lncRNA H19通過MACC1/MET/EGFR途徑逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的研究

王 林，易基群，李 理，江高峰

1.廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州紅十字會(huì)醫(yī)院腫瘤科，廣東 廣州 510220； 2.武漢科技大學(xué)天佑醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心

胰腺癌是消化道惡性腫瘤，被稱為“癌中之王”，一般出現(xiàn)癥狀時(shí)已屬晚期并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。因此，對(duì)胰腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入探索將有助于開發(fā)更多的治療策略。

人類基因組中具有組編碼蛋白質(zhì)功能的基因不足2%，大部分基因組則不表達(dá)蛋白質(zhì)，其被稱為非編碼RNA。其中長度超過200個(gè)堿基的非編碼RNA被稱為長鏈非編碼RNA(lncRNA)[2]。近年來研究表明，lncRNA參與調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡、分化等生物學(xué)進(jìn)程，其異常表達(dá)與臨床許多疾病尤其是腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3-4]。lncRNA H19作為一個(gè)典型的lncRNA，研究發(fā)現(xiàn)，其在多種腫瘤中表達(dá)異常，而且在不同腫瘤類型和細(xì)胞背景中，lncRNA H19發(fā)揮的作用也不盡相同，發(fā)揮致癌或抑癌的不同生物學(xué)功能[5-8]。lncRNA H19參與調(diào)控染色體重構(gòu)、DNA甲基化，也可作為miRNA前體并對(duì)組蛋白進(jìn)行修飾，繼而參與蛋白翻譯水平調(diào)控，同時(shí)影響多種基因的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。但到目前為止，lncRNA H19在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中的作用仍然不完全為人所知。

結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1)最初被發(fā)現(xiàn)是結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因[9]，是HGF/c-Met信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞生長、侵襲、遷移等過程中發(fā)揮重要作用。隨后越來越多的研究表明，MACC1不僅與結(jié)腸癌，而且與多種腫瘤如肺癌、胃癌、肝癌以及胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10-11]。那么它參與胰腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制、是否與H19調(diào)控有關(guān)現(xiàn)仍未完全闡明。為進(jìn)一步探討H19在胰腺癌轉(zhuǎn)移中的作用，本研究通過穩(wěn)定敲低H19胰腺癌細(xì)胞株，觀察胰腺癌細(xì)胞侵襲、遷移、MACC1變化以及下游細(xì)胞信號(hào)通路變化，以期為胰腺癌治療提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)于含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清(10099141C GIBCO)的RPMI-1640培養(yǎng)基(C11875500BT、GIBCO、Scotland、UK)中，在37 ℃和體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 RNA分離與qRT-PCR將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心重懸后按RiboPureTMRNA純化試劑盒(AM1924，Invitrogen)說明提取總RNA。采用一步法qRT-PCR測定H19的表達(dá)，引物設(shè)計(jì)如下：H19-Fwd：5′-ATCGGTGCCTCAGCGTTCGG-3′；H19-Rev：5′-CTGTCCTCGCCGTCACACCG-3′；MACC1-Fwd：5′-GGCATTGTCCTGGTGTGGT-3′；MACC1-Rev：5′-CACTCCTTCACCCCTGCTATCT-3′；根據(jù)GoTaq?1-Step qRT-PCR System(A6020，Promega)試劑盒說明書配置反應(yīng)體系，qRT-PCR反應(yīng)條件：反轉(zhuǎn)錄45 ℃ 10 min；預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 10 s；退火60 ℃ 45 s；溶解曲線分析按照說明書進(jìn)行，共30個(gè)循環(huán)。進(jìn)行相對(duì)定量分析，ΔCt=Ct(目的)-Ct(內(nèi)參)，ΔCt=ΔCt(研究樣本)-ΔCt(對(duì)照樣本)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 H19 shRNA慢病毒的構(gòu)建將含有GFP報(bào)告基因的慢病毒載體LV-008(Forevergen Bio-sciences，China)用于表達(dá)靶向H19(5′-CCAACATCAAAGACACCAT-3′)和干擾對(duì)照(5′-TGGTTTACATGTCGACTAA-3′)序列的shRNA。用包裝載體將LV-008-shH19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK 293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后72 h收集含有感染慢病毒的上清液，并通過在Beckman Coulter SW40轉(zhuǎn)子(Fullerton,CA,USA)中以100 000g超速離心2 h來濃縮慢病毒，并重懸于PBS中。然后將PANC-1細(xì)胞接種在24孔板中，并在5～10 μg/ml Polybrene存在下用慢病毒感染，后用2 μg/ml嘌呤霉素篩選H19敲低細(xì)胞10～15 d。

1.4 MACC1 RNAi的構(gòu)建為了敲低MACC1在細(xì)胞中的表達(dá)，合成了19 bp siRNA(正義：5′-CACCAUAGCUUGCAAAGUA-dTdT-3′，反義：5′-UACUUUGCAAGCUAUGGUG-dTdT-3′,來自Ribo公司)。對(duì)于siMACC1轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染前12 h將6×105個(gè)細(xì)胞接種到6孔板中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序使用Lipofectin 2000(11668-27，Invitrogen，USA)進(jìn)行siMACC1轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞遷移和侵襲測定使用在12孔板中的8 μm孔透射室進(jìn)行Transwell遷移測定。無血清RPMI-1640處理過夜后，將細(xì)胞懸浮液(1×105個(gè)細(xì)胞/ml，100 μl)接種到上層中，在下層內(nèi)RPMI 1640培養(yǎng)基，再培養(yǎng)12 h后，4%多聚甲醛的PBS溶液，并用Giemsa染色。最后，在光學(xué)顯微鏡(200倍)下計(jì)算遷移至下室的細(xì)胞。細(xì)胞侵襲測定與細(xì)胞遷移相似。Transwell膜預(yù)涂有50 μg/μl Matrigel?(BD Biosciences，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，USA)，然后將細(xì)胞懸浮液接種到上室中，并將細(xì)胞再培養(yǎng)48 h，以與細(xì)胞遷移測定相同的方式計(jì)數(shù)遷移至下層細(xì)胞。

1.6 Western blotting分析將各處理組細(xì)胞重新懸浮并在裂解液(50 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl、1% NP-40和0.5%脫氧膽酸鹽，1 mmol/L苯甲基磺?；鵸oride)中裂解20 min，4 ℃。然后通過10% SDS-PAGE凝膠電泳，并轉(zhuǎn)到聚二氟乙烯(PVDF)膜上。將此膜在含有5%(W/V)脫脂奶粉的TBST(0.05%吐溫20)封閉1 h，并與第一抗體(1∶1 000)一起孵育2 h，然后洗滌3 h。用TBST洗滌10 min，然后與二抗(1∶5 000，NA934-100UL，Amer-sham Pharmacia Biotech)孵育1 h，TBST洗滌3次，通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL；Amersham Pharmacia Biotech)觀察。使用以下抗體：抗MACC1，KLF4以及抗VEGF(ab226803、ab215036、ab32152、abcam)，GAPDH購自Santa Cruz Biotechnology(sc-47724)。結(jié)果進(jìn)行半定量分析以分析蛋白質(zhì)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建穩(wěn)定的H19敲低PANC-1細(xì)胞為了探索lncRNA H19與胰腺癌細(xì)胞侵襲、遷移之間的關(guān)系，通過使用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)建立了穩(wěn)定的H19敲低PANC-1細(xì)胞系。篩選H19敲低細(xì)胞并通過qRT-PCR評(píng)估敲低效應(yīng)。如圖1所示，與Scramble細(xì)胞相比，PANC1-shRFC3細(xì)胞中H19 mRNA減少約50%(P<0.01)。

注：**P<0.05。

2.2 敲除H19增加了胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲在建立H19敲低PANC-1細(xì)胞系后，我們進(jìn)行Transwell遷移實(shí)驗(yàn)以檢測敲除H19后PANC-1細(xì)胞的遷移活性(見圖2A)。測量shH19-PANC1遷移細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果顯示H19的敲低增加了遷移細(xì)胞數(shù)量。此外，繼續(xù)對(duì)細(xì)胞侵襲進(jìn)行研究，如圖2B所示，與對(duì)照組相比，當(dāng)H19被敲低時(shí)，遷移細(xì)胞的數(shù)量顯著增加至約2倍?？傊?，這些結(jié)果表明，H19在胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起抑制作用。

注：**P<0.05，***P<0.001。

2.3 敲除H19導(dǎo)致MACC1上調(diào)為了進(jìn)一步揭示H19調(diào)節(jié)PANC-1細(xì)胞侵襲的機(jī)制，我們通過qRT-PCR和Western blotting分析shH19-PANC1細(xì)胞中MACC1的表達(dá)。結(jié)果表明，shH19-PANC1細(xì)胞中的MACC1 mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯上調(diào)(見圖3)。

注：***P<0.01。

2.4 敲低MACC1下調(diào)胰腺癌細(xì)胞的遷移能力為了探索敲低H19增加PANC-1細(xì)胞遷移能力上調(diào)是否與上調(diào)MACC1有關(guān)，我們進(jìn)一步在shH19-PANC1細(xì)胞中敲低MACC1(見圖4A)，并且進(jìn)行Transwell測定(見圖4B)，結(jié)果顯示，敲低MACC1可以明顯抑制shH19-PANC1細(xì)胞的遷移能力。

2.5 敲除H19導(dǎo)致MACC1下游信號(hào)蛋白的上調(diào)研究[12]表明，MACC1激活HGF/c-Met信號(hào)可以與EGFR協(xié)同刺激下游基因，因此，我們分析這些蛋白的表達(dá)。

如圖5所示，HGF/c-Met以及EGFR均在shH19-PANC1細(xì)胞中上調(diào)。更重要的是，H19敲低后，磷酸化c-Met(p-cMet)的刺激作用明顯高于未磷酸化c-Met，這表明H19的敲低不僅增加了c-Met的表達(dá)水平，而且刺激了其磷酸化水平。總之，這些結(jié)果表明，H19的敲低誘導(dǎo)MACC1的上調(diào)，導(dǎo)致下游信號(hào)蛋白的刺激和活化。

注：A：MACC1 mRNA表達(dá)情況,**P<0.05； B： PANC-1細(xì)胞的遷移能力。

圖5 敲除H19上調(diào)HGF、EGFR、c-Met和p-cMet的表達(dá)

3 討論

胰腺癌轉(zhuǎn)移是其治療失敗主要原因，如更好地了解胰腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更有效的治療策略。lncRNA既可作為抑癌基因，亦可作為參與腫瘤發(fā)生的癌基因[13]。lncRNA H19在腫瘤發(fā)展中起重要作用，但其在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中的作用仍不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)lncRNA H19的敲低顯著增加了胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，lncRNA H19的敲低誘導(dǎo)MACC1的上調(diào)，并隨后刺激HGF/c-Met以及EGFR信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活。

MACC1與c-Met的啟動(dòng)子結(jié)合以刺激其轉(zhuǎn)錄，隨后導(dǎo)致HGF/c-Met信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活[14]。在腫瘤細(xì)胞中，c-Met激活觸發(fā)了一系列參與細(xì)胞增殖和侵襲的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)[15]，我們的實(shí)驗(yàn)也證明MACC1的敲除顯著降低了腫瘤的遷移和侵襲。先前的研究表明，HGF/c-Met的過度表達(dá)表明腫瘤侵襲的增加和癌癥患者預(yù)后不良的跡象[16]。MACC1上的lncRNA H19部分是由于H19編碼的miRNA靶向MACC1基因或其上游基因。我們結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19的敲低導(dǎo)致MACC1的上調(diào)，增加MACC1可能會(huì)刺激HGF。因此，HGF結(jié)合誘導(dǎo)c-Met受體同源二聚化和磷酸化，并且最終導(dǎo)致HGF/c-Met信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活。

現(xiàn)已在多種腫瘤細(xì)胞中已經(jīng)證實(shí)了c-Met和EGFR之間的相互作用[17]?；罨腸-Met可正向調(diào)節(jié)表皮生長因子受體(EGFR)，激活后的EGFR進(jìn)一步刺激激活下游信號(hào)蛋白。我們也發(fā)現(xiàn)當(dāng)lncRNA H19被敲除時(shí)，EGFR的表達(dá)水平被上調(diào)，增加的HGF/c-Met信號(hào)傳導(dǎo)與EGFR信號(hào)傳導(dǎo)協(xié)同作用，刺激下游信號(hào)通路的激活以及腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的增加[18-19]。

總之，我們研究證實(shí)lncRNA H19的敲低增加了胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。進(jìn)一步研究表明，lncRNA H19的敲低誘導(dǎo)了MACC1的上調(diào)，并隨后刺激了HGF/c-Met以及EGFR信號(hào)通路的激活。這些結(jié)果表明lncRNA H19可能在胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，有可能為胰腺癌轉(zhuǎn)移的臨床診治提供新的思路。但本研究僅觀察敲低H19對(duì)胰腺癌轉(zhuǎn)移調(diào)控作用，與MACC1以及下游HGF/c-Met、EGFR變化。至于是否存在其他機(jī)制以及后續(xù)體內(nèi)試驗(yàn)需進(jìn)一步驗(yàn)證。