亞低溫培養(yǎng)對豬肝細(xì)胞形態(tài)與功能的影響

黃 蕾，張世昌，2，顧春榮，劉京萍，陳 黎

1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗學(xué)部，江蘇 南京 210029； 2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院傳染科；3.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科

隨著生物人工肝的快速發(fā)展，肝細(xì)胞需求量的增加，同時生物人工肝治療肝功能衰竭需要迅速提供大量高活性的肝細(xì)胞，有效地保存和運(yùn)輸肝細(xì)胞是其解決方法之一[1]。當(dāng)前常用超低溫凍存和4 ℃保存肝細(xì)胞的方法，在復(fù)溫后肝細(xì)胞活力和功能均有較大程度的降低，復(fù)溫時需要繁瑣的步驟和嚴(yán)格的實(shí)驗條件，也不方便肝細(xì)胞的長距離運(yùn)輸[2-4]。故亟需為生物人工肝細(xì)胞材料——肝細(xì)胞的保存和運(yùn)輸探索一種更方便有效的方法，以進(jìn)一步促進(jìn)生物人工肝的臨床應(yīng)用。

肝細(xì)胞的保存和運(yùn)輸是生物人工肝臨床應(yīng)用的重要條件之一，也是解決肝細(xì)胞材料短缺的有效方法之一。傳統(tǒng)的細(xì)胞保存方法主要采用超低溫-80 ℃、-196 ℃長期保存或在0～4 ℃短期保存[5-8]。在超低溫長期凍存肝細(xì)胞的降溫和復(fù)溫過程中，通過-5～0 ℃時細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰導(dǎo)致冰晶損傷。溫度下降時，細(xì)胞外的水分先結(jié)冰，未結(jié)冰溶液的電解質(zhì)濃度升高，使細(xì)胞膜受損并發(fā)生滲漏，復(fù)溫時即可因大量水分滲入而死亡[9]。雖然加入凍存保護(hù)劑和加快復(fù)溫速率可部分減少這些損傷，但復(fù)溫后的肝細(xì)胞活力和功能仍有較大程度的降低，而且在復(fù)溫時要求復(fù)雜的實(shí)驗步驟和嚴(yán)格的實(shí)驗條件[10-11]。0～4 ℃短期保存的肝細(xì)胞復(fù)溫后，肝細(xì)胞功能和細(xì)胞膜亦受到損傷，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。以上方法不能完全滿足生物人工肝和肝組織工程所需大量、高密度、高活性肝細(xì)胞的要求，需要為生物人工肝和肝組織工程細(xì)胞材料探索一種更方便有效的肝細(xì)胞保存和運(yùn)輸方法。有學(xué)者將新分離的肝細(xì)胞在37 ℃培養(yǎng)3 h后轉(zhuǎn)入32 ℃培養(yǎng)12 h，結(jié)果顯示，32 ℃培養(yǎng)不像4 ℃誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，而能有效地抑制Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[13]，但未評價肝細(xì)胞功能。如果以接近室溫的亞低溫(25～37 ℃[14-15])培養(yǎng)肝細(xì)胞能夠維持其功能，亞低溫培養(yǎng)肝細(xì)胞就有可能成為保存和運(yùn)輸肝細(xì)胞一種有效的方法。因此，本研究觀察了亞低溫培養(yǎng)對乳豬肝細(xì)胞形態(tài)功能的影響，探索亞低溫培養(yǎng)肝細(xì)胞的可行性，為亞低溫保存和運(yùn)輸肝細(xì)胞提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1 實(shí)驗動物：中國實(shí)驗小型豬購自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗動物中心，均為新生1～7 d的乳豬，無病原體感染，雌雄不限，實(shí)驗前4 h斷乳，清潔皮毛后備用。

1.1.2 主要試劑：實(shí)驗所用試劑如表1所示。

表1 研究中使用的試劑

1.2 方法

1.2.1 豬肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉新生實(shí)驗小乳豬，按照我們已發(fā)表文章方法消化分離豬肝細(xì)胞[16]。臺盼藍(lán)拒染試驗判斷細(xì)胞存活率>90%可用于實(shí)驗。

1.2.2 肝細(xì)胞培養(yǎng)分組方案：(1)對照組：乳豬肝細(xì)胞培養(yǎng)于含質(zhì)量濃度為100 g/L新生小牛血清的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞接種密度為2×105ml-1，培養(yǎng)溫度始終為37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，飽和濕度。(2)亞低溫實(shí)驗組：肝細(xì)胞37 ℃培養(yǎng)4 h，細(xì)胞貼壁后，按下列方案分組培養(yǎng)。① 25 ℃組：25 ℃培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)入37 ℃培養(yǎng)24 h以上。② 28 ℃組：28 ℃培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)入37 ℃培養(yǎng)24 h以上。③ 33 ℃組：33 ℃培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)入37 ℃培養(yǎng)24 h以上。

1.2.3 亞低溫對乳豬肝細(xì)胞活力的影響：將新分離的乳豬肝細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，按分組方案培養(yǎng)。各組肝細(xì)胞每24 h取3孔細(xì)胞用MTT法檢測細(xì)胞活力。首先用PBS洗3遍，加200 μl MTT液，后置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)4 h，吸棄MTT液，加2 ml DMSO，輕搖10 min，吸200 μl加入96孔板，取空白DMSO作零，用酶標(biāo)儀在490 nm波長測吸光度(OD)值。細(xì)胞相對活力(%)=(實(shí)驗組OD值-空白OD值)/(對照組OD值-空白OD值)×100%。

1.2.4 亞低溫對乳豬肝細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)漏出量的影響：將新分離的乳豬肝細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，按分組方案培養(yǎng)。每24 h每組收集培養(yǎng)液上清，3 000 r/min離心5 min,在自動生化分析儀上檢測LDH和AST的含量。

1.2.5 亞低溫對乳豬肝細(xì)胞尿素合成的影響：將新分離的乳豬肝細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，按分組方案培養(yǎng)。每24 h各組取3孔細(xì)胞，PBS洗3遍，加無血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)液上清。在收集培養(yǎng)液上清的同時收集含質(zhì)量濃度為100 g/L的新生小牛血清的培養(yǎng)液作為本底，用脲酶-波氏比色法分別檢測培養(yǎng)液上清和本底中尿素的含量，上清中尿素含量減去本底中尿素含量即為每天乳豬肝細(xì)胞的尿素合成量。肝細(xì)胞尿素合成率(%)=實(shí)驗組肝細(xì)胞每天尿素合成量/對照組肝細(xì)胞每天尿素合成量×100%。

1.2.6 亞低溫對乳豬肝細(xì)胞白蛋白合成的影響：將新分離的乳豬肝細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，按分組方案培養(yǎng)。每天收集各組培養(yǎng)液上清。用特異性豬白蛋白抗體ELISA法檢測乳豬肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中的豬白蛋白含量。肝細(xì)胞白蛋白合成率(%)=實(shí)驗組肝細(xì)胞每天白蛋白合成量/對照組肝細(xì)胞每天白蛋白合成量×100%。

1.2.7 亞低溫對乳豬肝細(xì)胞氨清除率的影響：將新分離的乳豬肝細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，按分組方案培養(yǎng)。每24 h取3孔細(xì)胞，PBS洗3遍，加入含5 mmol/L氯化銨無血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h，收集培養(yǎng)液上清。用谷氨酸脫氫酶-紫外法檢測上清中氨的濃度。肝細(xì)胞氨清除率(%)=實(shí)驗組肝細(xì)胞每天氨清除量/對照組肝細(xì)胞每天氨清除量×100%。

1.2.8 亞低溫對復(fù)溫后乳豬肝細(xì)胞形態(tài)的影響：做上述各項實(shí)驗時，同時采用倒置相差顯微鏡對實(shí)驗組和對照組乳豬肝細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行動態(tài)觀察，細(xì)胞培養(yǎng)時間最長7 d，同時照相記錄。

2 結(jié)果

2.1 亞低溫對乳豬肝細(xì)胞形態(tài)的影響倒置相差顯微鏡觀察乳豬肝細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示，置于亞低溫培養(yǎng)前即接種培養(yǎng)4 h后，乳豬肝細(xì)胞大部分已經(jīng)貼壁，細(xì)胞多呈圓形，細(xì)胞核明顯并見少量雙核細(xì)胞；在亞低溫培養(yǎng)24 h后，28 ℃組肝細(xì)胞未完全伸展開，較亞低溫培養(yǎng)前細(xì)胞增殖不明顯，可見雙核細(xì)胞；25 ℃組肝細(xì)胞與28 ℃組基本相似，但見少許漂浮細(xì)胞，胞膜周圍可見少量棘狀突起，33 ℃組肝細(xì)胞較亞低溫培養(yǎng)前進(jìn)一步伸展開，但未完全展開，可見細(xì)胞增殖。在恢復(fù)37 ℃培養(yǎng)24 h后，各組肝細(xì)胞完全展開，體積明顯增大，可見許多雙核細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量增殖明顯，盡顯典型的、較均勻一致的多角形，肝細(xì)胞與肝細(xì)胞之間的邊界清晰、明亮(見圖1)。

圖1 亞低溫培養(yǎng)對肝細(xì)胞形態(tài)的影響(放大200倍)

2.2 亞低溫對乳豬肝細(xì)胞活力的影響在亞低溫培養(yǎng)24 h后，各組肝細(xì)胞活力均有不同程度的降低。其中25 ℃組肝細(xì)胞只有對照組的58.8%，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；28 ℃組和33 ℃組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)溫24 h后，各組肝細(xì)胞活力較復(fù)溫前顯著升高(P<0.05)，與對照組相比，25 ℃組肝細(xì)胞活力仍顯著低于對照組(P<0.01)，28 ℃組和33 ℃組肝細(xì)胞活力顯著高于對照組(P<0.05)，28 ℃組和33 ℃組均顯著高于25 ℃組(P<0.01)，28 ℃組與33 ℃組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖2)。

注：*P<0.05，**P<0.01。

2.3 亞低溫對乳豬肝細(xì)胞LDH和AST漏出量的影響亞低溫培養(yǎng)24 h過程中，各組肝細(xì)胞LDH和AST漏出量與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，各組之間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在復(fù)溫培養(yǎng)24 h過程中，各組肝細(xì)胞LDH和AST漏出量較對照組和復(fù)溫前差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 復(fù)溫前后肝細(xì)胞LDH和AST漏出量的變化

2.4 亞低溫對肝細(xì)胞尿素合成的影響亞低溫培養(yǎng)過程中，各組肝細(xì)胞尿素合成率均有所降低，與對照組相比，25 ℃組差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，28 ℃組和33 ℃組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?；謴?fù)37 ℃培養(yǎng)24 h，28 ℃組和33 ℃組肝細(xì)胞尿素合成率較亞低溫培養(yǎng)時顯著升高(P<0.01)，25 ℃組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，28 ℃組和33 ℃組與對照組相比顯著升高(P<0.05)。復(fù)溫后組間比較，28 ℃組和33 ℃組均高于25 ℃組(P<0.05)，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖3)。

注：*P<0.05，**P<0.01。

2.5 亞低溫對肝細(xì)胞白蛋白合成的影響亞低溫培養(yǎng)各組肝細(xì)胞白蛋白合成率較對照組均顯著降低(P<0.05)。在復(fù)溫培養(yǎng)24 h后，25 ℃組肝細(xì)胞白蛋白合成率較復(fù)溫前升高不顯著(P>0.05)，28 ℃組和33 ℃組較復(fù)溫前有顯著升高(P<0.01)，與對照組相比，25 ℃組顯著低于對照組(P<0.01)，28 ℃組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，33 ℃組顯著高于對照組(P<0.01)，并且28 ℃組與33 ℃組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖4)。

注：*P<0.05，**P<0.01。

2.6 亞低溫對肝細(xì)胞氨清除率的影響經(jīng)亞低溫培養(yǎng)24 h后，各組肝細(xì)胞氨清除率均顯著降低(P<0.05)。復(fù)溫培養(yǎng)24 h后，各組肝細(xì)胞氨清除率較亞低溫培養(yǎng)時均顯著升高(P<0.05)，與對照組相比，25 ℃組和28 ℃組的氨清除率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而33 ℃組顯著升高(P<0.01)，并顯著高于25 ℃組和28 ℃組(P<0.01)(見圖5)。

注：*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

眾多研究顯示，在超低溫和4 ℃左右保存的肝細(xì)胞復(fù)溫后，其細(xì)胞形態(tài)受損，細(xì)胞活力顯著下降[17-18]。也有研究顯示，在10 ℃和20 ℃培養(yǎng)肝細(xì)胞均造成細(xì)胞形態(tài)損傷和活力的丟失[19]。因此，本實(shí)驗在25～37 ℃之間選擇多個溫度進(jìn)行亞低溫培養(yǎng)實(shí)驗，通過評價亞低溫培養(yǎng)復(fù)溫后肝細(xì)胞的形態(tài)和功能，篩選適合保存和運(yùn)輸肝細(xì)胞的溫度，了解溫度變化可能對細(xì)胞造成的影響。

傳統(tǒng)肝細(xì)胞保存方法研究結(jié)果顯示，經(jīng)超低溫長期凍存或4 ℃左右短期保存的肝細(xì)胞復(fù)溫培養(yǎng)后，細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞顆粒增粗、胞漿變薄、胞膜皺縮等現(xiàn)象，并迅速老化[20-21]。而本實(shí)驗結(jié)果顯示，在亞低溫條件下，各組乳豬肝細(xì)胞未見明顯增殖，生長緩慢，細(xì)胞未完全展開，與Fu等[13]在32 ℃觀察到的肝細(xì)胞形態(tài)一致，與對照組肝細(xì)胞快速增殖的生長特性相比，亞低溫下的乳豬肝細(xì)胞的增殖和生長代謝能力受到明顯抑制。而在25 ℃下肝細(xì)胞胞膜周圍可見少量棘狀突起，少許漂浮細(xì)胞，說明25 ℃可能對肝細(xì)胞有一定的損傷，影響未完全貼壁的細(xì)胞進(jìn)一步貼壁。復(fù)溫后乳豬肝細(xì)胞迅速增殖，形態(tài)典型，說明經(jīng)亞低溫培養(yǎng)的肝細(xì)胞復(fù)溫后仍具有較強(qiáng)的增殖能力，維持正常的肝細(xì)胞形態(tài)。Fisher等[22]的研究結(jié)果也顯示，將肝細(xì)胞置于32 ℃短期保存，肝細(xì)胞的增殖受到抑制，復(fù)溫后可繼續(xù)增殖。亞低溫抑制肝細(xì)胞增殖的機(jī)制，可能是亞低溫下肝細(xì)胞DNA、RNA等大分子合成代謝降低，細(xì)胞分裂受到抑制。

肝細(xì)胞分離過程酶的消化使肝細(xì)胞膜對凍存復(fù)溫過程中滲透壓的變化更敏感[23]。傳統(tǒng)的保存方法不能很好地保持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，凍存和低溫保存均可誘導(dǎo)細(xì)胞膜損傷，造成細(xì)胞活力降低和膜大皰的形成，大皰破裂引起細(xì)胞內(nèi)酶漏出，使培養(yǎng)液中LDH、AST等酶活性顯著升高[24-25]。本實(shí)驗采用亞低溫培養(yǎng)肝細(xì)胞結(jié)果顯示，亞低溫培養(yǎng)和復(fù)溫后肝細(xì)胞的LDH和AST漏出量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示亞低溫培養(yǎng)對肝細(xì)胞膜未造成明顯損傷。有研究[24]顯示，32 ℃培養(yǎng)的肝細(xì)胞LDH和AST漏出量明顯減少，有利于維持肝細(xì)胞膜的穩(wěn)定。關(guān)于亞低溫抑制肝細(xì)胞LDH和AST漏出的機(jī)制，可能是亞低溫通過抑制細(xì)胞色素C的釋放，從而阻止Fas介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡[13]，減少由于肝細(xì)胞分離過程誘發(fā)的細(xì)胞凋亡[24]，有利于受損肝細(xì)胞膜的修復(fù)。

肝細(xì)胞活力是評價肝細(xì)胞保存和運(yùn)輸效果的重要指標(biāo)之一。研究[26]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)亞低溫(25～33 ℃)培養(yǎng)的肝細(xì)胞復(fù)溫后，其肝細(xì)胞活力接近100%。本實(shí)驗結(jié)果顯示，25 ℃組肝細(xì)胞活力在復(fù)溫前后均顯著低于對照組，提示25 ℃培養(yǎng)對肝細(xì)胞活力有較大的影響，經(jīng)28 ℃和33 ℃培養(yǎng)的肝細(xì)胞復(fù)溫后其活力顯著高于37 ℃對照組，提示28 ℃和33 ℃培養(yǎng)能較好地提高肝細(xì)胞的活力，與Fisher等[22]報道一致。其可能原因是亞低溫抑制肝細(xì)胞凋亡，減少由于肝細(xì)胞分離過程誘發(fā)的細(xì)胞凋亡[23]，為肝細(xì)胞修復(fù)損傷提供更長的時間，使更多的受損肝細(xì)胞恢復(fù)細(xì)胞活力。在眾多肝細(xì)胞長期凍存和0～4 ℃短期保存的研究中，雖然采用球形體、共培養(yǎng)、微囊包裹等方法可以部分提高復(fù)溫后肝細(xì)胞活性，但復(fù)溫后肝細(xì)胞活力依然不到85%[25，27-28]。因此，從肝細(xì)胞活力角度考慮，亞低溫培養(yǎng)肝細(xì)胞要優(yōu)于超低溫凍存和0～4 ℃短期保存，有望為生物人工肝細(xì)胞材料的保存和運(yùn)輸提供一種較好的方法。

肝細(xì)胞的保存和運(yùn)輸必須維持有效的細(xì)胞功能，這也是生物人工肝和組織工程肝治療肝衰竭的基本要求。本實(shí)驗結(jié)果顯示，亞低溫培養(yǎng)肝細(xì)胞的尿素合成率、白蛋白合成率、氨清除率較對照組均顯著下降(除33 ℃組尿素合成外)，提示亞低溫抑制肝細(xì)胞的合成和生物轉(zhuǎn)化功能。復(fù)溫后肝細(xì)胞的尿素合成率、白蛋白合成率、氨清除率較復(fù)溫前均顯著升高，說明復(fù)溫后肝細(xì)胞的功能能夠迅速恢復(fù)，并且復(fù)溫后肝細(xì)胞的部分功能顯著高于對照組。組間比較顯示，經(jīng)28 ℃和33 ℃培養(yǎng)肝細(xì)胞復(fù)溫后功能均高于25 ℃組，提示28 ℃和33 ℃培養(yǎng)能更好地維持肝細(xì)胞的功能，這與肝細(xì)胞活性檢測結(jié)果一致。

以往大量研究顯示，在超低溫凍存和0～4 ℃保存肝細(xì)胞過程中，產(chǎn)生的溶質(zhì)、冰晶損傷和誘發(fā)的細(xì)胞凋亡進(jìn)一步加重肝細(xì)胞消化分離過程的細(xì)胞損傷，復(fù)溫后肝細(xì)胞從低氧轉(zhuǎn)入高氧狀態(tài)，產(chǎn)生大量氧自由基和脂質(zhì)過氧化物，再次造成細(xì)胞損傷和凋亡，使復(fù)溫后肝細(xì)胞功能顯著下降[29-30]。而本實(shí)驗亞低溫培養(yǎng)能較好地維持復(fù)溫后肝細(xì)胞功能，并提高肝細(xì)胞的部分功能。其可能原因是亞低溫培養(yǎng)不產(chǎn)生滲透壓、氧張力變化，不形成冰晶，能夠抑制細(xì)胞凋亡[13，15]，減少了因肝細(xì)胞的損傷和細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞數(shù)量損失。同時亞低溫部分抑制肝細(xì)胞代謝，肝細(xì)胞處于低代謝水平，減少了代謝產(chǎn)物的毒性作用，為肝細(xì)胞修復(fù)肝細(xì)胞損傷提供更多的時間。因此，本研究表明亞低溫培養(yǎng)有可能為臨床生物人工肝治療提供一種較好的肝細(xì)胞保存和運(yùn)輸方法。