化學(xué)物致癌性體外檢測方法研究進(jìn)展

楊淼，強雨薇，周帆，張馳

(南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，江蘇 南京 210019)

0 引言

腫瘤是危害人民生命健康的最重要的公共衛(wèi)生問題，在全球約2/3國家和地區(qū)前兩位的死亡原因都是腫瘤[1]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞的多階段復(fù)雜過程，是遺傳因素和環(huán)境因素交互作用的結(jié)果，環(huán)境因素包括物理因素，化學(xué)因素和生物因素，其中化學(xué)因素占致癌因素的80%[2]，因此識別化學(xué)致癌物是腫瘤防控的首要環(huán)節(jié)。腫瘤的發(fā)生發(fā)展有很長的潛伏期，確定化學(xué)物是否具有致癌性需要漫長的觀察期。長期以來，判斷化學(xué)物是否致癌性的主要依據(jù)是哺乳動物長期致癌試驗和人群流行病學(xué)調(diào)查[3]。但這兩種方法耗時長、成本高、效率低、干擾因素多、無法反映致癌機制，難以滿足海量化學(xué)物大規(guī)?？焖俸Y選需要，亟需開發(fā)高通量、低成本的體外檢測技術(shù)，以預(yù)測化學(xué)物的長期毒性效應(yīng)，特別是致癌性?，F(xiàn)行的化學(xué)物致癌性篩選策略往往采取體內(nèi)體外相結(jié)合的組合檢測策略，體外試驗是體內(nèi)試驗的有效補充，大大縮小致癌體內(nèi)測試的化學(xué)物數(shù)量。本文就化學(xué)物致癌性的體外檢測方法進(jìn)行綜述，為化學(xué)物的致癌性的分層及組合篩選提供參考。

1 化學(xué)致癌物的分類及致癌機制

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)將包括單一及混合化學(xué)物、職業(yè)暴露、環(huán)境暴露、物理及生物因素和生活方式在內(nèi)的致癌因素按照人類致癌性、實驗動物致癌性和致癌機制研究證據(jù)的權(quán)重進(jìn)行分類。2019年，IARC將致癌因素的分類簡化為3類：第1類為人類致癌物，這類物質(zhì)有充分的人類致癌性和實驗動物致癌性證據(jù)；第2類又分為很可能的人類致癌物(2A類)和可能人類致癌物(2B類)，2A類物質(zhì)的人類致癌性證據(jù)有限，但在人源細(xì)胞或組織中觀察到充分的致癌性特征，且在實驗動物中致癌性證據(jù)充分，2B類物質(zhì)也具有人類致癌性證據(jù)有限、實驗動物致癌性證據(jù)充分的要求，但不要求人源細(xì)胞或組織中有致癌證據(jù)；第三類為未分類物質(zhì)，指那些動物實驗和人類致癌性證據(jù)均不足，或僅在實驗動物中有明確致癌性機制，人類致癌性證據(jù)不充分。截止至2020年11月28日，1類致癌因素共121種，2A類致癌因素89種，2B類致癌因素315種，3類為497種[4]。

化學(xué)致癌過程是一個復(fù)雜的多基因調(diào)控的多階段步驟。按照是否能直接損傷遺傳物質(zhì)，化學(xué)致癌物可以分為遺傳毒致癌物(Genotoxic carcinogens，GC)和非遺傳毒致癌物(Nongenotoxic carcinogens，NGC)。GC指能直接作用于DNA，引起DNA損傷或染色體突變的致癌物，又稱為致突變物或誘變劑。遺傳毒致癌物作用于體細(xì)胞DNA形成DNA加合物，誘導(dǎo)染色體斷裂、融合、缺失、錯誤分離和不分離，引起基因組損傷和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，在此基礎(chǔ)上突變的細(xì)胞無限制地增殖，最終形成腫瘤[5]。常見的GC有苯并芘[6]、N-亞硝基二甲胺[7]、黃曲霉素B1[8]、砷[9]等。GC的檢測手段發(fā)展較成熟，可以通過一系列的遺傳毒性試驗進(jìn)行檢測。根據(jù)檢測的遺傳學(xué)終點，檢測方法可以分為檢測基因突變類方法、檢測染色體和染色體組畸變類方法、檢測DNA損傷類方法。

NGC可以通過各種非損傷DNA的機制誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，致癌機制尚未闡明。現(xiàn)有研究認(rèn)為NGC的致癌機制可能與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、腫瘤促進(jìn)、免疫抑制、表觀遺傳改變等有關(guān)[10]。已證實的非遺傳毒致癌物有：佛波酯[11]，苯巴比妥鈉[12]，石棉[13]等。NGC不直接作用于DNA并且作用機制復(fù)雜，無法采用傳統(tǒng)的遺傳毒性試驗檢測，尚無成熟的檢測體系。隨著對NGC致癌機制的深入研究，對NGC的檢測手段也越來越多。Huang[14]等利用體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗結(jié)合DNA甲基化檢測的方法檢測了包含DEHP在內(nèi)的十種NGC。Schaap[15]等建立了基于小鼠干細(xì)胞的毒理基因組學(xué)方法，根據(jù)NGC特有的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)區(qū)分GC和NGC。

2 化學(xué)物致癌性體外檢測方法

2.1 遺傳毒致癌物體外檢測方法

根據(jù)不同的毒理學(xué)檢測終點，發(fā)展出了不同的遺傳毒性體外檢測方法。各國相繼頒布了標(biāo)準(zhǔn)和法律法規(guī)來規(guī)范遺傳毒性檢測策略，體外檢測往往作為組合檢測策略的重要一環(huán)。近年來，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Cooperation and Development，OECD)發(fā)布并修訂了一批遺傳毒性檢測方法，目前OECD認(rèn)可的遺傳毒性體外檢測試驗指導(dǎo)原則共10個(TG 471-TG 473，TG 476，TG 479- TG 482，TG 487，TG 490)(https://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicalssection-4-health-effects_ 20745788)。美國環(huán)保署(U.SEnvironmentalProtectionAgency，EPA)也制定了一系列有毒物質(zhì)的毒性檢測指南，其中遺傳毒性體外檢測試驗共8個(OPPTS 870.5100，OPPTS 870.5140，OPPTS 870.5250，OPPTS 870.5300，OPPTS 870.5375，OPPTS 870.5500，OPPTS 870.5575，OPPTS 870.5900)。我國衛(wèi)生部于2005年頒布了《化學(xué)品毒性鑒定技術(shù)規(guī)范》，規(guī)范中規(guī)定了化學(xué)物的毒性檢測策略，其中就包含了遺傳毒性體外檢測步驟和方法。中國檢驗檢疫科學(xué)研究院針對OECD的測試準(zhǔn)則，建立了部分遺傳毒性體外檢測方法標(biāo)準(zhǔn)(表1)。下面針對不同遺傳終點的代表性檢測方法進(jìn)行簡述。

表1 國內(nèi)外遺傳毒性體外檢測方法比較

細(xì)菌回復(fù)突變試驗(Ames試驗)是應(yīng)用最廣泛的檢測化學(xué)物誘導(dǎo)基因突變的體外方法，包括鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗和大腸桿菌回復(fù)突變試驗[16]。檢測原理為組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株在具有誘變毒性的化學(xué)物作用下可以回復(fù)成野生型，形成肉眼可見的菌落，生成野生型菌株的概率與遺傳毒物間存在劑量-反應(yīng)關(guān)系。Ames試驗中選用的菌株與檢測的突變類型有關(guān)，TA1535，TA100，WP2 uvrA，TA102用于檢測堿基置換型突變，TA1537，TA97，TA98用于檢測移碼型突變[17]。Ames試驗的優(yōu)勢在于體系成熟，操作簡單，試驗周期短。缺點是少數(shù)不在肝臟中代謝的化學(xué)物無法通過Ames試驗檢測其突變性，部分本身有較深顏色的物質(zhì)如中藥，可能會影響菌落的計數(shù)。

染色體異常是DNA損傷的直接表現(xiàn)，微核試驗是檢測染色體異常的首選方法。在遺傳毒致癌物的作用下，染色體丟失或斷裂形成的染色體片段在有絲分裂的中后期滯留在細(xì)胞質(zhì)中成為微核，微核數(shù)量反映了遺傳毒性大小[18]。傳統(tǒng)的微核試驗采用染色后高倍鏡下計數(shù)的方法計算微核數(shù)量，存在一定的主觀性。隨著技術(shù)進(jìn)步，科研工作者也對體外微核試驗進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)。有研究將流式細(xì)胞術(shù)與微核試驗相結(jié)合，與顯微鏡觀察相比，流式細(xì)胞術(shù)分析微核形成率具有高通量，客觀和自動化的優(yōu)勢[19]。在使用的細(xì)胞載體上也有創(chuàng)新，傳統(tǒng)的體外微核試驗主要使用CHO、V79、淋巴瘤細(xì)胞等細(xì)胞，在對化妝品進(jìn)行體外微核試驗時，為了更好地模擬化妝品的暴露途徑，開發(fā)了基于3D重組人工皮膚模型的微核試驗，試驗表現(xiàn)出了對遺傳毒致癌物良好的預(yù)測能力[20]。

檢測遺傳毒性的另一個重要方法是直接檢測DNA損傷，常見的檢測技術(shù)有：彗星試驗，熒光原位雜交，TUNEL，8-OHdG等。彗星試驗，又稱為單細(xì)胞凝膠電泳，是應(yīng)用最廣泛的檢測DNA鏈斷裂的體外方法。當(dāng)DNA在遺傳毒致癌物作用下發(fā)生鏈斷裂時，在電場作用下，分子量大的核DNA移動速度慢，而斷裂的DNA片段移動速度快，形成拖尾類似“彗星”[21]。到目前為止，彗星試驗已在超過300個環(huán)境和職業(yè)暴露研究中應(yīng)用[22]。有研究利用彗星實驗發(fā)現(xiàn)了包含農(nóng)藥硫丹[23]、苯及苯代謝物[24]、除草劑[25]在內(nèi)的多種DNA損傷劑。近期的研究擴展了體外彗星試驗常用的細(xì)胞株，Amaya[26]等比較了12種化學(xué)物分別在HepG2，CHL/IU，TK6細(xì)胞株上的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞是最適宜的體外彗星試驗細(xì)胞載體。

2.2 非遺傳毒致癌物的體外檢測方法

如前文所述，非遺傳毒致癌物的體外檢測一直是致癌物檢測的難點和薄弱環(huán)節(jié)。原因在于a)非遺傳毒致癌物不直接作用于DNA，無法應(yīng)用常規(guī)的遺傳毒試驗檢測；b)非遺傳毒致癌物的作用機制復(fù)雜，不同的致癌物適用不同的檢測方法；c)非遺傳毒致癌物產(chǎn)生的早期毒性反應(yīng)多為非特異改變；因此通過體外方法檢測非遺傳毒致癌物較為困難。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)雖然NGC不直接以DNA為作用靶點，但也可能通過間接途徑影響DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄及蛋白的翻譯，產(chǎn)生遺傳毒效應(yīng)，因此部分NGC也可以采用改良的遺傳毒試驗檢測，其中體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(in vitro cell transformation assay，CTL)是目前最佳的NGC體外檢測方案。CTL模擬了體內(nèi)多階段的致癌步驟，在區(qū)分GC和NGC、解釋致癌物在腫瘤發(fā)展不同階段的作用機制等方面有重要優(yōu)勢[27]。Sasaki[28]等將V-Ha-ras基因轉(zhuǎn)染BALB/c 3T3細(xì)胞，建立了Bhas 42細(xì)胞。利用Bhas 42細(xì)胞，Muramatsu[29]等發(fā)現(xiàn)了砷主要發(fā)揮腫瘤促進(jìn)的非遺傳毒性。OECD在2016年發(fā)布了以Bhas 42細(xì)胞為基礎(chǔ)的兩階段細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗的指導(dǎo)原則[30]。此外，Kanode[31]等利用TA98菌株應(yīng)用Ames試驗準(zhǔn)確地檢出了四種非遺傳毒致癌物。雖然國內(nèi)國外多個課題組建立了許多NGC的體外測試方法，但只有CTL法被充分驗證，要建立一整套的非遺傳毒檢測方法體系還有很長的路要走。

2.3 致癌性體外檢測方法的最新進(jìn)展

組學(xué)技術(shù)在近二十年蓬勃發(fā)展，組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于毒理學(xué)領(lǐng)域融合成為毒理基因組學(xué)，毒理基因組學(xué)為致癌物篩選開拓了新的思路和方法，發(fā)現(xiàn)了一批致癌相關(guān)生物標(biāo)志，為致癌物暴露早期評估及高危人群保護(hù)提供理論依據(jù)。有研究將9種遺傳毒致癌物和7種非遺傳毒致癌物處理HepG2細(xì)胞，對處理后的細(xì)胞進(jìn)行了cDNA芯片分析，篩選出了一批差異表達(dá)基因，對表達(dá)差異前20位的基因進(jìn)行集合分析，發(fā)現(xiàn)基于不同表達(dá)特征的基因可準(zhǔn)確篩選出遺傳毒致癌物和非遺傳毒致癌物[32]。Kawata[33]等在HepG2細(xì)胞中評估了致癌物砷、鎘、鉻、二甲基亞硝胺、佛波酯、四氯乙烯作用下共同基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)癌基因PTTG1可能是致癌物的分子機制上的關(guān)鍵分子。Li[34]等分析了330個化學(xué)物在HepG2細(xì)胞上的基因表達(dá)譜，集合中包含～6000個基因的表達(dá)水平，采用隨機森林分類法篩選出了基于芳烴受體(AhR)通路的致癌機制。表觀遺傳調(diào)控近年來成為腫瘤研究的熱門，miRNA是表觀遺傳調(diào)控主要方式之一，最新研究發(fā)現(xiàn)miRNA也可以作為致癌物暴露的生物標(biāo)志。例如，用BaP處理人支氣管上皮細(xì)胞后，表達(dá)上調(diào)的有miR-106a、miR-129、miR-494、miR-498、miR-320，表達(dá)下調(diào)的有miR-10a、miR-363、miR-493[35]。但組學(xué)技術(shù)在致癌物篩選中仍有很長的路要走，基于高通量篩選發(fā)現(xiàn)的新生物標(biāo)志和致癌機制尚處于前期研究及驗證階段，這些方法與致癌性之間的關(guān)聯(lián)度有待長期考察。

計算毒理學(xué)借助數(shù)學(xué)模型，根據(jù)化學(xué)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、已知毒理學(xué)測試數(shù)據(jù)和環(huán)境暴露數(shù)據(jù)，實現(xiàn)對未知毒性化學(xué)物的毒性預(yù)測，已成為大批量化合物毒性預(yù)測的首選方法[36]。定量構(gòu)效關(guān)系(Quantitative Structure-activity Relationship，QSAR)模型是計算毒理學(xué)中最常見的模型，市面上已有若干商業(yè)QSAR平臺軟件，包括歐盟開發(fā)的Toxtree，OECD開發(fā)的Toolbox，Accelrys公司開發(fā)的TOPKAT，美國EPA開發(fā)的T.E.S.T.，Lhasa公司開發(fā)Derek等。其中，能預(yù)測致癌性的QSAR平臺是Toxtree，Toolbox，TOPKAT，Derek。Morales[37]等應(yīng)用QSAR模型，預(yù)測了62個硝基化合物的致癌性。Wedebye[38]等應(yīng)用16種QSAR預(yù)測模型預(yù)測了70983種REACH關(guān)注物質(zhì)的遺傳毒致癌性，致突變性和發(fā)育毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6.5%的化學(xué)物具有遺傳毒致癌性，16.3%的化學(xué)物有致突變性，11.5%為發(fā)育毒性物質(zhì)，與已知的毒理測試數(shù)據(jù)類似。美國FDA針對膳食中的潛在致癌風(fēng)險物質(zhì)開發(fā)了計算構(gòu)效關(guān)系模型，以預(yù)測有機成分和天然成分的致癌風(fēng)險，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了19種膳食成分有致癌潛力。此外，這套預(yù)測系統(tǒng)也用于預(yù)測其他化學(xué)物，迄今為止已預(yù)測了超過1200種藥物，工業(yè)化學(xué)品和天然產(chǎn)物，預(yù)測性能表現(xiàn)良好[39]。但計算毒理學(xué)在化學(xué)物致癌性預(yù)測上也面臨困境，以QSAR為代表的預(yù)測方法的基礎(chǔ)是化學(xué)結(jié)構(gòu)，但致癌性是一個相對復(fù)雜的評價終點，致癌物往往作用于多個靶點影響多條分子信號通路，現(xiàn)有的模型構(gòu)建方法識別出致癌物的效能較低。

3 小結(jié)

化學(xué)物致癌性體外檢測的難點主要在于由于致癌機制的復(fù)雜性導(dǎo)致單一試驗手段預(yù)測效能低下，以及海量新化學(xué)品帶來的篩選壓力。將經(jīng)典試驗方法結(jié)合高通量技術(shù)，制定組合檢測策略，采用基于計算毒理學(xué)思想預(yù)測具有特征結(jié)構(gòu)的化學(xué)物毒性或在新致癌機制理論指導(dǎo)下的試驗技術(shù)對化學(xué)物致癌性進(jìn)行預(yù)測和評價將成為可行的解決辦法。目前，大多數(shù)經(jīng)典的遺傳毒體外試驗都可通過結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)、高內(nèi)涵技術(shù)或改變計算指標(biāo)的方法實現(xiàn)自動化和高通量化，部分已被OECD、EPA、FDA等制定為毒性檢測指導(dǎo)原則，但非遺傳毒體外測試仍處于測試和驗證階段，深入研究化學(xué)物的致癌機制將有助于測試方法的開發(fā)。此外，組合檢測策略已經(jīng)成為致癌性體外檢測的主要趨勢，在化妝品、藥品、食品等領(lǐng)域已分別制定了相應(yīng)的檢測規(guī)范。本文梳理了化學(xué)物遺傳毒性和非遺傳毒性的試驗方法，為致癌性檢測和評價提供借鑒思路。