KIF3B基因?qū)θ幮匀榘┘毎飳W(xué)特性和阿霉素化療敏感性的影響

張潤澤 鄭艷 賈惠卿 遲菁華 項鋒鋼 王成勤

[摘要] 目的 研究KIF3B基因?qū)θ幮匀榘㎝DA-MB-231細胞生物學(xué)特性和阿霉素化療敏感性的影響。

方法 用Western blot技術(shù)檢測KIF3B在人三陰性乳癌細胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468中的表達，取KIF3B高表達細胞MDA-MB-231用于后續(xù)實驗。用sh-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞作為對照組，用sh-KIF3B沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞作為實驗組。應(yīng)用Western blot方法檢測基因沉默效率和基因沉默后上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白E-cadherin、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9表達變化，Transwell實驗檢測細胞遷移、侵襲能力變化，流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化，MTT實驗檢測細胞增殖能力和對阿霉素化療敏感性的變化。

結(jié)果

KIF3B在三陰性乳癌細胞MDA-MB-231中高表達，而在MDA-MB-468中低表達（t=19.92，P<0.01）。沉默MDA-MB-231細胞KIF3B基因后，細胞遷移、侵襲數(shù)目明顯減少（t=29.54、18.32，P<0.01），G0/G1期細胞比例降低而G2/M期細胞

比例增加（t=4.82、19.05，P<0.01），同時細胞增殖能力被顯著抑制（F=7.56～270.09，P<0.01），對阿霉素化療敏感性明顯增加（F=26.37～167.11，P<0.01），E-cadherin表達升高（t=19.71，P<0.01），而MMP-2和MMP-9表達降低（t=26.57、16.11，P均<0.01）。

結(jié)論 沉默三陰性乳癌MDA-MB-231細胞KIF3B基因表達可以抑制細胞增殖、阻滯細胞周期并增加細胞對阿霉素化療敏感性，并可以通過EMT抑制細胞遷移和侵襲。

[關(guān)鍵詞] 驅(qū)動蛋白超家族蛋白3B;三陰性乳癌;細胞增殖;腫瘤轉(zhuǎn)移;細胞周期;多柔比星;抗藥性，腫瘤

[中圖分類號] R737.9

[文獻標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）03-0321-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.122

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210628.1618.004.html;2021-06-29 09：40：11

EFFECT OF THE KIF3B GENE ON THE BIOLOGICAL CHARACTERISTICS AND DOXORUBICIN CHEMOSENSITIVITY OF TRIPLE-NEGATIVE BREAST CANCER CELLS

ZHANG Runze， ZHENG Yan， JIA Huiqing， CHI Jinghua， XIANG Fenggang， WANG Chengqin

（Department of Pathology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of the KIF3B gene on the biological characteristics and doxorubicin chemosensitivity of triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cells.

Methods Western blot was used to measure the expression of KIF3B in human triple-negative breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MDA-MB-468， and the MDA-MB-231 cells with high expression of KIF3B were selected for subsequent experiments. MDA-MB-231 cells transfected with sh-NC plasmid were established as control group， and those transfected with sh-KIF3B silencing plasmid were established as experimental group. Western blot was used to measure silencing efficiency and changes in the expression of the epithelial-mesenchymal transition （EMT）-related proteins E-cadherin， matrix metallopeptidase-2 （MMP-2）， and matrix metallopeptidase-9 （MMP-9）; Transwell assay was used to measure the changes in cell migration and invasion abilities; flow cytometry was used to observe the change in cell cycle; MTT assay was used to measure the changes in proliferative capacity and doxorubicin chemosensitivity.

Results KIF3B showed high expression in triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cells and low expression in MDA-MB-468 cells （t=19.92，P<0.01）. After the KIF3B gene was silenced in MDA-MB-231 cells， there were significant reductions in the number of migrating and invading cells （t=29.54，18.32;P<0.01）， a significant reduction in the proportion of cells in G0/G1 phase， and a significant increase in the proportion of cells in G2/M phase （t=4.82，19.05;P<0.01）. Meanwhile， cell proliferation was significantly inhibited （F=7.56-270.09，P<0.01）， and doxorubicin sensitivity was significantly increased （F=26.37-167.11，P<0.01）. There were an increase in the expression of E-cadherin （t=19.71，P<0.01） and reductions in the expression of MMP-2 and MMP-9 （t=26.57，16.11;P<0.01）.

Conclusion Silencing of the KIF3B gene in triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cells can inhibit cell proliferation， cause cell cycle arrest， and increase the doxorubicin chemosensitivity of cells， and it can also inhibit cell migration and invasion through EMT.

[KEY WORDS]kinesin superfamily proteins 3B; triple negative breast neoplasms; cell proliferation; neoplasm metastasis; cell cycle;doxorubicin; drug resistance， neoplasm

乳癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤，也是第二大常見的癌癥致死原因[1]。據(jù)統(tǒng)計，乳癌發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%。三陰性乳癌（TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體（HER2）表達均為陰性的乳癌，占所有乳癌病理類型的12%～17%[2]。TNBC好發(fā)于相對年輕的婦女，具有預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高和死亡率高等特點，已成為近年來乳癌研究和關(guān)注的焦點。已有研究證實，與Luminal型和HER2過表達型的乳癌相比，TNBC對新輔助化療更加敏感，其病理完全緩解（PCR）率更高[3]。

驅(qū)動蛋白超家族蛋白（KIFs）是一類分子馬達，在細胞內(nèi)起著運輸媒介的作用，它可以依靠微管等細胞骨架結(jié)構(gòu)將細胞內(nèi)貨物（如囊泡、細胞器、蛋白質(zhì)復(fù)合物和RNA等）運輸?shù)郊毎麅?nèi)的指定位置[4]。KIFs有14個亞家族，由45個成員組成。KIF3B是KIF3亞家族的成員，它是一種重要的蛋白質(zhì)，在有絲分裂期間，KIF3B負責(zé)囊泡運輸和膜擴張，從而調(diào)節(jié)細胞遷移。近年來，KIF3B與疾病的發(fā)生和發(fā)展之間的關(guān)系越來越受到關(guān)注[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，KIF3B在胰腺癌、肝癌、口腔鱗癌、精原細胞瘤、胃癌、結(jié)腸直腸癌和前列腺癌中存在異常表達[5-11]。但目前尚未有關(guān)于KIF3B與TNBC關(guān)系的報道。本研究擬沉默乳癌細胞中KIF3B基因，以觀察其對細胞增殖、遷移、侵襲、細胞周期、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白表達和阿霉素敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人TNBC細胞株MDA-MB-231和MDA-MB-468購自中國科學(xué)院（中國上海）;KIF3B抗體購自美國Santa Cruz公司;β-actin抗體購自武漢云克隆科技股份有限公司;E-cadherin抗體購自英國 Abcam 公司;基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;羊抗鼠和羊抗兔二抗均購自Bioworld公司;sh-KIF3B沉默質(zhì)粒及sh-NC質(zhì)粒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司;Transwell小室購自美國Corning公司;DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD生物技術(shù)公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;增強化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒購于美國Millipore公司;LipofectamineTM 2000 購于美國Invitrogen公司;碘化丙啶（PI）溶液、MTT粉末、二甲基亞砜（DMSO）、鹽酸阿霉素、結(jié)晶紫粉末均購自北京索萊寶科技有限公司;RNAseA溶液購于天根生化科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將MDA-MB-231細胞和MDA-MB-468細胞置于含有體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。用Western blot法檢測MDA-MB-231細胞和MDA-MB-468細胞KIF3B表達，取KIF3B高表達細胞MDA-MB-231用于后續(xù)實驗。轉(zhuǎn)染前1 d將處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞接種到6孔板中，達到70%融合度時，按照說明書方法用LipofectamineTM2000把質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，培養(yǎng)72 h用于后續(xù)實驗。將未經(jīng)處理的MDA-MB-231細胞作為MOCK組，將轉(zhuǎn)染sh-NC質(zhì)粒的MDA-MB-231細胞作為sh-NC組，將轉(zhuǎn)染sh-KIF3B沉默質(zhì)粒的MDA-MB-231細胞作為sh-KIF3B組。

1.2.2 Western blot法檢測細胞中KIF3B及EMT相關(guān)蛋白表達 提取MDA-MB-231細胞和MDA-MB-468細胞蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液煮沸。行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，300 mA轉(zhuǎn)膜2 h將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫下用50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗KIF3B（1∶500）、E-cadherin（1∶1 000）、MMP-2（1∶1 000）、

MMP-9（1∶1 000）和β-actin（1∶4 000）

4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入相應(yīng)二抗（1∶4 000）室溫孵育2 h，重復(fù)TBST洗膜步驟，最后加入ECL后曝光顯影并分析條帶灰度值。目的蛋白相對表達量以目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

比較不同細胞KIF3B表達效率，取KIF3B高表達細胞MDA-MB-231用于后續(xù)沉默實驗。重復(fù)上述步驟，提取對數(shù)生長期的MOCK組、sh-KIF3B組和sh-NC組細胞蛋白，檢測KIF3B沉默效率。

1.2.3 Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲能力

取對數(shù)生長期的sh-KIF3B組和sh-NC組細胞，用胰蛋白酶消化后重懸于無血清DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細胞密度為1×108/L，在Transwell小室上室（均勻鋪稀釋過的50 mL Matrigel基質(zhì)膠，Matrigel基質(zhì)膠∶無血清培養(yǎng)基=1∶8）均勻加入200 μL細胞懸液，下室加入600 μL含體積分數(shù)0.15胎牛血清的培養(yǎng)基。當(dāng)觀察到下室有細胞穿過后，取出上室，吸出培養(yǎng)基并用PBS沖洗，用棉棒輕輕擦去上室未穿過的細胞，多聚甲醛固定15 min，5 g/L結(jié)晶紫染色30 min，流水沖洗干凈，晾干后200倍光鏡下隨機選取5個視野觀察并計數(shù)。

1.2.4 MTT實驗檢測細胞增殖 將處于對數(shù)生長期的sh-KIF3B組和sh-NC組細胞以每孔3×103個接種于96孔板，每組分別接種6個復(fù)孔，將細胞置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5 d后，向各孔中加入20 μL MTT（PBS配制，5 g/L）溶液并于培養(yǎng)箱孵育2 h，棄去上清液，每孔中加入DMSO溶液150 μL，低速震蕩10 min，使用全功能微孔板檢測儀檢測各孔490 nm波長處的吸光度（A）值，分析數(shù)據(jù)并繪制細胞生長曲線。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 取對數(shù)生長期的sh-KIF3B組和sh-NC組細胞胰蛋白酶消化后離心，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入體積分數(shù)0.70乙醇4 ℃固定過夜，再次使用PBS溶液洗滌3次后加入200 μL PBS和2 μL RNaseA（終濃度為20 mg/L）重懸細胞，37 ℃孵育30 min，再加入 500 μL PI 染液（終濃度為 50 mg/L），避光孵育30 min，最后使用流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.2.6 MTT實驗檢測細胞活性 將對數(shù)生長期的sh-KIF3B組和sh-NC組細胞，以每孔1×104個接種于96孔板，待細胞貼壁后，再分別加入阿霉素使其濃度達到0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00 μmol/L，同時設(shè)置空白組，每組設(shè)置6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，向各孔中加入20 μL MTT（PBS配制，5 g/L）溶液并于培養(yǎng)箱孵育2 h，棄去上清液，每孔加入DMSO溶液150 μL，低速震蕩10 min，用全功能微孔板檢測儀檢測各孔490 nm波長處吸光度（A）值。計算各給藥組的細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）×100%。

以上所有實驗均獨立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及析因設(shè)計的方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 TNBC細胞系中KIF3B蛋白表達及沉默效率

Western blot法檢測結(jié)果顯示，KIF3B蛋白在MDA-MB-231中呈高表達，而在MDA-MB-468細胞中呈低表達，兩種細胞KIF3B蛋白表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=19.92，P<0.01）。將MDA-MB-231細胞用于沉默KIF3B基因，分別轉(zhuǎn)染sh-NC質(zhì)粒和sh-KIF3B沉默質(zhì)粒。Western blot法檢測結(jié)果顯示，sh-KIF3B組KIF3B蛋白表達較MOCK組和sh-NC組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=284.56，P<0.01）。表明KIF3B基因成功沉默。見圖1。

2.2 沉默KIF3B基因?qū)NBC細胞遷移、侵襲能力的影響

Transwell遷移實驗顯示，沉默MDA-MB-231細胞KIF3B基因后，sh-KIF3B組遷移細胞數(shù)目（269.4±21.4）明顯低于sh-NC組（754.2±29.8），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=29.54，P<0.01）。侵襲實驗顯示，沉默MDA-MB-231細胞KIF3B基因后，sh-NC組侵襲細胞數(shù)目為（1 120.0±53.5）個，sh-KIF3B組為（452.7±33.5）個，兩組比較差異有顯著意義（t=18.32，P<0.01）。見圖2。

2.3 沉默KIF3B對TNBC細胞增殖能力的影響

MTT實驗結(jié)果表明，沉默KIF3B對TNBC細胞增殖能力影響的組別與時間之間存在交互效應(yīng)（F組別×?xí)r間=49.601，P<0.01）。MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染sh-KIF3B質(zhì)粒后，同一時間下sh-KIF3B組細胞增殖能力明顯低于sh-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.56～270.09，P<0.01）。見表1。

2.4 沉默KIF3B對TNBC細胞周期的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，sh-NC組和sh-KIF3B組G0/G1期細胞比例分別為（78.29±1.99）%和（71.55±1.39）%，G2/M期細胞比例分別為（4.72±0.32）%和（10.13±0.38）%。與sh-NC組相比，sh-KIF3B組細胞G0/G1期比例顯著減少，而G2/M期比例則顯著增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.82、19.05，P<0.01）。見圖3。

2.5 沉默KIF3B對TNBC細胞阿霉素敏感性的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，沉默KIF3B后TNBC細胞對阿霉素敏感性影響的組別與濃度存在交互效應(yīng)（F組別×濃度=15.201，P<0.01）。在相同濃度阿霉素作用下，sh-KIF3B組細胞存活率較低，表明沉默KIF3B基因后MDA-MB-231細胞對阿霉素敏感性明顯上升，差異有顯著意義（F=26.37～167.11，P<0.01）。見表2。

2.6 沉默KIF3B對EMT相關(guān)蛋白表達的影響

sh-NC組和sh-KIF3B組細胞EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、MMP-2和MMP-9的相對表達量見圖4。與sh-NC組相比較，sh-KIF3B組E-cadherin表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=19.71，P<0.01）;MMP-2和MMP-9表達降低（t=26.57、16.11，P<0.01）。

3 討? 論

TNBC具有預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高和死亡率高等特點，已成為近年來乳癌研究和關(guān)注的焦點。由于缺乏相應(yīng)治療靶點，TNBC病人無法從內(nèi)分泌治療或抗HER2治療中獲益。因此，無論是早期還是晚期的TNBC病人，化療是目前最主要的治療方法，并且與其他亞型的乳癌病人相比，TNBC病人對化療有更高的反應(yīng)率。大量研究結(jié)果顯示，TNBC對蒽環(huán)類和紫杉醇藥物治療敏感，目前臨床上針對TNBC的新輔助化療方案主要以蒽環(huán)類和紫杉醇藥物為基礎(chǔ)[12-13]。但除了傳統(tǒng)化療外，TNBC的治療手段非常有限，因此迫切需要尋找一個新的TNBC治療靶點。

KIFs的功能已廣為人知，其與神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和腎病等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[14-16]。作為KIF3亞家族的成員，KIF3B參與許多生理過程，包括有絲分裂、減數(shù)分裂和大分子的運輸。在有絲分裂期間，KIF3B扮演著囊泡運輸和膜擴張的角色，KIF3B還可以調(diào)節(jié)細胞遷移、細胞周期，促進細胞增殖和存活[4]。KIF3B亞基突變使多囊腎病小鼠產(chǎn)生致命表型[17-19]。在遠端腎小管酸中毒中，KIF3B和人腎陰離子交換劑1（kAE1）在人腎組織中共表達，并且KIF3B可能參與了HEK293T細胞中kAE1的積累[16]。KIF3B也在大鼠腎臟缺血/再灌注損傷和急性脊髓損傷中起著重要作用[20-21]。KIF3B也是皮質(zhì)神經(jīng)元可塑性的負調(diào)節(jié)劑[22]。大量研究表明，驅(qū)動蛋白廣泛參與各種腫瘤的發(fā)生，其表達水平與許多腫瘤的發(fā)生直接相關(guān)[23-25]。有研究顯示，在肝癌、精原細胞瘤、口腔鱗狀細胞癌、胰腺癌、前列腺癌及胃癌等組織中均存在KIF3B高表達[5-9，11]。在結(jié)直腸癌中過表達KIF3B可以逆轉(zhuǎn)LEF-AS1敲降引起的細胞增殖、遷移和侵襲抑制并促進細胞的凋亡[10]。hsa_circ_0032462可以調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞中KIF3B水平，而KIF3B可逆轉(zhuǎn)hsa_circ_0032462過表達誘導(dǎo)的骨肉瘤細胞增殖以及轉(zhuǎn)移[26]。然而，目前尚無敲降KIF3B影響TNBC細胞生物學(xué)特性和阿霉素化療敏感性的報道。

本文Transwell實驗結(jié)果顯示，sh-KIF3B組細胞遷移和侵襲數(shù)量明顯減少，證明沉默MDA-MB-231細胞KIF3B基因可以下調(diào)細胞遷移和侵襲能力;MTT實驗結(jié)果表明，沉默KIF3B基因后細胞增殖能力下降，且在相同濃度阿霉素處理下KIF3B沉默組細胞存活率較低，表明沉默KIF3B可以抑制細胞增殖，并提高細胞對阿霉素的敏感性;流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，KIF3B基因沉默后，G0/G1期細胞比例顯著下降，而G2/M期細胞比例顯著升高，表明沉默KIF3B誘導(dǎo)了細胞周期阻滯。EMT是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要現(xiàn)象，也是腫瘤細胞發(fā)生浸潤遷移和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移的重要機制之一[27]。EMT在乳癌增殖和轉(zhuǎn)移中也有著重要意義[28]。本研究檢測了KIF3B基因沉默后EMT相關(guān)蛋白表達變化，結(jié)果顯示沉默KIF3B基因后MMP-2和MMP-9表達降低，而E-cadherin表達升高，差異有顯著性。表明沉默KIF3B可以通過EMT途徑調(diào)節(jié)TNBC細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，沉默TNBC細胞中KIF3B基因可以抑制細胞遷移、侵襲和增殖能力，阻滯細胞周期，降低MMP-2和MMP-9表達，提高E-cadherin表達。KIF3B基因沉默還可以與阿霉素協(xié)同作用，改善治療效果。因此，KIF3B有望成為新的TNBC治療靶點。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）