浸潤性乳癌PBMC核心基因分析及mRNA-miRNA-lncRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

劉皓 曲一丹 周昊 趙俊江 鄭自文 張堅

[摘要] 目的

尋找浸潤性乳癌病人外周血單個核細胞（PBMC）的核心（HUB）基因，并構(gòu)建mRNA-miRNA-lncRNA網(wǎng)絡(luò)，探討浸潤性乳癌診療新靶點。

方法 基于對基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）的數(shù)據(jù)分析，獲取浸潤性乳癌病人術(shù)前PBMC的表達譜。應(yīng)用GEO2R在線工具篩選差異基因，DAVID工具進行GO功能注釋分析和KEGG信號通路分析，STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異基因蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，CytoScape工具篩選HUB基因。應(yīng)用mirDIP與starbase工具預(yù)測HUB基因上游的miRNA以及l(fā)ncRNA并構(gòu)建對應(yīng)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

結(jié)果 獲得差異基因87個，其中上調(diào)基因59個，下調(diào)基因28個。差異基因的本體功能主要富集在血紅蛋白復(fù)合物、胞漿組分、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等方面，KEGG通路主要與類風濕性關(guān)節(jié)炎、單純皰疹病毒感染、破骨細胞分化、甲型流感病毒感染等相關(guān)。共獲得4個HUB基因ALAS2、EGR1、FOS、DUSP1，并預(yù)測到符合標準的7個miRNA及20個lncRNA。

結(jié)論 本研究獲得了浸潤性乳癌病人的PBMC差異基因與HUB基因、可視化mRNA-miRNA-lncRNA網(wǎng)絡(luò)，為通過PBMC對浸潤性乳癌進行診治提供可靠的理論基礎(chǔ)與方向。

[關(guān)鍵詞] 乳房腫瘤;外周血單個核細胞;基因;靶向治療

[中圖分類號] R737.9

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）03-0327-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.135

[開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210628.1725.018.html;2021-06-29 09：43：54

HUB GENES IN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS OF PATIENTS WITH INVASIVE BREAST CANCER AND CONSTRUCTION OF AN mRNA-miRNA-lncRNA NETWORK

LIU Hao， QU Yidan， ZHOU Hao， ZHAO Junjiang， ZHENG Ziwen， ZHANG Jian

（Department of Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate new targets for the diagnosis and treatment of invasive breast cancer by searching for HUB genes in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） of patients with invasive breast cancer and constructing an mRNA-miRNA-lncRNA network.

Methods A data analysis was performed for the Gene Expression Omnibus Database （GEO） to obtain the expression profile of PBMCs from patients with invasive breast cancer before surgery. GEO2R online tool was used to screen out differentially expressed genes; DAVID tool was used for gene ontology （GO） functional annotation analysis and Kyoto Encyclope-

dia of Genes and Genomes （KEGG） signaling pathway analysis; STRING database was used to construct a protein-protein interaction （PPI） network for differentially expressed genes; CytoScape tool was used to screen out HUB genes. The mirDIP and starbase tools were used to predict the upstream miRNAs and lncRNAs of HUB genes and construct correspondence networks.

Results

A total of 87 differentially expressed genes were obtained， among which there were 59 upregulated genes and 28 downregulated genes. The GO functions of the differentially expressed genes were mainly enriched in hemoglobin complexes， cytoplasmic components， and positive regulation of RNA polymerase Ⅱ promoter transcription， and the KEGG pathways were mainly associated with rheumatoid arthritis， herpes simplex infection， osteoclast differentiation， and influenza A virus. A total of 4 HUB genes were obtained， i.e.， ALAS2， EGR1， FOS， and DUSP1， and 7 miRNAs and 20 lncRNAs met the criteria.

Conclusion This study obtains differentially expressed genes and HUB genes in PBMCs of patients with invasive breast cancer and visualizes the mRNA-miRNA-lncRNA network to provide reliable theoretical basis and direction for the diagnosis and treatment of invasive breast cancer by PBMCs.

[KEY WORDS]breast neoplasms; peripheral blood single cell; genes; molecular targeted therapy

乳癌是常見的惡性腫瘤之一，在女性中其發(fā)病率高居全球首位[1]。目前，臨床上對乳癌確診依靠組織活檢，根據(jù)組織中的腫瘤標記物對疾病進行診治。但這種方法侵入性強，動態(tài)性檢查效果差。隨著乳癌病人對常規(guī)療法的耐藥性逐漸增加，需進一步尋找有效的分子靶標進行靶向治療。外周血單個核細胞（PBMC）主要由包括淋巴細胞和單核細胞在內(nèi)的機體免疫細胞組成，在人體的免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮至關(guān)重要作用。癌組織可能將癌細胞釋放到血液中，被PBMC吞噬并表達癌細胞含有的標志物，這種變化可能比存在于外周血中的腫瘤細胞更早被檢測到。通過發(fā)現(xiàn)PBMC基因的變化，有助于對浸潤性乳癌進行早期的診斷與治療。生物信息學與微陣列技術(shù)可為深度研究腫瘤在基因組水平上的發(fā)展進程提供幫助。本文研究應(yīng)用生物信息學方法，通過微陣列數(shù)據(jù)的挖掘與分析，確定浸潤性乳癌病人PBMC中的核心（HUB）基因，預(yù)測并構(gòu)建與其對應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為探討浸潤性乳癌的生物學過程及臨床診療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中獲取所需基因表達數(shù)據(jù)GSE27562（截止日期2019-05-25）。篩選條件：①樣本總量>30;②樣本資料來源于臨床病人;③原始芯片數(shù)據(jù)提取，實驗類型為Expression profiling by array。共采集了162例樣本，選取其中的57例經(jīng)活檢證實為浸潤性乳癌病人的術(shù)前外周血樣本，31例經(jīng)乳房X線攝影檢查結(jié)果為陰性的健康人外周血樣本。

1.2 差異基因分析

應(yīng)用GEO中GEO2R在線分析工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）對差異基因進行分析。篩選標準：P<0.05，校正P值（adjusted P-value）<0.05，基因表達值倍數(shù)變化（FC）≥0.8。應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)庫將不同基因的名稱轉(zhuǎn)換成統(tǒng)一的標準縮寫。

1.3 GO分析及KEGG分析

應(yīng)用DAVID6.8（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）富集分析差異表達的基因，揭示其生物學功能。分別進行GO功能注釋分析和KEGG信號通路分析，獲得差異表達基因的基因功能和信號通路的功能。GO富集標準：最小交集≥5、P≤0.05。KEGG富集標準：最小交集≥3、P≤0.05。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。存在互作的閾值條件為：minimum required interaction score>0.4。使用CytoScape軟件可視化PPI數(shù)據(jù)。

1.5 HUB基因的篩選

應(yīng)用CytoScape軟件中的cytohubba插件，選取MCC、Degree、Bottleneck方法分別篩選出前10個差異表達基因。將上述3種方法篩選到的基因提交至Veen（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）在線工具，獲取三者交集，交集的節(jié)點對應(yīng)的基因為具有重要生理調(diào)節(jié)功能的HUB基因。

1.6 HUB基因上游互作miRNA、miRNA-長鏈非編碼RNA（lncRNA）分析

應(yīng)用mirDIP在線工具進行分析、預(yù)測HUB基因上游互作miRNA。獲得mRNA-miRNA相互關(guān)系文件并導(dǎo)入CytoScape軟件進行網(wǎng)絡(luò)可視化。篩選標準：Score class：top 1%，Integrated Score≥0.6，miRNA至少與兩個及兩個以上HUB基因互相關(guān)聯(lián)。將符合標準的miRNA提交至starBase在線工具，獲得lncRNA關(guān)系對。將miRNA-lncRNA相互關(guān)系文件導(dǎo)入CytoScape軟件進行網(wǎng)絡(luò)可視化。篩選標準：CLIP-Data≥5，miRNA至少與兩個及兩個以上的lncRNA相互關(guān)聯(lián)。

1.7 構(gòu)建mRNA-miRNA-lncRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

匯總lncRNA、miRNA、mRNA的相應(yīng)結(jié)果，建立相互關(guān)系文件。使用CytoScape軟件構(gòu)建可視化mRNA-miRNA-lncRNA的三元關(guān)系調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)? 果

2.1 差異基因的篩選

共獲得差異基因87個，其中上調(diào)基因59個，下調(diào)基因28個。其火山圖見圖1A。依據(jù)log FC絕對值大小排序，排名前10的上調(diào)差異基因分別為FOS、NR4A2、DDX6、USP9X、CXCL8、CTSZ、DUSP1、INO80D、EGR1及ARHGEF7，排名前10的下調(diào)差異基因則分別為PRKD2、HBD、PSPH、HBM、SLC25A37、HBG2、MS4A3、HINT3、CLC、ALAS2。

2.2 差異基因的基因功能和信號通路的功能

GO分析結(jié)果顯示，細胞組成（CC）主要涉及血紅蛋白復(fù)合物、胞漿、血液微粒、胞外外體、膜、細胞間黏附連接等。生物過程（BP）主要涉及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管生成正調(diào)節(jié)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、血凝、細胞間黏附等進程。分子功能（MF）則主要包含蛋白結(jié)合、鈣黏蛋白結(jié)合參與細胞間黏附、血紅素結(jié)合等（圖1B）。KEGG富集結(jié)果顯示，差異基因主要與甲型流感病毒感染、單純皰疹病毒感染、破骨細胞分化、炎癥性腸病（IBD）、利什曼病、類風濕性關(guān)節(jié)炎等信號通路相關(guān)（圖1C）。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)與HUB基因

PPI網(wǎng)絡(luò)共涉及67個節(jié)點和88個邊緣。PPI富集P-value：<4.69e-14。PPI網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入CytoScape軟件中進行可視化（圖2A），使用MCC、Bottleneck、Degree分析方法分別篩選出前10個候選基因（圖2B），使用Venn在線工具獲取3種算法的交集基因，將這些基因定義為HUB基因，分別為ALAS2、EGR1、FOS、DUSP1。見圖2C、表1。

2.4 HUB基因的上游互作miRNA、lncRNA以及circRNA

將4個診斷候選基因提交至mirDIP進行分析，結(jié)果顯示62個上游互作miRNA符合標準。利用CytoScape軟件構(gòu)建miRNA-lncRNA相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖3A）。ALAS2基因無符合后續(xù)篩選條件的miRNA。其他3個HUB基因與7個miRNA符合后續(xù)篩選條件，并提交至starBase進行分析，結(jié)果顯示共有119個miRNA-lncRNA關(guān)系對，符合篩選條件的lncRNA基因為20個。見圖3B、表2。

2.5 lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

匯總分析符合篩選條件的miRNA及l(fā)ncRNA和HUB基因之間的關(guān)系，使用CytoScape軟件展現(xiàn)的lncRNA、miRNA、mRNA相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)見圖3C。

3 討? 論

對浸潤性乳癌的診斷治療研究一直是近年來的熱點，但乳癌起病隱匿，早期臨床癥狀不顯著，容易錯過最佳診療時機[2]。我國乳癌發(fā)病率和死亡率近年來有增高趨勢。尋找乳癌非侵入性診療的新靶點對乳癌早期診治至關(guān)重要。

癌細胞在一定情況下會進入到外周血中，被外周循環(huán)中的PBMC所吞噬，在PBMC中表達腫瘤細胞的標志物;同時，PBMC自身就擁有部分循環(huán)腫瘤細胞和腫瘤干細胞。所以，理論上來講可以通過PBMC對癌癥進行檢測。本研究尋找PBMC差異基因并進行分析，有助于了解乳癌疾病進程以及發(fā)生發(fā)展機制，為乳癌的診治提供理論支持。

微陣列技術(shù)和生物信息學分析已廣泛用于基因組水平上篩選遺傳變異，是明確人類腫瘤發(fā)生機制、確定潛在診治靶向的有力工具?；跀?shù)據(jù)庫的生物信息學技術(shù)有助于人們?nèi)娣治鲆阎蛐碌幕蚪M、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)等。本文對比了GSE27562芯片數(shù)據(jù)集內(nèi)經(jīng)組織活檢確診的浸潤性乳癌與非腫瘤病人的PBMC，兩者基因表達存在差異，表明腫瘤組織的存在影響PBMC中基因的表達。GO分析結(jié)果表明，顯著富集的模塊在MF中的血紅蛋白復(fù)合物上，其次是CC的胞漿組分上，BP主要富集于RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面。表明乳房腫瘤病人的PBMC影響細胞增殖、轉(zhuǎn)錄活性，使其增強。KEGG通路富集分析顯示，差異基因主要與類風濕性關(guān)節(jié)炎、單純皰疹病毒感染、破骨細胞分化、甲型流感病毒感染等發(fā)生發(fā)展有關(guān)。相關(guān)研究顯示，乳癌可誘導(dǎo)破骨細胞的活化，延長破骨細胞的存活[3-4]，推測這也與乳癌病人骨轉(zhuǎn)移、骨溶解、骨質(zhì)破壞相關(guān)。ANDTBACKA等[5]研究顯示，溶瘤病毒可以通過不斷增殖與增強免疫應(yīng)答的方式，使癌細胞裂解，發(fā)揮抗腫瘤的作用。溶瘤性單純皰疹病毒能夠感染腫瘤細胞并大量復(fù)制，腫瘤細胞受到其直接細胞毒的作用而死亡[6]，這種方式不僅可以高效抗腫瘤并對人體影響較小。目前有研究顯示，單純皰疹病毒中的G47能通過HER-2磷酸化抑制HER-2陽性乳癌細胞的生長、增殖，并促進癌細胞凋亡[7]，這種基于病毒的生物免疫療法對前列腺癌[8]、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤[9]的診治有幫助。流感病毒基因能夠攜帶外來DNA，使機體產(chǎn)生明顯的細胞、體液免疫應(yīng)答。流感病毒可以作為基因治療載體，擁有潛在靶向攻擊腫瘤細胞的能力。盡管類風濕性關(guān)節(jié)炎與乳癌的關(guān)系鮮有研究，但我們推測乳癌可能有影響人體發(fā)生類風濕性關(guān)節(jié)炎等免疫性疾病的風險，需實驗進一步驗證。本研究結(jié)果表明，浸潤性乳癌病人的某些感染通路可以被活化，通過對這些通路進行免疫治療可能減緩乳房腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這些與通路相關(guān)的基因是治療的新靶點。這些信號通路可能涉及乳癌的產(chǎn)生及發(fā)展過程中的各個環(huán)節(jié)與步驟，不同的環(huán)節(jié)相互作用對乳癌發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。應(yīng)用病原感染激活免疫系統(tǒng)消滅腫瘤細胞，其基礎(chǔ)理論與臨床治療均可行。

本文研究通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，采用3種不同的方法篩選獲得了HUB基因ALAS2、EGR1、DUSP1、FOS。ALAS2基因的產(chǎn)物是一種紅系特異性線粒體定位酶，其編碼的蛋白質(zhì)催化血紅素生物合成途徑的第一步，但該基因與癌癥的關(guān)系目前鮮有文獻報道。EGR1基因編碼的蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，影響著細胞分化與有絲分裂的進程;還有研究表明，EGR1是一個抑癌基因，EGR1影響了乳癌、前列腺癌、胃癌的發(fā)生發(fā)展[10-12]。乳癌EGR1過表達病人經(jīng)過內(nèi)分泌治療后往往預(yù)后良好[13]。FOS是一種原癌基因，其所屬的基因家族能夠編碼亮氨酸拉鏈蛋白，其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖和分化中占據(jù)重要位置。國外研究顯示，乳癌活檢組織中FOS表達較正常組織明顯增高，F(xiàn)OS的胞質(zhì)活性為控制乳癌生長的潛在靶標[14]。DUSP1可以使MAP激酶MAPK1/ERK2去磷酸化，進而參與多個細胞過程。BOULDING等[15]研究結(jié)果顯示，DUSP1可以參與到上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和乳癌干細胞調(diào)節(jié)的過程，從而干預(yù)乳癌的發(fā)生和進展。這些HUB基因在PBMC中的表達影響著乳癌的生物進程。多個HUB基因在組織同時表達表明腫瘤或腫瘤基質(zhì)與外周血PBMC之間存在關(guān)聯(lián);腫瘤基質(zhì)分泌的蛋白與PBMC中的受體結(jié)合，影響著PBMC在外周血中表達的改變。這些基因的發(fā)現(xiàn)有助于促進乳房腫瘤非侵入性診療的發(fā)展。

miRNA可以參與基因表達調(diào)控的重要進程中。本研究顯示，miR-144-3p表達與乳癌的分期分級相關(guān)[16]。miR-181c-5p、miR-181d-5p、miR-181b-5p、miR-181a-5p均已經(jīng)被證明參與乳癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移的相關(guān)進程[17-19]。miR-543過表達可抑制細胞增殖和細胞周期，上調(diào)細胞凋亡，并通過直接靶向ERK/MAPK抑制乳癌細胞的增殖[20]。miR-101-3p的表達上調(diào)及下調(diào)與乳房腫瘤細胞的侵襲性相關(guān)[21];同時，miR-101-3p可與多種靶基因結(jié)合，對乳癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及癌細胞的增殖過程產(chǎn)生抑制作用，并促進腫瘤細胞凋亡[22-24]。這些miRNA影響著乳癌的發(fā)生、發(fā)展，可能成為診治靶標。

LncRNA被認為是多種癌癥（包括浸潤性乳癌）發(fā)生發(fā)展的生物標記物。本文研究共發(fā)現(xiàn)20個符合條件的上游lncRNA，其中XIST、SNHG7、SNHG5、SNHG1、OIP5-AS1、NORAD、NEAT1、MIR4458HG、MALAT1、KCNQ1OT1等涉及乳癌的發(fā)生發(fā)展。其作用機制主要包括兩個方面：①通過對miRNA的調(diào)控，上調(diào)或下調(diào)靶向基因的表達，間接對癌癥的發(fā)展發(fā)揮促進或者抑制的作用，這些LncRNA包括SNHG7、SNHG5、SNHG1、XIST、OIP5-AS1和KCNQ1OT1[25-30];②通過直接對乳癌細胞信號通路進行調(diào)控影響其生物學進程，這些LncRNA包括NEAT1、NORAD、MALAT1[31-33]。本文研究發(fā)現(xiàn)的20個上游lncRNA影響浸潤性乳癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移、增殖和侵襲等進程。目前，有關(guān)浸潤性乳癌病人PBMC中l(wèi)ncRNA的生物信息數(shù)據(jù)、文獻較少，相關(guān)mRNA、lncRNA的研究有待進一步深入。

綜上所述，本文使用綜合的生物信息學分析方法，獲得浸潤性乳癌病人的PBMC差異基因，并尋找到其中的HUB基因。然后通過預(yù)測HUB基因上游的miRNA、lncRNA，構(gòu)建了mRNA-miRNA-lncRNA可視化網(wǎng)絡(luò)以顯示基因分子間的相互作用關(guān)系。本文結(jié)果為通過外周血PBMC對浸潤性乳癌進行早期診斷及臨床精準治療、靶向治療提供可靠的理論基礎(chǔ)與方向。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）