有抑癌作用又有致癌作用。研究表明，GRHL2 與各種類固醇受體（如雄激素和雌激素受體）有關(guān)；GRHL2 作為一個(gè)先鋒因子和輔激活因子，可能直接影響類固醇受體的轉(zhuǎn)錄活性，從而導(dǎo)致相應(yīng)細(xì)胞的突變。綜上所述，本文通過WGCNA 分析了不同數(shù)據(jù)庫的高通量測序數(shù)據(jù)，識(shí)別了與KΙRC 預(yù)后相關(guān)的候選基因，其中

OCLN

、

RAB25

、

GRHL2

及

GPC3

與KΙRC 患 者 的OS 有 關(guān)，而

OLCN

、

GPC3

、

CP

及

MAL2

與KΙRC 患者的DFS 有關(guān)，這可能成為未來惡性腫瘤治療的新靶點(diǎn)，但這些基因促進(jìn)或抑制KΙRC 發(fā)展的具體機(jī)制尚不清楚。此外，這些基因之間的關(guān)系及與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)系也需進(jìn)一步的研究證實(shí)。