高選擇性MRM3液質聯(lián)用技術檢測復雜動物性食品中β-受體激動劑殘留

孫 雷，葉 妮，王亦琳，尹 暉，翟南南，王鶴佳*，徐士新

(1. 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2. Sciex公司，北京 100016)

克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇等β-受體激動劑是一類化學合成的苯乙醇胺類物質，人們食用了這些藥物殘留的動物性食品后會出現(xiàn)面色潮紅、頭痛、頭暈、胸悶、心悸、四肢麻木等不良反應癥狀，嚴重的可能危及生命。因此，包括我國在內的很多國家先后立法禁止該類藥物的使用。

目前，β-受體激動劑殘留檢測方法主要有氣相色譜-質譜法[1-4]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[5-12]以及免疫分析法[13-14]等。與其他方法相比，液相色譜-串聯(lián)質譜法不用衍生化反應，可以有效的降低干擾，大幅度的提高選擇性，從而為檢測方法提供了極低的基線、極優(yōu)的定量限和良好的線性。但像豬肝臟等基質復雜動物性食品，當藥物含量較低時，使用串聯(lián)質譜技術傳統(tǒng)的MRM采集模式有時并不能消除來自本底噪音或者其它物質的干擾，就會導致較高的基線、較差的定量限和重現(xiàn)性，檢測結果存在假陽性或假陰性的風險。在這種情況下，增加一級質譜即第三級質譜(MS/MS/MS，或MS3)，采用MRM3采集模式，可以更有效的消除基質干擾，降低本底基線，進一步提高方法的選擇性，為檢測工作提供更準確可靠的技術支持。

基于高選擇性的MRM3液質聯(lián)用技術建立豬肝臟等復雜動物性食品中克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇殘留檢測的新方法，使方法穩(wěn)定性好，選擇性強，靈敏度高，為提高β-受體激動劑類藥物的殘留監(jiān)控能力，保障動物性食品質量安全提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器 液相色譜-三重四極桿/線性離子阱復合質譜儀(Qtrap 6500，美國SCIEX公司)；漩渦混合器(SIR4，廣州IKA公司)；電熱恒溫振蕩水槽(DKZ-2型，上海精宏實驗設備公司)； pH計(Delta 320，Mettler Toledo儀器(上海)有限公司)；高速冷凍離心機(Biofuge Strators，德國賀利氏公司)；氮吹儀(Organomation Associates，美國Jnc公司)；超純水機(Milli-Q，美國Millipore公司)。

1.2 材料、藥品與試劑 克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇(純度均大于98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；乙酸乙酯、叔丁基甲醚和甲酸(色譜純，美國Fisher公司)；MCX固相萃取柱(60 mg/3 mL，美國 Waters公司)；微孔濾膜(0.22 μm，美國Pall公司)；所用水為超純水。

1.3 標準溶液的配制 精密稱定適量的克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇標準品，用甲醇溶解并配制成濃度為1 mg/mL的標準儲備液，于-20 ℃下保存。準確吸取0.1 mL克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇標準儲備液至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得10 μg/mL的標準工作液，于-20 ℃下保存。

1.4 色譜條件 色譜柱：Phenomenex F5(50 mm×3.0 mm，2.6 μm)；柱溫：30 ℃；流動相A：0.1%甲酸溶液；流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液；進樣量：5 μL；流速：0.5 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.5 min保持5%B；0.5～5 min，5%B線性變化到60%B，5～6 min，保持95%B，6～7.5 min保持5%B。

1.5 質譜條件 離子源：電噴霧離子源正離子模式；掃描方式：三級質譜多反應監(jiān)測(MRM3)模式；離子化電壓(IS)：5500V；源溫(TEM)：550 ℃；氣簾氣(CUR)：30 psi；碰撞氣(CAD)：Medium；霧化氣(GS1)：50 psi；輔助氣(GS2)：60 psi。MRM3監(jiān)測離子對及質譜參數(shù)見表1。

表1 克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇MRM3監(jiān)測 離子對、去簇電壓、碰撞能量和激發(fā)能量Tab 1 Monitoring ion pairs, declustering potentials (DP)、collison energies(CE) and excitation energy(AF2) of clenbuterol、ractopamine and salbutamol

1.6 樣品處理方法 準確稱取2(±0.02)g待測樣品于50 mL離心管內，加入0.2 mol/L乙酸銨緩沖溶液(pH=5.2)8 mL，再加入β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶40 μL，渦旋混勻，37 ℃下避光水浴振蕩16 h。酶解后放置至室溫，渦旋混勻，10 000 r/min離心10 min，傾出上清液于另一50 mL離心管內，用10 mol/L NaOH溶液調pH至10±0.5。加入乙酸乙酯15 mL，中速振蕩10 min，5 000 r/min離心5 min，取上層有機相至另一50 mL離心管內。下層水相中再加入叔丁基甲醚10 mL，中速振蕩10 min，5 000 r/min離心5 min，取上層有機相，合并于乙酸乙酯萃取液中，50 ℃下氮氣吹干，用2%甲酸溶液5 mL溶解，備用。MCX固相萃取柱依次用甲醇、2%甲酸水溶液各3 mL活化，取備用液全部過柱，依次用2%甲酸水溶液、甲醇各3 mL淋洗，抽干，用5%氨化甲醇溶液3 mL洗脫。洗脫液50 ℃下氮氣吹干，殘余物中加入10%甲醇溶液(含0.1%甲酸)0.5 mL，充分溶解，過0.22 μm濾膜后供上機測定，采用基質添加標準溶液外標法定量。

2 結果與分析

2.1 三級質譜MRM3采集離子對結果 使用50%甲醇溶液作為溶劑，配制100 ng/mL的克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇標準溶液，采用針泵恒流進樣的方式，進行質譜參數(shù)優(yōu)化。在正離子全掃描模式下先進行一級質譜掃描(MS1)獲得母離子信息。然后，設定一定的碰撞能量，進行二級質譜子離子掃描(MS2)，獲得一個二級子離子信息。最后，設定一定的激發(fā)能量，進行三級離子阱質譜孫離子掃描(MS3)，獲得兩個三級孫離子信息。最終選定的離子對分別為克侖特羅277.0>203.0>132.1和277.0>203.0>168.0、萊克多巴胺302.1>284.1>121.1和302.1>284.1>164.2、沙丁胺醇240.3>222.2>148.1和240.3>222.2>166.1。根據(jù)歐盟2002/657/EC規(guī)定的一個母離子1個IP，一個子離子及一個孫離子各1.5個IP，可以得出每種藥物各5.5個IP，遠超過規(guī)定的禁用藥物4個IP要求，很好的滿足了法規(guī)對于禁用藥物的規(guī)定。三種藥物的MRM3典型質譜圖見圖1。

圖1 克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的MRM3質譜圖Fig 1 MRM3 mass spectrum of clenbuterol、ractopamine and salbutamol

2.2 方法學考察

2.2.1 方法線性 添加適量克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇混合標準工作液于空白豬肝臟組織中，制得濃度為0.5、1、2、5、10 μg/kg的系列基質添加樣品，經前處理后依次上機測定。以基質添加標準溶液濃度為橫坐標，各藥物定量離子質量色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線(表2)。可以看出三種藥物在0.5～10 μg/kg的系列濃度范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)(R2)均大于0.99。

2.2.2 方法靈敏度和精確度 采用空白添加目標化合物的方法，依據(jù)特征離子質量色譜峰信噪比S/N>10為方法定量限，得出三種藥物在豬肝臟組織中的定量限均為0.5 μg/kg。0.5 μg/kg空白豬肝臟添加樣品，經前處理后獲得的克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇三級質譜特征離子質量色譜圖見圖2。

圖2 克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇三級質譜特征離子質量色譜圖Fig 2 MRM3 chromatograms of clenbuterol、ractopamine and salbutamol

添加0.5、2和10 μg/kg三個濃度水平的藥物，進行方法回收率和精密度考察，結果發(fā)現(xiàn)克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的回收率范圍在89.7%-102.1%，批內批間RSD均小于20%(表3)。

表2 三種藥物標準曲線及相關系數(shù)Tab 2 Calibration curves and correlation coefficients of three drugs in pig liver

3 討論與結論

3.1 樣品前處理方法 β-受體激動劑在動物體內代謝過程中，在葡萄糖醛酸轉移酶、硫酸酯等作用下發(fā)生各種軛合反應，生成各種軛合物長期存在，因此在樣品提取前要進行酶解，使其結合態(tài)的待測物解離釋放出來。有關酶解的方法、酶的品種、酶用量、酶解時間均有人做過研究，本方法直接參考了這些研究報道[5,10-11]。為了提取酸性水溶液中成鹽的β-受體激動劑，先用氫氧化鈉溶液調pH至堿性，使藥物呈游離狀態(tài)，然后為兼顧不同性質的β-受體激動劑，本方法參考已有文獻，選擇了疏水性的乙酸乙酯和叔丁基甲醚從水相中萃取藥物的方法[5]。豬肝樣品中含有大量的復雜基質，嚴重干擾殘留測定，本方法參考已有報道，選用混合型陽離子交換固相萃取柱(MCX)作為凈化柱，起到了較好的凈化效果[8-12]。

表3 空白豬肝臟中三種藥物添加回收率實驗結果(n=5)Tab 3 Average recoveries and precisions(RSD) of three drugs in spiked blank pig liver (n=5)

3.2 三級質譜MRM3模式檢測的優(yōu)點 在日常檢測過程中，對于豬肝臟等基質復雜動物性食品，當檢測β-受體激動劑等禁用藥物在含量較低的情況下，有時會出現(xiàn)色譜峰的干擾，給方法的準確定性定量帶來困擾，采用三級質譜的MRM3模式可以有效的去除本底或基質帶來的干擾，使目標化合物的測定具有更高的選擇性。例如，對豬肝臟空白樣品采用傳統(tǒng)的MRM模式檢測時，有時會發(fā)現(xiàn)有共流出物質干擾目標物克侖特羅的測定(圖3左)，從而造成假陽性結果，在使用MRM3模式后，因為三級質譜MRM3的高選擇性，完全消除了空白樣品中共流出物的干擾，得到毫無干擾的空白樣品色譜圖(圖3中)及空白添加樣品色譜圖(圖3右)。

圖3 空白豬肝臟MRM和MRM3色譜圖及空白添加樣品MRM3色譜圖Fig 3 MRM and MRM3 chromatograms of blank pig liver and MRM3 chromatograms of blank pig liver spiked

研究建立了高選擇性MRM3液質聯(lián)用技術檢測豬肝臟等復雜動物性食品中克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇殘留檢測的新方法。該方法采用三級質譜MRM3模式通過對母離子、子離子和孫離子三級離子的監(jiān)測，使方法的選擇性更強，靈敏度更高，回收率和精密度等技術參數(shù)都能滿足獸藥殘留分析方法的要求，為進一步提高β-受體激動劑類藥物的殘留監(jiān)控能力，保障動物性食品質量安全提供了技術支持。