基于HPLC的蝎子草三種有效成分含量測定

李欣燃 羅澤麗 王緒英

（六盤水師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州 六盤水553001）

蝎子草（Girardinia suborbiculataC.J.Chen）為蕁麻科（Urticaceae）蝎子草屬（Girardinia）一年生草本植物，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、除濕、抑菌、降尿酸和降血糖等多種生物學(xué)活性[1-8]，是一種傳統(tǒng)的民族草藥。在我國東北、華北、華中及西南等地均有所分布，且在生長地區(qū)用藥歷史悠久，鑒于其廣泛的藥理作用，蝎子草具有較高的研究價值。

2000年我國首次將指紋圖譜納入中藥質(zhì)量標準的管理法規(guī)[9]，該檢測方法在藥用植物中的應(yīng)用比較廣泛，目前已成為控制中藥材質(zhì)量的一種重要手段，其能將中藥材的有效成分和比例通過圖譜的形式展現(xiàn)出來，常用來作為評價和控制藥材中有效成分的主要方法[10]。

本實驗以蝎子草為研究對象，利用高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）構(gòu)建指紋圖譜的方法，比較索氏提取法和超聲波輔助提取法對蝎子草主要藥效成分β-谷甾醇、山萘素以及東莨菪內(nèi)酯三種物質(zhì)提取量的影響，為中藥材蝎子草資源的藥用成分質(zhì)量控制及進一步的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 材料與試劑

蝎子草采自貴州省六盤水市六枝特區(qū)，經(jīng)六盤水師范學(xué)院植物科學(xué)教研室鑒定為蕁麻科蝎子草屬蝎子草。

β-谷甾醇、山萘素、茛菪亭內(nèi)酯均為標準品（安徽酷爾生物工程有限公司）。甲醇、乙腈為色譜純（河南薩默生物科技有限公司），三氯甲烷、乙醇、磷酸、鹽酸、石油醚等試劑均為分析純（洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 主要儀器

TD5離心機（湖南赫西），高效液相色譜儀（日本島津LC-2010A），萬能粉碎機（林大機械DFT-200），水浴鍋（科偉永興HH-2A），電子分析天平（日本島津ATY-12），超聲波清洗儀（新芝生物SB-800DT）。

2 研究方法

2.1 標準曲線制作

2.1.1 β-谷甾醇標準曲線制作

將β-谷甾醇標準品用甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度分別為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的標準溶液并按以下色譜條件進樣：色譜柱Diamonsil(TM)C18 (250 mm×4.6 mm，5μm)，流動相為99%甲醇，檢測波長210 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫40℃，進樣量30μL時，記錄峰面積并繪制標準曲線。

2.1.2 山萘素標準曲線的制作

將山萘素標準品用甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度分別為0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL的標準溶液，并按以下色譜條件進樣：色譜柱Diamonsil(TM)C18(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸混合液（65∶35,V/V），檢測波長367 nm，流速為0.8 mL/min，柱溫25℃，進樣量10μL，記錄峰面積并繪制標準曲線。

2.1.3 茛菪亭內(nèi)酯標準曲線制作

將茛菪亭內(nèi)酯標準品用甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度分別為0.034 mg/mL、0.068 mg/mL、0.102 mg/mL、0.136 mg/mL、0.17 mg/mL的標準溶液，并按以下色譜條件進樣：色譜柱Diamonsil(TM)C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸（65∶35,V/V），檢測波長344 nm，流速為0.8 mL/min，柱溫25℃，進樣量10μL，記錄峰面積并繪制標準曲線。

2.2 三個成分的提取

2.2.1 β-谷甾醇的提取

稱取蝎子草粉末10.0 g于紗布袋內(nèi)，加入三氯甲烷200 mL。索氏提取：提取2 h，3000 r/min離心5 min，取上清，重復(fù)提取一次，合并上清液于恒溫水浴鍋濃縮至干燥；超聲波提取30 min，3000 r/min離心5 min，取上清，重復(fù)提取一次，合并上清液于恒溫水浴鍋濃縮至干燥。

2.2.2 山萘素的提取

稱取蝎子草粉末10.0 g于紗布袋內(nèi)，加入70%甲醇與4 mol/L鹽酸（5∶1,V/V）混合物300 mL。索氏提取：3 h，3000 r/min離心5 min，取上清后，重復(fù)提取一次，合并上清液于恒溫水浴鍋上濃縮至干燥；超聲波提取90 min，3000 r/min離心5 min，取上清，重復(fù)提取一次，合并上清液于恒溫水浴鍋濃縮至干燥。

2.2.3 東茛菪內(nèi)酯的提取

稱取蝎子草粉末10.0 g于紗布袋內(nèi)，加入95%乙醇150 mL。索氏提?。? h，3000 r/min離心5 min，取上清，重復(fù)提取一次，合并上清液于恒溫水浴鍋濃縮至干燥；超聲波提取30 min，3000 r/min離心5 min，取上清，重復(fù)提取一次，合并上清液于恒溫水浴鍋濃縮至干燥。

2.3 流動相選擇

比較并篩選β-谷甾醇、山萘素和東茛菪內(nèi)酯三種標準品溶液的不同流動相洗脫效果，各流動相詳見表1。

表1 β-谷甾醇流動相篩選Table 1 Mobile phase screening forβ-sitosterol

2.4 上樣量選擇

取制備的β-谷甾醇、山萘素和東茛菪內(nèi)酯三種提取液樣品20μL、30μL、40μL、50μL，按“2.1標準曲線制作”方法分別進行色譜條件進樣，記錄峰面積，比較不同上樣量對三種成分含量的影響。

2.5 三種成分含量計算

蝎子草中β-谷甾醇、山萘素、東茛菪內(nèi)酯三種有效成分含量計算公式如下：

其中，G1：β-谷甾醇上樣量，S1：β-谷甾醇上樣體積，V1：10mL；G2：山萘素上樣量，S2：山萘素上樣體積，V2：5mL×25mL；G3：東茛菪內(nèi)酯上樣量，S3：東茛菪內(nèi)酯上樣體積，V3：5mL×25mL；M：蝎子草質(zhì)量。

2.6 儀器精密度測定

取β-谷甾醇、山萘素、東茛菪內(nèi)酯標準液，分別重復(fù)進樣6次，測定峰面積，并計算三種成分的相對標準偏差。

2.7 供試品穩(wěn)定性測定

取β-谷甾醇、山萘素和東茛菪內(nèi)酯標準液，分別放置室溫0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h后進樣測定峰面積，并計算相對標準偏差。

3.1 三種標準品線性回歸方程的建立

以上樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，分別得到β-谷甾醇線性回歸方程y=295 674x-432 73(R2=99.93)，山萘素線性回歸方程y=(7×106)x-213 804(R2=99.78)，東茛菪內(nèi)酯線性回歸方程y=(5×106)x+300 32(R2=99.97)。

3.2 三種有效成分提取方法比較

三種成分提取效果比較詳見表2，β-谷甾醇超聲波提取和索氏提取效果無差異（p=0.375），山萘素索氏提取效果顯著高于超聲波提取 （p＜0.001），東茛菪內(nèi)酯超聲波提取效果顯著高于索氏提?。╬＜0.001）。

表2 三種有效成分提取液HPLC色譜峰面積Table 2 The area of HPLC chromatogram of the three effective components

3.3 流動相優(yōu)化

3.3.1 β-谷甾醇流動相選擇

β-谷甾醇標準品9種流動相的高效液相色譜圖峰面積及保留時間詳見表3，當(dāng)流動相為甲醇99%、甲醇-水（98.5∶1.5）、乙腈-水（97∶3）洗脫時，β-谷甾醇高效液相色譜圖峰面積較大。

表3 β-谷甾醇標準品9種流動相色譜峰面積比較Table 3 Comparison of the chromatogram of 9 mobile phase for theβ-sitosterol standard compounds

以上3種流動相的高效液相色譜圖詳見圖1（A、B、C）。當(dāng)流動相為99%甲醇洗脫時，β-谷甾醇色譜圖分離度較好，峰形尖銳對稱；流動相為甲醇-水（98.5∶1.5/V∶V）洗脫時，不能對β-谷甾醇起到較好分的離效果；當(dāng)流動相為乙腈-水（97∶3/V∶V）洗脫時，β-谷甾醇出峰過早，不利于目標物的檢測。故確定選擇99%甲醇為β-谷甾醇洗脫劑。

圖1 β-谷甾醇不同流動相高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram with different mobile phase forβ-sitosterol

3.3.2 山萘素流動相選擇

山萘素標準品6種流動相高效液相色譜圖峰面積及保留時間詳見表4，當(dāng)流動相為甲醇-0.1%磷酸（62∶38/V∶V）、甲醇-0.1%磷酸（65∶35/V∶V）、乙腈-0.1%磷酸（65∶35/V∶V）、甲醇-0.5%磷酸（48∶52/V∶V）洗脫時，山萘素高效液相色譜圖峰面積較大。

表4 山萘素標準品6種流動相色譜圖比較Table 4 Comparison of the chromatogram of 6 mobile phase for the kaempferol standard compounds

以上4種流動相色譜圖詳見圖2，由圖2 A可以看出，當(dāng)流動相為甲醇-0.1%磷酸（62∶38/V∶V）時，雜峰較多，對山萘素的分離效果較差；比較圖2 B、C、D可以看出，當(dāng)流動相為乙腈-0.1%磷酸（65∶35/V∶V）時，山萘素色譜圖峰面積最大，出峰時間早，無雜峰，分離效果較佳，故確定選擇乙腈-0.1%磷酸（65∶35/V∶V）作為山萘素的洗脫劑。

圖2 山萘素不同流動相高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram with different mobile phase for kaempferol

3.3.3 東茛菪內(nèi)酯流動相選擇

茛菪亭標準品9種流動相高效液相色譜圖峰面積及保留時間詳見表5。當(dāng)流動相為甲醇-水（60∶40/V∶V）、甲醇-水甲醇-水（75∶25/V∶V）、乙腈-0.1%磷酸（65∶35/V∶V）、甲醇-0.85%磷酸（60∶40/V∶V）、甲醇-0.1%磷酸（65∶35/V∶V）時，茛菪亭高效液相色譜圖峰面積較大。

表5 茛菪亭標準品9種流動相色譜圖比較Table 5 Comparison of the chromatogram of 9 mobile phase for the scopoletin standard compounds

以上5種流動相色譜圖詳見圖3，甲醇水、乙腈磷酸及甲醇磷酸三類不同流動相對茛菪亭均有較好的分離效果，其中，乙腈-0.1%磷酸（65∶35/V∶V）為流動相時，峰形最尖銳，出峰時間早，峰面積大，分離效果好，故確定選擇乙腈-0.1%磷酸（65∶35/V∶V）作為東茛菪內(nèi)酯的洗脫劑。

圖3 茛菪亭不同流動相高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatogram with different mobile phase for scopoletin

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 精密度試驗

β-谷甾醇、山萘素、東茛菪內(nèi)酯標準品精密度試驗結(jié)果詳見表6，各成分峰面積的RSD依次為β-谷甾醇1.83%、山萘素1.52%、東茛菪內(nèi)酯1.89%，均小于2%，表明儀器精密度良好。

表6 精密度試驗結(jié)果（n=6）Table 6 The results of precision test

3.4.2 穩(wěn)定性試驗

β-谷甾醇、山萘素、東茛菪內(nèi)酯標準品穩(wěn)定性試驗結(jié)果詳見表7，將其分別放置0、2、4、6、8和10 h后測定峰面積，各成分RSD依次為β-谷甾醇1.38%、山萘素1.98%、東茛菪內(nèi)酯1.79%，均小于2%，結(jié)果表明蝎子草β-谷甾醇、山萘素、東茛菪內(nèi)酯提取液在室溫下放置10 h后穩(wěn)定性良好，滿足試驗所需。

表7 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 7 The results of stability test

三種成分上樣量及色譜圖面積詳見表8，隨著上樣量遞增，各成分色譜圖面積沒有呈現(xiàn)良好的增長趨勢，當(dāng)上樣量＞40μL，色譜峰雜亂，洗脫效果不佳，上樣量與分離度成反比，過高的上樣量不利于目標成分的檢測，因此，上樣量40μL較為適宜。

表8 三種成分不同上樣量色譜峰面積比較Table 8 Comparison of chromatographic area of three components with different loading quantities

將待測樣品β-谷甾醇、山萘素、東茛菪內(nèi)酯提取液分別進行三次平行上樣，得到三種有效成分平均含量依次為0.422 5 mg/g、0.099 3 mg/g和0.021 2 mg/g。

4 結(jié)論

β-谷甾醇、山萘素、東茛菪內(nèi)酯為蝎子草發(fā)揮藥理作用的三種重要化學(xué)成分。本研究采用HPLC法同時測定蝎子草中此三種物質(zhì)的含量，并優(yōu)化了其測定方法。試驗建立的測定方法精密度高、穩(wěn)定性好且快速簡便，可為蝎子草藥用成分含量檢測及其合理用藥提供參考依據(jù)。