高活性小分子果膠對放射性核素內(nèi)污染的抗放與促排功效評價

李 娟，張 馨，王 雙，冉永紅，趙雅貞，郝玉徽

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系復(fù)合傷研究所，重慶 400038)

貧鈾(depleted uranium,DU)被認為是一種新興的、具有放射性的環(huán)境污染物，其存在于土壤、巖石、地表水、地下水、空氣、植物和動物中，并微量存在于食物和飲用水中，一定程度上影響著人們的健康[1-2]。預(yù)防和治療放射性核素損傷的措施主要包括限制放射性核素從污染部位吸收以及促進其排泄[3]。目前已有研究合成了多種促排劑，并測試了其與DU螯合的適用性，但是其中許多促排劑顯示出較高的毒性[4]。放射性核素促排劑二乙基三胺五乙酸(diethylenetriaminepentacetate,DTPA)的口服制劑被認為是體內(nèi)螯合鈾的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其具有腎毒性、致畸性、胚胎毒性等副作用[4-5]。NaHCO3長期以來都被用于螯合DU，具有較小的腎毒性，在體內(nèi)更穩(wěn)定，并且可以被腎迅速過濾，但NaHCO3的螯合效率低，且酸堿干擾高。由于核素促排等相關(guān)研究較少，新促排劑或螯合劑的研究發(fā)展緩慢，因此，探索安全有效的促排劑勢在必行。有研究發(fā)現(xiàn)，天然植物來源的多糖具有明顯的抗氧化、抗腫瘤、抗癌、抗細菌、抗炎、抗糖尿病和抗肥胖活性作用[6]。低分子柑橘果膠(low-molecular-weight citrus pectin,LCP)是通過規(guī)定的pH值和溫度水解天然果膠(C6H10O7)而得到的分子質(zhì)量較小、酯化度較低的果膠多糖[7-8]。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)LCP可有效抑制胃腸癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移。楊國華等[10]發(fā)現(xiàn)LCP能抑制小鼠結(jié)腸癌的生長、肝轉(zhuǎn)移及血管形成。關(guān)于LCP在醫(yī)學(xué)發(fā)展方面的潛能值得深入研究。因此，本研究將探索LCP對放射性核素內(nèi)污染的抗放與促排功效。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備與制備

昆明小鼠210只，雄性，體質(zhì)量(20±5)g，購于陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心；高活性小分子果膠(生產(chǎn)批號:180810)由浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院和杭州絡(luò)通生物科技有限公司聯(lián)合開發(fā)；過濾細菌后的DU溶液(2 mg/L)由陸軍軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)系提供；NaHCO3(分析純)購于重慶博藝化學(xué)試劑有限公司；總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒(S0109)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；脂類過氧化作用[丙二醛(malondialdehyde，MDA)]檢測試劑盒(MAK085-1KT)購于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；頗爾制水系統(tǒng)購于頗爾(中國)有限公司；MARS微波消解儀系統(tǒng)購于CEM公司；MUA型微量鈾分析儀(編號：050302)購于北京羽綸科技公司核工業(yè)北京地質(zhì)研究院分析測試研究中心；醫(yī)用1 mL注射器，滅菌手術(shù)剪，一次性醫(yī)用滅菌手套、帽子和口罩等耗材購于國潤平臺。實驗方案及流程見圖1。

圖1 實驗方案框架流程

1.2 果膠抗放存活實驗

1.2.1 相同輻照劑量，不同果膠濃度 將60只昆明小鼠隨機分為對照組、25 mg/kg果膠組、50 mg/kg果膠組、250 mg/kg果膠組，每組15只。對照組：前 5 d不做任何處理，5 d后以總劑量5.5 Gy輻照1次，速率為1.2 Gy/min。其余3組前5 d分別腹腔注射500 μL不同濃度(25 mg/kg、50 mg/kg、250 mg/kg)果膠溶液，每天1次；5 d后以總劑量5.5 Gy輻照1次，速率為1.2 Gy/min，輻照后腹腔注射500 μL不同濃度(25 mg/kg、50 mg/kg、250 mg/kg)果膠溶液，每天1次，連續(xù)5 d。每天記錄各組小鼠死亡狀況，直至30 d。

1.2.2 不同輻照劑量，相同果膠濃度 在篩選出有效果膠濃度后，把90只昆明小鼠隨機分為3 Gy對照組、5.5 Gy對照組、8 Gy對照組、3 Gy果膠組、5.5 Gy果膠組、8 Gy果膠組，每組15只。對照組：前5 d不做任何處理，5 d后分別以總劑量3 Gy、5.5 Gy、8 Gy輻照1次，速率均為1.2 Gy/min。果膠組：前5 d腹腔注射500 μL果膠溶液(25 mg/kg)，每天1次；5 d后分別以總劑量3 Gy、5.5 Gy、8 Gy輻照1次，速率均為1.2 Gy/min，輻照后腹腔注射500 μL果膠溶液(25 mg/kg)，每天1次，連續(xù)5 d。每天記錄各組小鼠死亡狀況，直至30 d。

1.3 果膠抗放實驗

將20只昆明小鼠隨機分為對照組、果膠組，每組10只。對照組：前5 d不做任何處理，5 d后以總劑量5.5 Gy輻照1次，速率為1.2 Gy/min。果膠組：前5 d腹腔注射500 μL果膠溶液(25 mg/kg)，每天1次；5 d后以總劑量5.5 Gy輻照，速率為1.2 Gy/min，輻照后腹腔注射500 μL果膠溶液(25 mg/kg)，每天1次，連續(xù)4 d。4 d后檢測小鼠血常規(guī)；取骨髓和腸組織進行病理切片；取肝組織進行SOD、MDA等氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測。

1.4 果膠促排實驗

將40只昆明小鼠隨機分為對照組、DU組、NaHCO3組、果膠組，每組10只。對照組：不做處理。DU組：3 mg/kg DU腹腔注射給藥1次。NaHCO3組：3 mg/kg DU腹腔注射給藥1次；1 h后腹腔注射500 μL 5%的NaHCO3，每天1次，連續(xù)4 d。果膠組：3 mg/kg DU腹腔注射給藥1次；1 h后腹腔注射500 μL果膠(25 mg/kg)，每天1次，連續(xù)4 d。DU染毒4 d后收集小鼠血清，檢測血清腎功能；取腎組織進行病理切片并檢測腎鈾含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 果膠抗放存活率結(jié)果

在探究不同濃度果膠對小鼠存活率的影響時，50 mg/kg果膠組和250 mg/kg果膠組小鼠最終存活率均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；25 mg/kg果膠組小鼠最終存活率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。故后續(xù)研究采用最終存活率較高的25 mg/kg果膠濃度進行實驗，探究此濃度下不同輻照劑量對小鼠存活率的影響，結(jié)果顯示，25 mg/kg果膠濃度下，3 Gy果膠組、5.5 Gy果膠組最終存活率均高于3 Gy對照組、5.5 Gy對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；8 Gy果膠組最終存活率與8 Gy對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。因此，25 mg/kg果膠可提高3 Gy和5.5 Gy輻照小鼠的最終存活率。

*：與對照組比較，P<0.05

*：P<0.05

2.2 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測結(jié)果

體外氧化應(yīng)激檢測結(jié)果顯示，果膠組MDA水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明對照組受自由基攻擊較果膠組嚴(yán)重；果膠組SOD活力高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明果膠組清除氧自由基的能力高于對照組(圖4)。

a:MDA；b:SOD活力 *：與對照組比較，P<0.05

2.3 HE染色結(jié)果

腎組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，對照組腎小管規(guī)則，幾乎沒有炎性細胞浸潤，無纖維化(實質(zhì)化)；果膠組有炎性細胞，存在一定程度纖維化；DU組腎小管不規(guī)則，炎性細胞浸潤較多，纖維化較嚴(yán)重；NaHCO3組有炎性細胞，存在一定程度纖維化(圖5)。

圖5 各組腎組織病理切片HE對比

骨髓切片觀察發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠骨髓有大量紅細胞填充，果膠組紅細胞明顯減少，血管細胞、纖維細胞、骨髓細胞開始再生(圖6)。

圖6 各組骨髓組織病理切片HE對比

腸組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠小腸絨毛短細，排列紊亂，上皮下間隙擴張；果膠組小鼠腸黏膜形態(tài)排列規(guī)則，連續(xù)性完整，無充血及明顯斷裂現(xiàn)象(圖7)。

圖7 各組腸組織病理切片HE染色對比

2.4 血常規(guī)檢測結(jié)果

血常規(guī)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)5.5 Gy輻照后，果膠組單核細胞比例高于對照組，差異具有極顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其余外周各血象與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖8。

#：與對照組比較，P<0.01

2.5 血清腎功能檢測

注射DU后，果膠組和DU組肌酐及尿素含量均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，果膠組肌酐及尿素含量低于DU組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖9。

*：與對照組比較，P<0.05；#：與果膠組比較，P<0.05

2.6 腎鈾含量檢測結(jié)果

注射DU后收集小鼠腎組織，經(jīng)微波消解后檢測其鈾含量，結(jié)果顯示，果膠組腎鈾含量低于DU組和NaHCO3組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明果膠能降低小鼠體內(nèi)腎鈾含量(圖10)。

*：果膠組與其他組比較，P<0.05

3 討論

鈾是一種放射性核素，DU是天然鈾濃縮過程的副產(chǎn)品[11]。DU及其化合物的放射毒性和化學(xué)毒性是引發(fā)肺癌和腎損傷的原因之一，其化學(xué)毒性可引起急性效應(yīng)[12]。DU可通過吸入、食入或皮膚接觸進入人體[4]，在進入人體后其化學(xué)結(jié)構(gòu)會隨溶液的pH值發(fā)生復(fù)雜變化，而且DU可與人體中的各種成分結(jié)合，短時間內(nèi)即可對各個器官造成嚴(yán)重損害[13]。雖然群體暴露于大量DU的可能性很小[12]，但是，由于對核燃料需求的增加，預(yù)計環(huán)境中的DU泄漏量也將增加[4]。臨床可以通過增加DU的消除量或減少其吸收量和分布來減少DU的積累。

螯合劑可治療重金屬中毒，使用螯合劑加速鈾從體內(nèi)排泄的螯合療法是降低鈾毒性的獨特方法[12]。螯合劑已被廣泛用于治療多種金屬的急性和慢性中毒，可溶性螯合劑的使用可減少DU在器官中的沉積并加速其消除，降低毒性[4]。甲基亞氨基二乙酸可以顯著降低DU注射部位的鈾濃度，并顯著加速鈾的排泄。Fukuda等[13]發(fā)現(xiàn)對受DU污染的傷口采用甲基亞氨基二乙酸局部治療可有效減少急性損傷。注射4 mg/kg DU(pH 1)后的120 min內(nèi)使用甲基亞氨基二乙酸，可降低尿液和糞便中的尿鈾含量及腎和骨骼中鈾的濃度。這與我們注射果膠排鈾效果類似。由于螯合劑在生理pH下的溶解度有限，對其形成螯合物的動力學(xué)不利，因此，并非所有的化合物都適合用作治療全身性鈾中毒的螯合劑[12]。天然果膠因溶解度小、腸吸收困難而作用有限[14]，本研究采用修飾過的果膠LCP，克服了天然果膠分子質(zhì)量大、不易消化吸收等問題，溶解度更好，且LCP的直鏈結(jié)構(gòu)具有很強的陽離子結(jié)合能力，靶向性較天然果膠更強[2]。

天然果膠作為一種膳食纖維，有抑制結(jié)腸癌、降血壓、減少腸道有害菌感染和腹瀉、改善動脈粥樣硬化及心臟病等功效[10]。Edirisinghe等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，海洋來源的螺旋藻果膠可促進體外人皮膚成纖維細胞遷移和增殖，且無任何細胞毒性作用；低劑量(50 μg/mL)的螺旋藻果膠可促進斑馬魚截肢尾鰭再生，且沒有任何毒性；螺旋藻果膠(每條600 μg)可使斑馬魚的傷口快速愈合，且無過多瘢痕形成；暴露于螺旋藻果膠的成年斑馬魚可以實現(xiàn)損傷肌肉和腎的快速修復(fù)，與先前針對其他魚類和哺乳動物傷口進行的研究結(jié)果一致。本研究首次從抗輻射、促進放射性物質(zhì)排出方面對果膠進行分析，通過果膠抗放存活實驗發(fā)現(xiàn)，濃度為25 mg/kg的果膠溶液可以明顯降低輻射后小鼠的病死率，且無明顯毒副作用，因此果膠具有成為全身性鈾中毒解毒劑的可能。

在研發(fā)新藥方面，一些研究者通過對天然殼聚糖進行修飾來探索其應(yīng)用價值。Amirian等[16]基于氧化殼聚糖(oxidized chitosan,OC)和酰胺化果膠(amidated pectin,AP)構(gòu)建了原位交聯(lián)的可注射水凝膠。AP-OC水凝膠可以為細胞增殖提供更好的微環(huán)境，因為這兩種帶有氨基的改性天然多糖都可溶于中性溶液。由于其原位交聯(lián)、可調(diào)節(jié)的保水能力、良好的生物降解性以及生物相容性等綜合優(yōu)勢，AP-OC水凝膠在傷口敷料和皮膚組織工程中有良好的前景。張曉菲等[17]在印跡技術(shù)指導(dǎo)下合成了一系列水溶性交聯(lián)殼聚糖衍生物，其中五二醛交聯(lián)羧甲基殼聚糖可減少DU在細胞內(nèi)的積累，這可能是由于五二醛交聯(lián)羧甲基殼聚糖與DU形成的DU-殼聚糖衍生物的沉淀物體積較大而無法進入細胞，由此減少了細胞對DU的吸收，從而發(fā)揮解毒作用。本研究通過向DU小鼠模型注射果膠，發(fā)現(xiàn)果膠對腎、骨髓、小腸均具有保護作用，但是果膠保護機體的機制有待進一步研究。近幾年有研究發(fā)現(xiàn)果膠對輻射后的腸道具有保護作用，Sureban等[18]在研究飲食果膠對致死性全身γ-IR輻射誘導(dǎo)的腸道干細胞缺失、隱窩和總體存活影響的實驗中發(fā)現(xiàn)，果膠可以防止電離輻射引起的潛在儲備腸道干細胞缺失，并促進隱窩再生。也有學(xué)者在微生物降低鈾毒性機制方面展開研究，Agarwal等[19]在高鈾環(huán)境下分離了數(shù)種細菌菌株，從蛋白質(zhì)組學(xué)水平上得到了該細菌生存在高鈾環(huán)境時新陳代謝和應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)數(shù)據(jù)，這些研究可以確定基因蛋白靶標(biāo)，測量并預(yù)測在歷史上受DU污染存活下來的生物自主修復(fù)的信號通路。

綜上所述，本研究初步探索了果膠對核素內(nèi)污染小鼠的防護作用，證實了果膠具有抗輻射與促進DU排出的功效，但是果膠的抗輻射及促排機制仍需要進一步研究。