原發(fā)性肝癌常見動物模型的研究進展

夏 猛， 孫玉浩， 王 萌， 冷 靜

1 廣西中醫(yī)藥大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院， 南寧 530200； 2 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 脾胃二科室， 南寧 530023

動物模型是研究原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)發(fā)病機制及進行藥物篩選研究的重要載體，目前的動物模型主要包括小鼠、大鼠、兔、樹鼩等雄性幼齡動物為主，常用的建模方法包括自發(fā)型、誘發(fā)型、移植型和基因修飾型等[1]。本文通過對文獻搜集梳理綜述了以上模型特點，并進行總結(jié)歸納，以期提供建議參考。

1 常用于構(gòu)建肝癌模型的動物

1.1 小鼠 小鼠與人類在基因水平上高度同源，是復制人類疾病和研究基因功能的常選動物。選用小鼠作為PHC模型的優(yōu)點是：(1)實驗成本低；(2)生存率高，飼養(yǎng)方便；(3)可以形成各種實驗用近交系，遺傳性狀穩(wěn)定，利于實驗重復。常選用誘發(fā)型、移植型、轉(zhuǎn)基因型的造模方法對BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠、KM小鼠進行造模。裸鼠是由BALB/c近交系小鼠基因突變而來，最主要的特點是沒有胸腺，不排斥異種動物的組織，多用移植型造模方法進行造模[2]。

1.2 大鼠 大鼠的基因序列、全基因組與人類相似，抗病力強，對外界環(huán)境的適應力強，存活率高，動物器官、組織也較小鼠大，方便后期實驗標本的觀察與統(tǒng)計[3]。體型適中，可以提供足夠的實驗分析所需要的血液、體液樣本，易于實驗操作。另外大鼠肝臟再生能力強，切除60%～70%的肝葉仍有再生能力，適合肝臟相關(guān)疾病的研究[4]。大鼠自發(fā)型腫瘤的發(fā)生率低[5]，多選用誘發(fā)型的造模方法，如二乙基亞硝胺( diethylnitrosamine，DEN)聯(lián)合CCl4對SD大鼠、Wistar大鼠、F344大鼠等進行肝癌造模[6]。

1.3 兔 兔是目前少有的大型肝癌動物模型，通過移植接種VX2瘤株，誘導肝癌的發(fā)生[7]。新西蘭或日本大白兔是目前常用的兩個兔類品種，主要用于肝外或肝同種移植型的肝癌模型研究。兔的肝癌模型具有：(1)模型成型快，造模方法簡單易操作；(2)造模成功后的腫瘤類型和人類巨塊型肝癌腫瘤類似，可較好的還原人類巨塊型肝癌發(fā)病過程；(3)造模周期短，價格低廉，模型存活率高；(4)兔體型大，可接種的部位廣泛，肝、腎臟等部位都可以接種[8]。然而兔VX2肝癌模型易發(fā)生轉(zhuǎn)移和擴散，對單純研究PHC存在一定的影響。

1.4 樹鼩 樹鼩在生理、生化和解剖學等生物學特性方面與人類有很高的相似性，用樹鼩建立肝癌模型進行肝癌病因和發(fā)病方面的研究，有著其他動物不可代替的優(yōu)勢[9-10]。選用樹鼩作為PHC模型的優(yōu)點為：(1)對肝炎病毒有易感性，可以模擬人類感染HBV后發(fā)展至肝癌的發(fā)病過程，為研究HBV與肝癌發(fā)病的關(guān)系提供了一個很好的實驗模型[11]；(2)進化水平高，新陳代謝和機體解剖比鼠類動物更接近與人[12]。但樹鼩產(chǎn)仔少、膽小、易受驚嚇，在一定程度上影響其推廣[13]。目前造模常用的樹鼩品系為：樹鼩瑤山亞種(Tupaiabelangeritonquinia)、樹鼩滇西亞種(Tupaiabelangerichinensis)。

1.5 土撥鼠 土撥鼠是目前在HBV研究中應用廣泛的模型動物。選用土撥鼠作為PHC模型的優(yōu)點為：(1)土撥鼠肝炎病毒(WHV)與HBV的核苷酸同源性達到60%以上；(2)土撥鼠感染W(wǎng)HV后的免疫反應類型和強度也與人感染HBV高度相似[14]；(3)壽命可達10年之久，在制備慢性HBV感染的動物模型中具有獨特優(yōu)勢。雖然沒有肝硬化和腹水的階段，但對模擬病毒感染、肝癌的后續(xù)發(fā)展以及對病毒和腫瘤的免疫反應都有極高的研究價值，多用于抗病毒藥物的篩選、免疫學研究等[15]。

1.6 斑馬魚 斑馬魚作為PHC模型有以下優(yōu)點：(1)與人類基因高度同源；(2)肝細胞的組成、功能等與人類相似；(3)生長發(fā)育迅速，產(chǎn)卵快，易于大規(guī)模飼養(yǎng)；(4)透明性胚胎，易于觀察腫瘤進展。目前多采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對斑馬魚進行肝癌模型的構(gòu)建[16]，如xmrk/kras或myc基因突變的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型等，多用于候選基因與藥物靶標的篩選工作(表1)。

表1 不同動物的常用造模方法

2 常用動物模型的建模方案

2.1 自發(fā)型肝癌模型 自發(fā)性肝癌模型是指模型動物在人工創(chuàng)造的環(huán)境條件下，沒有經(jīng)過人工處置而自發(fā)性發(fā)作的腫瘤，這種模型最大的優(yōu)點就是排除了人為因素的干擾，較好還原了動物模型在自然條件下的發(fā)病情況[29]。自發(fā)型肝癌模型的發(fā)病時間與動物品系、性別、飼養(yǎng)方式等因素有關(guān)，目前主要用來反映動物的腫瘤易感性、致癌物質(zhì)和環(huán)境因素對肝癌的影響。不過因此類模型的腫瘤發(fā)生率低，即使發(fā)生肝癌，腫瘤(大小、數(shù)目和部位等)和模型動物(性別、體質(zhì)量和腫瘤發(fā)生時間等)都存在很大差異，在臨床病理研究與抗藥研究中數(shù)據(jù)不可控，離散度較大，所以自發(fā)型肝癌模型在現(xiàn)代的動物造模中較少使用。

2.2 誘發(fā)型肝癌動物模型

誘發(fā)型肝癌模型是指使用誘癌因素在實驗條件下誘使動物發(fā)生腫瘤的動物模型。由于這類模型的誘發(fā)因素和條件是人為可控的，誘發(fā)腫瘤的成功率也遠遠高于自然發(fā)病率，所以是建模的常用手段之一[30]。誘發(fā)型肝癌模型有建模周期長、成本低、造模成功率高的特點，常用小鼠、大鼠和樹鼩作為造模對象，能夠能準確反映癌癥生物特性和行為，充分模擬人類腫瘤生長微環(huán)境，是現(xiàn)階段常用的肝癌動物模型[31]。目前常用的誘發(fā)型建模方法主要有以下幾種類型。

2.2.1 DEN誘導 DEN是目前常用的誘癌劑，其主要原理是DEN對肝臟有特定的毒性，使肝細胞大面積壞死，最終誘導PHC的發(fā)生[32]。其致癌有以下特點：(1)操作方便，多采用注射器腹腔注射的形式給藥；(2)誘癌成功率高，小劑量、多次給藥便可誘發(fā)肝癌；(3)對嚙齒類動物誘導肝臟病變具有穩(wěn)定性，可模擬肝損傷-肝炎-肝硬化-肝癌的發(fā)生過程[33]。如Chen等[34]用C57BL/6雄性小鼠[6～10周，(22±2)g]，每周0.014% DEN灌胃6 d，第7天正常飲水間隔1 d，持續(xù)15周，第16周檢測小鼠全部造模成功；Seydi等[35]用DEN聯(lián)合2-乙酰氨基芴的方式對雄性SD大鼠進行肝癌造模，經(jīng)過15周的造模周期，通過組織病理學檢查、肝損傷標志物及AFP等指標證實造模成功。

2.2.2 CCl4誘導 CCl4是一種肝臟的毒性物質(zhì)，其主要原理是通過反復急性肝損傷、炎癥和修復導致纖維化，最終誘導產(chǎn)

生肝癌[36]。運用CCl4造模有以下特點：(1)腹腔注射的濃度與頻率會影響其作用部位及毒性，高濃度的CCl4首先損傷的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其次再累及肝、腎；而低濃度長期注射則主要損傷肝、腎功能[37]；(2)模型穩(wěn)定性高，可重復性好；(3)乙醇可以促進CCl4的吸收，加重中毒癥狀，所以目前大多選用CCl4與DEN 和/或乙醇聯(lián)合使用誘導肝癌發(fā)生，來減少造模周期，提高造模穩(wěn)定性[38-39]，如Brol等[40]在小鼠體內(nèi)用CCl4和乙醇聯(lián)合誘導7周后，肝臟炎癥反應強烈，伴有明顯的肝纖維化和中度脂肪變性。另外停止注射CCl4后模型動物具有自愈性，因此在造模過程中不能間斷CCl4刺激[41]。CCl4揮發(fā)性強，在操作過程中要有必要的安全防護，同時也要注意密封保存，防止揮發(fā)，影響濃度。

2.2.3 其他化學誘導劑誘導 AFB是由曲霉屬真菌產(chǎn)生的一種雙呋喃環(huán)類毒素。AFB有強烈的致癌性，不過因其毒性強，劑量不易控制，對不同鼠類的易感性不同等缺點，現(xiàn)代動物造模中常把AFB飲食作為輔助造模方法使用[42]；硫代乙酰胺(TAA)是一種化學致癌物，TAA進入機體內(nèi)可引起肝細胞壞死和肝纖維化，同時易產(chǎn)生腸源性內(nèi)毒素血癥，使肝臟功能進一步惡化，最終導致肝癌的發(fā)生[43]，如Helmy等[44]用TAA誘導雄性SD大鼠16周，構(gòu)建肝癌大鼠模型；苯巴比妥與二甲氨基偶氮苯作為一種肝臟致癌物，聯(lián)合使用也可以誘發(fā)肝癌，如Pathak等[45]用苯巴比妥聯(lián)合二甲氨基偶氮苯對大鼠進行長期喂食，在第120天時處死大鼠，檢測肝臟組織，發(fā)現(xiàn)大鼠全部發(fā)生肝癌，造模成功率為100%。

2.3 移植型肝癌動物模型

移植型動物肝癌模型是指把腫瘤組織、細胞株移植到實驗動物體內(nèi)的荷瘤動物模型。這類模型造模成功率高，常在裸鼠、小鼠、大鼠與家兔等動物用皮下移植、腹腔移植、原位移植、血液移植、淋巴移植等方式來構(gòu)建模型。此類造模方法根據(jù)瘤株來源分為同種移植與異種移植。

2.3.1 同種移植模型 最早開始使用的移植型動物肝癌模型是同種移植模型，即同一種屬之間瘤株移植種植。因?qū)嶒瀯游锎嬖诮幌?、遠交系之分，即使是同一品系中的不同動物也存在遺傳基因的差異性，因此在構(gòu)建模型時具體分為：(1)自體移植；(2)同種同基因移植(同卵孿生或近交系動物之間的移植)；(3)同種異基因移植(同一物種內(nèi)，遺傳結(jié)構(gòu)不同的個體之間的移植)等3種構(gòu)建方式，免疫排斥反應是造模成功與否的關(guān)鍵，其中前兩種移植方法不發(fā)生免疫排斥反應，另外裸鼠也可以避免免疫排斥的發(fā)生。如Hepa1-6細胞株是從小鼠肝癌細胞中分離得到的，Duan等[46]用Hepa1-6細胞懸液對BALB/C小鼠進行皮下注射的方式進行肝癌造模。

2.3.2 異種移植模型 異種移植肝癌模型是將不同種屬來源的腫瘤細胞株移植到實驗動物上而建立的模型。異種移植肝癌模型也分為以下2種。(1)異位移植: 即把荷瘤生物的腫瘤細胞或組織移植于模型動物的腋窩、背部皮下等部位，這類方法有成瘤時間快、造模周期短、瘤體觀察方便的優(yōu)點，常用于篩選抗癌新藥的優(yōu)點。不過這種方法沒有體現(xiàn)細胞微環(huán)境對肝癌發(fā)生發(fā)展的影響，因此異位模型所獲得的治療結(jié)果可能有偏差。(2)原位移植：即把荷瘤生物的腫瘤細胞或組織移植到動物模型的肝臟上，這類模型的優(yōu)點是可以在體內(nèi)較好的模擬腫瘤生長微環(huán)境，常用于篩選抗癌藥物，易于判斷療效，另外該模型可根據(jù)實驗需要，對不同種類、不同部位進行特定移植，如Xu等[47]用人肝癌細胞株HCC LM3在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建原位肝癌移植模型，并在4周后進行超聲等影像學檢查,發(fā)現(xiàn)小鼠原位腫瘤移植成功率為90%(18/20只)。

2.4 轉(zhuǎn)基因(基因修飾)型肝癌動物模型 轉(zhuǎn)基因型動物模型是指把非自身的誘癌或致癌基因通過生信技術(shù)導入或整合到實驗動物模型的基因染色體中并發(fā)揮功能的一類動物模型，近幾年隨著Crispr-Cas9技術(shù)在生物技術(shù)領(lǐng)域的廣泛應用，大大提高了精確基因組編輯的準確率[48]。用Crispr-Cas9技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因型肝癌動物模型，有肝癌發(fā)病率高，動物模型穩(wěn)定的優(yōu)點，是目前動物模型的研究熱點[49]。

目前常用的主要包括以下幾種：(1)用豬來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因模型，因豬體型大，在解剖、生理、代謝、免疫和遺傳學等方面與人類相似，是發(fā)展大型動物癌癥模型的理想模式，如Gaba等[50]通過Cre重組酶誘導雜合KRASG12D和TP53R167H轉(zhuǎn)基因的表達，形成定點和細胞特異性腫瘤，即Oncopig癌癥模型，此類模型有與人類肝癌相似的細胞周期、AFP的產(chǎn)生、化學敏感性和藥物代謝酶的表達等特點；(2)用小鼠來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因模型，如Hassan等[51]通過將純合金屬硫蛋白/TGFα和白蛋白/c-myc單轉(zhuǎn)基因小鼠在CD13B6CBA背景下雜交獲得c-myc/TGFα雙轉(zhuǎn)基因小鼠，并在后代中挑選雄性小鼠，以飲用水中添加鋅加速肝癌發(fā)生的方式來構(gòu)建肝癌動物模型；FRG小鼠是人源化肝臟研究領(lǐng)域最重要的模型，Stone等[52]Crispr-Cas9技術(shù)編輯腺病毒(AAV)結(jié)合HBV載體(AAV-HBV)，構(gòu)建HBV過表達病毒，通過尾靜脈注射的形式，對FRG小鼠進行肝癌造模。(3)用斑馬魚來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因模型，斑馬魚有體積小、繁殖發(fā)育快、肝臟再生能力強、基因序列與人類基因序列高度相似等特點，在肝癌動物模型的構(gòu)建中經(jīng)常選用[53]，如Chen等[54]以Tg[fabp10∶rtTA2s-M2; TRE2∶EGFP-kras(G12V)]轉(zhuǎn)基因斑馬魚為實驗模型，通過多西環(huán)素喂養(yǎng)引發(fā)肝癌的方式來構(gòu)建肝癌動物模型。

3 小結(jié)

綜上，肝癌動物模型各有特點，不同物種，不同建模方法，可以形成不同病理特點和生物特性，應依據(jù)實際需要選用合適模型，從目前的研究文獻看，轉(zhuǎn)基因型動物模型的開發(fā)與應用在一定程度上模擬了人體肝癌生物學特征，有助于從遺傳基因?qū)用娼忉尭伟┲虏C理，為臨床治療和研究抗癌藥物提供有益方向。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：夏猛、孫玉浩負責論文設(shè)計，撰寫論文；王萌參與搜集數(shù)據(jù)，修改論文；冷靜負責指導撰寫文章并最后定稿。