HPV E6/E7 mRNA陽性而陰道鏡檢查陰性患者中漏診HSIL及以上病變的危險因素分析*

羅燕艷，羅小婉，符麗華，尚雪，林鈺葉

（中山市博愛醫(yī)院 婦科，廣東 中山 528403）

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一。宮頸癌是可以通過早期篩查，盡可能發(fā)現(xiàn)癌前病變而將其阻斷的一種惡性腫瘤。因此，很多研究均致力于如何最大程度漏診宮頸癌前病變。研究表明，高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papilloma virus,HR-HPV）持續(xù)感染宮頸細胞后，以整合形式存在于宿主細胞并大量轉(zhuǎn)錄癌基因E6、E7mRNA 并生成E6、E7 癌蛋白，通過失活p53 和pRb 發(fā)揮作用，使細胞的生長周期失控，從而引起真正的子宮頸癌前病變，如：高度鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial Lesions,HSIL）和子宮頸癌。因此，認為E6、E7 mRNA 表達提示病毒癌基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄表達，可以用于評估子宮頸癌變的風(fēng)險與發(fā)展趨勢［1］。HAEDICKE等［2］發(fā)表的Meta 分析指出HPV E6/E7 mRNA 較HPV DNA 和細胞學(xué)能更有效的篩出宮頸病變≥宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）2 級以上的人群，從而降低過度治療，可考慮在初篩中單獨應(yīng)用。本研究對HPV E6/E7 mRNA初篩陽性患者，進一步進行液基薄層細胞學(xué)檢查（thinprep cytologic test,TCT）、HPV 分型檢測、陰道鏡檢查及病理活檢。對其中466 例陰道鏡檢查陰性患者經(jīng)病理確診為HSIL 及以上的病例進行分析，探討這部分患者漏診HSIL 及以上病變的危險因素，從而最大限度減少漏診HSIL 及以上病例，降低宮頸癌的發(fā)生率。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018 年9 月至2020 年9 月在中山市參加政府宮頸癌篩查的女性，采集的宮頸分泌物統(tǒng)一送至中山市博愛醫(yī)院實驗室檢查，將有完整病歷記錄的HPV E6/E7 mRNA 陽性而陰道鏡檢查陰性的患者共466 例納入研究，年齡35～65 歲，平均（55.50±8.59）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①具有完整HPV E6/E7 mRNA、液基細胞學(xué)，陰道鏡評估，宮頸病理活檢和/或?qū)m頸管搔刮術(shù)結(jié)果；②既往未行宮頸病變治療史；③無其他腫瘤疾病治療史及免疫缺陷者；④排除妊娠狀態(tài)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①子宮切除者；②資料不全者。所有陰道鏡檢查及活檢、宮頸管搔刮術(shù)均獲得患者知情同意，簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 HPV E6/E7 mRNA 方法 所有采集標(biāo)本用Thinprep 細胞保存液瓶保存，統(tǒng)一在中山市博愛醫(yī)院實驗室進行Aptima HPV E6/E7 mRNA PANTHER系統(tǒng)自動檢測平臺進行檢測。按照說明書進行操作。針對14 種高危型HPV 亞型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）進行檢測。結(jié)果分析根據(jù)分析物信號與閾值比（S/CO）進行判讀，分為HR-HPV（+）及HRHPV（-），當(dāng)檢測結(jié)果無效時，需重新檢測；當(dāng)檢測結(jié)果陽性時，行分型檢測，分為HPV16、18/45、其他型別三組。

1.2.2 宮頸液基薄層細胞學(xué)檢測 當(dāng)HPV E6/E7 mRNA 初篩陽性時，將保存液中剩余標(biāo)本使用Thinprep 2000 制片系統(tǒng)制成液基薄層涂片后用95%乙醇固定，巴氏染色。由2 位高年資病理醫(yī)師進行閱片。結(jié)果按國際癌癥協(xié)會推薦TBS 系統(tǒng)（The Bethesda system）（2014）分類標(biāo)準(zhǔn)診斷進行報告，分為：未見上皮內(nèi)病變或惡性病變（no intraepithelial lesions or malignant lesions,NILM）、意義不明的不典型鱗狀細胞（atypical squamous cell of undetermined significance,ASC-US）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesions,LSIL）、HSIL、非典型鱗狀細胞、不除外上皮內(nèi)高度病變（atypical squamous cells-cannot exclude HSIL,ASC-H）、非典型腺上皮細胞（atypical glandular cells,AGC）和鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma,SCC）。

1.2.3 陰道鏡檢查 由婦科陰道鏡室?？漆t(yī)生參照2011 年國際子宮頸病理與陰道鏡聯(lián)盟（IFCPC）的陰道鏡術(shù)語進行陰道鏡圖像的描述和診斷。充分暴露宮頸后，4%醋酸溶液下未見醋白上皮、異常血管等異常圖像，隨后涂抹5%Lugol 碘液不著色，陰道鏡檢查判讀為陰性。

1.2.4 宮頸活檢和/或?qū)m頸管搔刮 對陰道鏡檢查陰性的患者，在陰道鏡下對宮頸進行隨機活檢，活檢點數(shù)為1～4 個。對于Ⅲ型轉(zhuǎn)化區(qū)者加行宮頸管搔刮術(shù)（endocervical curettage,ECC）。

1.2.5 病理結(jié)果 陰道鏡下活檢的宮頸組織制片后采用蘇木素-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining,HE），由病理科醫(yī)生進行閱片，并由1 個高年資病理科醫(yī)生進行復(fù)核，病理結(jié)果分為炎癥、LSIL、HSIL、宮頸癌（包括鱗癌、腺癌）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

通過SPSS 20.0 進行對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗；采用二分類Logistic 回歸分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV E6/E7 mRNA 陽性而陰道鏡檢查陰性的患者中檢出HSIL 及以上病例情況

以病理為金標(biāo)準(zhǔn)，466 例HPV E6/E7 mRNA 陽性而陰道鏡檢查陰性的患者中檢出42 例HSIL，檢出率為9.01%（42/466）；腺癌1 例，檢出率為0.21%（1/466）。

2.2 不同TCT 中檢出HSIL 及以上病例情況

所有HPV E6/E7 mRNA 初篩陽性患者均利用同一份標(biāo)本保存液中剩余的標(biāo)本進行了液基細胞學(xué)檢查（TCT）。結(jié)果NILM、ASC-US、LSIL、ASC-H、HSIL 分別為80.47%、13.95%、4.29%、0.43%、0.86%。以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，隨著TCT異常級別的升高（因ASC-H 例數(shù)少，不計入分析），HSIL 病例的檢出率呈上升趨勢，不同TCT結(jié)果中HSIL 及以上病例的檢出率間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=14.440,P=0.002）。見表1。

表1 不同TCT 中檢出HSIL 及以上病例情況 ［n(%)］

2.3 不同HPV 型別中檢出HSIL 及以上病例情況

HPVE6/E7mRNA 陽性者進一步進行型別檢查，分為16、18/45、其他型別三組，對其病理結(jié)果進行分析，結(jié)果表明，HPV16 型、18/45 型、其他型別中HSIL 及以上病例中檢出率分別為14.89%（14/94）、8.57%（6/70）、7.62%（23/302），雖然HPV16 型中的檢出率最高，但三組在檢測HSIL 及以上病例中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 不同HPV 型別中檢出HSIL 及以上病例情況［n(%)］

2.4 不同年齡階段中檢出HSIL 及以上病例情況

進一步分析年齡是否為影響因素，以5 歲為一年齡階段，結(jié)果表明，隨著年齡的增長，組織學(xué)HSIL 及以上病例的檢出率呈上升趨勢，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.328,P=0.020）。見表3。

表3 不同年齡階段中檢出HSIL 及以上病例情況［n(%)］

2.5 HPV E6/E7 mRNA 陽性而陰道鏡檢查陰性的患者漏診HSIL 及以上病例的危險因素分析

以組織學(xué)HSIL 及以上的病理結(jié)果為因變量，年齡、HPV 型別、TCT 結(jié)果作為自變量，進行二分類Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示只有年齡是HPV E6/E7 mRNA 陽性而陰道鏡檢查陰性的患者漏診HSIL 及以上病例的危險因素。見表4。

表4 HPV E6/E7 mRNA 陽性而陰道鏡檢查陰性的患者漏診HSIL 及以上病例的危險因素分析

3 討論

目前研究表明，當(dāng)HR-HPV 一過性或早期感染時，病毒DNA 在細胞核內(nèi)處于游離狀態(tài)，E6/E7 mRNA 不表達或低表達；當(dāng)HR-HPV 持續(xù)感染時，病毒DNA 與宿主基因整合，E6/E7 被激活，E6/E7 mRNA 高水平表達。因此，E6/E7 mRNA 表達水平的高低與病毒宿主基因整合及感染狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，在HPV 的致病過程中起著關(guān)鍵的樞紐作用。HPV E6/E7 mRNA 在準(zhǔn)確性和相關(guān)性方面比HPV DNA 和細胞學(xué)對病變的指示性更好，顯示了宮頸癌新的篩查前景，有望成為宮頸癌初篩的首選［1］。

對于HPV E6/E7 mRNA 初篩陽性患者下一步應(yīng)該如何評估呢？細胞學(xué)、陰道鏡檢查都是臨床常用的方法。本研究466 例HPV E6/E7 mRNA 初篩陽性患者中，細胞學(xué)HSIL 只有4 例，占0.86%。而細胞學(xué)正常者達375 例，占80.47%，而且在細胞學(xué)正常的HPV E6/E7 mRNA 初篩陽性患者中檢出病理組織學(xué)為HSIL 病例29 例，檢出率7.73%?？梢姡瑢τ贖PV E6/E7 mRNA 初篩陽性患者單純依靠細胞學(xué)分流可能會漏診HSIL 以上病例。雖然陰道鏡檢查可以作為進一步評估是否存在宮頸病變的方法，但只有當(dāng)陰道鏡下轉(zhuǎn)化區(qū)及病變區(qū)域完全可見，才能視為陰道鏡檢查充分，漏診浸潤癌的風(fēng)險才可能降低。因此存在局限性［3］。SONG 等［4］研究發(fā)現(xiàn)，在陰道鏡檢查陰性的細胞學(xué)LSIL、HPV 陽性患者中，隨機活檢檢出HSIL 及以上病例占12.5%。S?RBYE 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，陰道鏡活檢陰性或低度病變的520 例女性在2005～2009 年隨訪期間有124 例（23.8%）發(fā)生CIN2+病變。劉麗等［6］研究發(fā)現(xiàn)，E6/E7 mRNA 表達陽性的女性，即使陰道鏡檢查結(jié)果為陰性，1 年后隨訪發(fā)現(xiàn)，E6/E7 mRNA 陽性者CINⅡ+（包括CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌）發(fā)生率為11.01%（12/109）。本研究在466 例陰道鏡檢查陰性的HPV E6/E7 mRNA 初篩陽性患者中檢出42 例組織學(xué)HSIL，檢出率為9.01%（42/466）；腺癌1 例，檢出率為0.21%（1/466）。因此，若以HPV E6/E7 mRNA 作為宮頸癌的初篩，對于陽性結(jié)果必須高度重視，即使細胞學(xué)、陰道鏡評估均為陰性，仍有一定比率漏診HSIL 甚至是宮頸癌。那么，有哪些是漏診的危險因素呢？

在關(guān)于HR-HPV 亞型感染與子宮頸癌及其癌前病變關(guān)系的研究上，不少研究發(fā)現(xiàn)不同亞型HPV 的致病能力不同。2014 年4 月，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)了HPV 分型檢測可以作為子宮頸癌的初篩手段應(yīng)用于臨床工作中。馬莉等［7］研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV 分型檢測在子宮頸癌及其癌前病變的篩查中具有指導(dǎo)意義，HPV16、52 和58 型感染者發(fā)生≥CINⅡ病變的可能性大，HPV18 型雖不是主要HPV 感染亞型，但其與≥子宮頸腺上皮內(nèi)瘤變（CGIN）Ⅱ病變密切相關(guān)。王家建等［8］的研究表明，基于HPV E6、E7 mRNA檢測的方法的Aptima HPV 檢測陽性特別是16 型和HPV 18 型和（或）45 型陽性的婦女發(fā)生組織學(xué)診斷≥HSIL 病變的可能性大。本研究中，HPV16型、18/45 型、其他型別中組織學(xué)HSIL 及以上病例中檢出率分別為14.89%（14/94）、8.57%（6/70）、7.62%（23/302），雖然HPV16 型中的檢出率最高，但三組在檢出HSIL 及以上病例中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，Logistic 回歸分析也未能顯示HPV 型別是陰道鏡檢查陰性的HPV E6/E7 mRNA 陽性患者漏診HSIL 及以上病例的危險因素。分析其原因，可能是E6/E7 mRNA 意味著HPV 病毒DNA 與宿主基因已經(jīng)發(fā)生了整合，因此與型別關(guān)系不大有關(guān)系。但具體原因及是否是漏診HSIL 的高危因素仍需要進一步深入研究。

在關(guān)于年齡的因素研究中，PRUSKI 等［9］研究表明，在50 歲以下的患者中，HR-HPV E6/E7 mRNA 檢測敏感度和特異性隨著年齡的增加而增加。聶小倩等［10］的研究表明，高年齡組HPV E6/E7 mRNA 陽性率高于低年齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這提示在不同年齡段，高危型HPV E6/E7 mRNA檢測可能有不同的臨床診斷價值［11］。曹倩文等［3］對絕經(jīng)后子宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變診治方式的探討發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)組陰道鏡下子宮頸活檢漏診子宮頸癌的比例高于未絕經(jīng)組（分別為9.4% 和3.8%）。本研究中，在陰道鏡檢查陰性的所有年齡組中，均發(fā)現(xiàn)漏診HSIL 及以上的病例。而且隨著年齡的增加，組織學(xué)HSIL 及以上病例的檢出率呈上升趨勢，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.328,P=0.020）。Logistic 回歸分析也顯示年齡是HPV E6/E7 mRNA 陽性而陰道鏡檢查陰性的患者漏診HSIL 及以上病例的危險因素［O^R：1.070,95%CI：1.027～1.114（P<0.05）］。分析其原因，可能是年齡越大的女性，尤其是絕經(jīng)后女性，雌激素水平下降，宮頸上皮變薄，鱗柱交界向頸管內(nèi)移，陰道鏡下常常表現(xiàn)為Ⅲ型轉(zhuǎn)化區(qū)，很難發(fā)現(xiàn)一些微小病灶，而出現(xiàn)漏診。因此對于年齡越大的女性，尤其是絕經(jīng)后女性，如果HPV E6/E7 mRNA 初篩陽性，即使陰道鏡檢查陰性，除了要參考TCT 結(jié)果外，也可以考慮進行常規(guī)活檢，必要時行ECC，以免遺漏HSIL 及以上病例。

綜上所述，對于HPV E6/E7 mRNA 陽性的女性，如果陰道鏡檢查陰性，需要參考TCT 結(jié)果并結(jié)合年齡因素的影響，必要時行宮頸活檢和/或ECC，以免遺漏HSIL 及以上病例。