噻吩并嘧啶衍生物抗胃癌活性的CoMFA模型與分子設(shè)計(jì)

唐自強(qiáng)，馮 惠，馮長(zhǎng)君

(1.徐州工程學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，徐州 221018；2.徐州技師學(xué)院，徐州 221151)

1 引 言

噻吩并嘧啶衍生物是一類具有殺菌、抗過敏、除草、抗驚厥和抗癌等良好生物活性的稠雜環(huán)化合物，具有較好的臨床開發(fā)價(jià)值，特別是其抗癌活性引起了人們的重視并展開了相關(guān)的研究[1].王紅梅等[2]應(yīng)用5，6，7，8-四氫苯并噻吩膦亞胺，經(jīng)氮雜Wittig反應(yīng)合成了不同取代的新型稠合噻吩并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮衍生物，通過體外抗腫瘤活性測(cè)試，顯示這些化合物具有良好的抗腫瘤活性.周新等[3]以1，2，4-三氮唑?yàn)槠鹗荚?，?jīng)Gewald反應(yīng)、Wittig反應(yīng)合成了含氟噻吩并嘧啶酮類衍生物，其抑菌活性測(cè)試結(jié)果表明它們對(duì)棉花枯萎菌、水稻紋枯菌、黃瓜灰霉菌、小麥赤霉菌、蘋果輪紋及棉花炭疽具有較好的抑制作用.近年來研究發(fā)現(xiàn)，吡啶并嘧啶衍生物如吡啶并[4，3-d]嘧啶化合物也是一類具有良好抗腫瘤活性的雜環(huán)化合物，并對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用.這些噻吩并嘧啶、吡啶并嘧啶類雜環(huán)化合物不僅能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的形成、增殖，而且還可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，有望成為新型的抗腫瘤藥物.

基于噻吩并嘧啶、吡啶并嘧啶骨架展現(xiàn)出的優(yōu)異抗腫瘤活性，王勝紅等[4]應(yīng)用氮雜Wittig反應(yīng)合成了25個(gè)嘧啶環(huán)上具有不同取代基的新型四氫苯并[4'，5']噻吩并3'，2'：5，6]吡啶并[4，3-d]嘧啶衍生物，簡(jiǎn)稱“噻吩并嘧啶衍生物”.他們以5-氟尿嘧啶(5-FU)為陽性對(duì)照藥，采用MTT法對(duì)合成的化合物進(jìn)行抗胃癌細(xì)胞(MGC-803)活性評(píng)價(jià).

物質(zhì)構(gòu)效關(guān)系(quantitative structure-activity relationship，QSAR)[5-11]是研究化合物分子結(jié)構(gòu)與生物活性之間因果關(guān)系，揭示其間量變規(guī)律，并利用規(guī)律估算與預(yù)測(cè)活性，以及探討作用機(jī)理等.其在預(yù)測(cè)化合物生物活性方面已成為化學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)境等學(xué)科的一個(gè)重要領(lǐng)域.本文采用比較分子力場(chǎng)分析(comparative molecular field analysis，CoMFA)方法[12-19]研究噻吩并嘧啶衍生物對(duì)胃癌的抑制活性(p M)[4]，以揭示影響它們抗腫瘤活性的微觀結(jié)構(gòu)因素，探討其抑制腫瘤作用的分子機(jī)理.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 數(shù)據(jù)來源

王勝紅等[4]合成的25種噻吩并嘧啶衍生物的分子基本結(jié)構(gòu)見圖1.其中取代基R1、R2為分子中可變部分，具體分子結(jié)構(gòu)見表1.他們測(cè)定抗胃癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度以“IC50”表示，單位為μmol·L-1.考慮化學(xué)反應(yīng)自由能變與平衡濃度為對(duì)數(shù)關(guān)系，故令：

圖1 噻吩并嘧啶衍生物分子的基本結(jié)構(gòu)Fig.1 Basic structure of thienopyrimidine derivative molecules

它們的IC50及p M數(shù)據(jù)見表1.

2.2 建模方法

本文3D-QSAR[17]分析及建立CoMFA模型均使用Tripos公司Sybylx2.1.1分子模擬軟件完成，使用的模塊包括SYBYL、Sketch、Minimize、Database-alignment以及CoMFA的QSAR方法等，各項(xiàng)參數(shù)除特別指明外均采用缺省值.

2.2.1 化合物低能構(gòu)象的確定及分子疊合

分子活性構(gòu)象的確定是建立有效3D-QSAR模型的前提之一.通常采用分子的最低能量構(gòu)象代替藥效活性構(gòu)象.使用Sybylx2.1.1軟件中的Sketch molecule模塊先構(gòu)建25個(gè)噻吩并嘧啶衍生物分子的初始三維結(jié)構(gòu)，再通過Minimize模塊，選取Tripos力場(chǎng)，加Gasteiger-Huckel電荷，將最大迭代次數(shù)(Max.Iterations)定為1000，將Gradient降低到0.005；最后將Powell能量梯度法的收斂梯度設(shè)為0.21kJ·mol-1·nm-1.對(duì)所有分子進(jìn)行分子力學(xué)能量最低優(yōu)化，通過全構(gòu)象搜索得到能量最低構(gòu)象，并以此最低能量構(gòu)象作為分子疊合的生物活性構(gòu)象.

隨機(jī)選取分子3、9、14、17、21為測(cè)試集(Test set；含13號(hào)分子.為表1中帶“*”的分子)，余下20個(gè)分子作為訓(xùn)練集(Training set).選取抗胃癌活性最強(qiáng)的13號(hào)為模板分子，采用公共骨架的疊合方式(即保證所有分子取向的一致性，使分子間相互重疊時(shí)的均方根偏差最小)予以疊合.即以13號(hào)分子中的公共骨架，運(yùn)用Align database模塊分別對(duì)訓(xùn)練集、測(cè)試集進(jìn)行疊合.訓(xùn)練集的疊合圖見圖2(注：測(cè)試集的疊合圖與其非常相似不予列出)：

圖2 訓(xùn)練集的疊合圖Fig.2 3D view of all the aligned molecules in training set

表1 噻吩并嘧啶衍生物分子結(jié)構(gòu)與抗胃癌活性(p M)Table 1 The molecular structures and anti-gastric cancer activity(p M)of thienopyrimidine derivatives

2.2.2 CoMFA模型的建立

采用Tripos標(biāo)準(zhǔn)力場(chǎng)，對(duì)訓(xùn)練集的疊合分子周圍每個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)上的立體場(chǎng)(Steric，St)及靜電場(chǎng)(Electrostatic，El)予以計(jì)算，以偏最小二乘法(Partial least squares，PLS)進(jìn)行建模.采用逐一剔除法(Leave-one-out，LOO)進(jìn)行交叉驗(yàn)證，以獲交叉驗(yàn)證系數(shù)Rcv2和最佳主成分?jǐn)?shù)N.一是以Rcv2衡量模型的預(yù)測(cè)能力，要求Rcv2>0.3的模型，具有95%的可信度[20]，隨機(jī)性小于5%.二是模型中的化合物數(shù)(m)與變量數(shù)(N)之比，即樣變比S v，S v≥5才具有統(tǒng)計(jì)意義，和良好的穩(wěn)健性及較低或然性[21].三是進(jìn)行回歸分析，得到非交叉驗(yàn)證判定系數(shù)R2、統(tǒng)計(jì)方差比F.最后采用View CoMFA模塊，以三維等勢(shì)圖直觀反映立體場(chǎng)和靜電場(chǎng)對(duì)噻吩并嘧啶衍生物p M的貢獻(xiàn).

3 結(jié)果與討論

3.1 CoM FA模型

訓(xùn)練集的CoMFA模型：(1)交叉驗(yàn)證部分：Rcv2=0.397>0.3，N=4，S v=m/N=5，表明模型具有很好的預(yù)測(cè)能力與穩(wěn)健性.(2)非交叉驗(yàn)證部分：R2=0.835>0.8，顯示良好擬合性；R2又稱為削減誤差比例，意為該模型包含影響噻吩并嘧啶衍生物抗胃癌活性83.5%的因素，僅有不足16.5%的屬于未知因素.(3)在95%顯著水平下，F(xiàn)臨界值為：F0.05(4，14)=3.11.該模型的F=18.95，是其臨界值的6倍多，表明模型是密切相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)穩(wěn)定性.因此，該模型具有較低的標(biāo)準(zhǔn)偏差SE，僅為0.333.利用訓(xùn)練集的3D-QSAR模型對(duì)測(cè)試集中分子的p M進(jìn)行預(yù)測(cè)，以檢驗(yàn)其預(yù)測(cè)能力.測(cè)試集的p M預(yù)測(cè)值見表1，與相應(yīng)實(shí)驗(yàn)值基本吻合，其平均誤差只有0.180，表明模型確實(shí)具有良好的預(yù)測(cè)能力.25個(gè)化合物的實(shí)驗(yàn)值與估算值(及預(yù)測(cè)值)的散點(diǎn)圖見圖3，這些散點(diǎn)基本都密集在直線附近，證明該模型具有良好的相關(guān)性及預(yù)測(cè)能力.

圖3 噻吩并嘧啶衍生物抗胃癌活性的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖Fig.3 Plot of the experimental p M vs.calculated p M of thienopyrimidine derivatives

3.2 CoM FA等勢(shì)圖

圖4 給出了以訓(xùn)練集中抗胃癌活性最高的13號(hào)分子為模板建立的CoMFA模型的三維等勢(shì)圖，分子周圍不同顏色的塊狀圖表示噻吩并嘧啶衍生物分子中取代基的立體場(chǎng)和靜電場(chǎng)對(duì)抗胃癌活性的影響.圖4(a)為立體作用等勢(shì)圖，增大取代基體積有利于提高噻吩并嘧啶衍生物抗胃癌活性的區(qū)域以綠色表示，黃色區(qū)域表示減小取代基體積對(duì)抗胃癌活性有利.由立體場(chǎng)的空間分布可知，在2個(gè)苯環(huán)的3、4-位上(較大綠色區(qū)域)引入較大體積的基團(tuán)，有助于提高噻吩并嘧啶衍生物抗胃癌活性.如在R1相同下，4-MeO-Ph、-Ph、n-C3H7的體積依次減小，它們的疏水性降低，透過胃癌細(xì)胞膜難度增大，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)濃度減小，與胃癌靶標(biāo)作用幾率下降，導(dǎo)致p M(實(shí)驗(yàn)值)亦是逐漸降低.

圖4 CoMFA模型的立體場(chǎng)(a)與靜電場(chǎng)(b)等勢(shì)圖Fig.4 CoMFA contour maps(a)steric field；(b)electrostatic field

圖4 (b)為化合物周圍的靜電場(chǎng)分布，增大基團(tuán)正電性有利于抗胃癌活性增強(qiáng)的區(qū)域以藍(lán)色表示，紅色區(qū)域則表示引入帶負(fù)電荷的基團(tuán)對(duì)活性有利.由靜電場(chǎng)的空間分布可知，僅有遠(yuǎn)離苯環(huán)的2、3位之間小塊藍(lán)色區(qū)域，可以忽略其對(duì)抗胃癌活性的影響.而在2個(gè)苯環(huán)的4-位上都被大片紅色區(qū)域覆蓋，說明在這些區(qū)域引入負(fù)電性基團(tuán)，有助于提高噻吩并嘧啶衍生物的抗胃癌活性.因此，在R1相同下，4-F、4-MeO、4-Cl的吸電子能力遞降，它們的p M亦是逐減.例如13、12、14的p M為6.105、5.125、4.295，依次減小.

訓(xùn)練集的3D-QSAR模型給出的立體場(chǎng)和靜電場(chǎng)對(duì)p M的貢獻(xiàn)分別為40.9%和59.1%，顯示取代基的立體作用弱于靜電作用.即在R1(或者R2)相同下，p M的主要取決于R2(或者R1)中苯環(huán)上取代基的吸電子能力.例如4-MeO、4-Cl、4-F的體積是依次減小，而吸電子能力遞增順序?yàn)?-Cl、4-MeO、4-F，因此，它們的p M按此順序漸增.可見，4-F是最大的負(fù)電性基團(tuán)，故其抗胃癌活性最強(qiáng)，此與文獻(xiàn)[4]結(jié)果一致.由于靜電作用一般包含庫侖力、氫鍵及配位，立體作用對(duì)應(yīng)疏水性和空間位阻.因此，抗胃癌活性主要源于取代基與胃癌細(xì)胞內(nèi)生物受體之間的庫侖力、氫鍵及配位，其次是疏水性和空間位阻.尚需指出，13號(hào)分子的R1、R2均為4-F，其p M高達(dá)6.105.比第二強(qiáng)的12號(hào)分子(其R1為4-F，R2為4-MeO)高出0.980.而CoMFA模型給出13、12號(hào)分子預(yù)測(cè)值為5.270、5.099，相差僅為0.171.有理由認(rèn)為此0.980中可能包含均為4-F的強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合的附加效應(yīng)，也可能存在較大的實(shí)驗(yàn)誤差.

3.3 分子設(shè)計(jì)

QSAR研究目的之一是根據(jù)所建模型中隱含的影響生物活性的主要結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行分子設(shè)計(jì).由3.2分析可知，在R1、R2中苯環(huán)的4-位上引入體積較大的負(fù)電性基團(tuán)，有利于增強(qiáng)噻吩并嘧啶衍生物的抗胃癌活性.據(jù)此設(shè)計(jì)4個(gè)化合物(見表1中第26-29號(hào)化合物)，3D-QSAR模型給出較大的p M預(yù)測(cè)值，在5.430-5.844之間，均優(yōu)于13號(hào)分子預(yù)測(cè)值(5.270).這些理論上優(yōu)良的抗胃癌化合物，有待生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)確認(rèn).

4 結(jié) 論

(1)采用比較分子力場(chǎng)方法(CoMFA)建立噻吩并嘧啶衍生物的抗胃癌活性的3D-QSAR模型：Rcv2=0.397，S v=5，R2=0.835，F(xiàn)=18.95，顯示良好的穩(wěn)定性、相關(guān)性和預(yù)測(cè)性.

(2)CoMFA模型三維等勢(shì)圖顯示在R1、R2中苯環(huán)的4-位上引入體積較大的負(fù)電性基團(tuán)，有利于增強(qiáng)噻吩并嘧啶衍生物的抗胃癌活性.據(jù)此設(shè)計(jì)的4個(gè)化合物，具有較大的p M預(yù)測(cè)值，有待生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)確認(rèn).