豬毛蒿精油及其活性成分萜品-4-醇對(duì)黃曲霉的抑制作用研究

令利軍，趙云花，馬穩(wěn)霞，馮升來(lái)，楊彩云，涂藝馨，張 繼

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070）

黃曲霉Aspergillusflavus為黃曲霉屬真菌，可導(dǎo)致玉米、小麥和花生等多種糧食霉變[1]，其中花生是最容易受黃曲霉感染的農(nóng)作物之一。黃曲霉通過(guò)分生孢子或菌核進(jìn)行繁殖，菌落生長(zhǎng)迅速且在自然界的分布廣泛。黃曲霉的主要危害是其在生長(zhǎng)過(guò)程中可以產(chǎn)生高毒性的次生代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素[2]，1993年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)將黃曲霉毒素B1劃定為Ⅰ類致癌物質(zhì)[3]。因此，農(nóng)作物黃曲霉污染嚴(yán)重威脅著人類和動(dòng)物的健康，并給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和畜牧業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。目前主要通過(guò)人工合成的化學(xué)防腐劑來(lái)控制黃曲霉病害，但是化學(xué)防腐劑的長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生抗藥性，殺菌劑殘留和表面污染等問(wèn)題[5]，因此亟需開發(fā)天然、安全和高效的抗真菌劑。

植物精油是從植物組織中提取出來(lái)的具有高度生物安全性的揮發(fā)性油狀液體，其主要成分為醛、酮、醚和酯等物質(zhì)[6]，多種植物精油具有抗真菌活性[7-9]。豬毛蒿Artemisiascoparia為菊科蒿屬多年生草本植物，在我國(guó)分布廣泛，對(duì)豬毛蒿精油的研究主要集中在其殺蟲作用[10-13]及成分分析[14,15]等方面，未曾檢索到豬毛蒿精油抑制真菌的研究報(bào)道。萜品?4?醇（Terpinen?4?ol）又名(?)?萜品?4?醇，是一種無(wú)色液體，是豬毛蒿精油及其他多種植物精油的重要組成成分[16,17]。萜品?4?醇能夠通過(guò)抑制細(xì)胞遷移并誘導(dǎo)凋亡和亞G1細(xì)胞周期阻滯，在Hep?G2肝癌細(xì)胞中表現(xiàn)出強(qiáng)大的體外和體內(nèi)抗癌作用[18]。此外，萜品?4?醇具有潛在的抗霉菌作用和廣泛的應(yīng)用范圍，可被用作防止真菌污染的新型天然真菌抑制劑[19]。豬毛蒿精油和萜品?4?醇具有揮發(fā)性，采用熏蒸法對(duì)黃曲霉進(jìn)行體內(nèi)和體外防治不僅便捷，而且可以有效減少食品表面的殘留。

本試驗(yàn)通過(guò)水蒸氣蒸餾法提取豬毛蒿精油，采用氣相色譜?質(zhì)譜（GC?MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)其成分進(jìn)行了分析鑒定；采用DPPH自由基清除率測(cè)定其抗氧化能力測(cè)定；并以黃曲霉為研究對(duì)象，通過(guò)熏蒸法檢測(cè)了豬毛蒿精油及其成分萜品?4?醇對(duì)黃曲霉的抑菌能力。旨在為了解豬毛蒿精油組成成分和抗氧化能力，及萜品?4?醇的抑制黃曲霉活性，為其在花生貯藏過(guò)程中的生物防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

豬毛蒿植株于2019年8月采自甘肅省蘭州市榆中縣（E 104°07′40.69"，N 36°05′52.06"），全株陰干后置于水蒸氣蒸餾系統(tǒng)中蒸餾3～4 h，收集提取物，用無(wú)水硫酸鈉干燥后于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩］破?4?醇（CAS：20126?76?5）購(gòu)自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

黃曲霉 AS3.3950由西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物與植物互作實(shí)驗(yàn)室提供。黃曲霉孢子懸液的制備：在固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上接種黃曲霉AS3.3950，28 ℃培養(yǎng)8 d后，用無(wú)菌生理鹽水將黃曲霉孢子洗出，調(diào)節(jié)孢子懸液濃度為105cfu/mL, 4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 豬毛蒿精油的化學(xué)成分分析

通過(guò)氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用（GC?MS）技術(shù)對(duì)豬毛蒿精油進(jìn)行成分分析[20]。色譜柱：毛細(xì)管柱為HP?5 MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；參照文獻(xiàn)[21]設(shè)置色譜柱分析程序。將1 μL樣品（用己烷稀釋至1%）以1:20的分流比注入。載氣為氦氣（99.999%），流速為1.2 mL/min。在相同條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)正構(gòu)烷烴混合物（C5—C36），計(jì)算保留指數(shù)值（RI）。通過(guò)比較質(zhì)譜并計(jì)算保留指數(shù)（RI）值，NIST05和Wiley275文庫(kù)鑒定成分。通過(guò)平均GC?FID峰面積報(bào)告獲得精油各個(gè)成分的相對(duì)百分比[21]。

質(zhì)譜參數(shù)：電子轟擊（E1）離子源70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度270 ℃；掃描范圍30.00～500.00 m/z；延遲時(shí)間3 min；程序時(shí)間35.33 min[22]。

1.3 豬毛蒿精油抗氧化活性的測(cè)定

參照羅亞飛等[23]的方法測(cè)定豬毛蒿精油對(duì)1,1?二苯基?2?三硝基苯肼（DPPH）中自由基的清除效果來(lái)計(jì)算其抗氧化能力。稱取適量DPPH溶于無(wú)水乙醇中，配置成濃度為2×10?4mol/L的DPPH溶液，4 ℃冰箱避光儲(chǔ)存?zhèn)溆?；分別取適量豬毛蒿精油用無(wú)水乙醇溶解，得到濃度梯度為1、5、10、20和40 μL/mL的豬毛蒿精油溶液。

取2 mL的DPPH溶液和2 mL無(wú)水乙醇于試管中，記作A0；取2 mL濃度為1 μL/mL的豬毛蒿精油和2 mL DPPH溶液于試管中，記作A1；取2 mL濃度為1 μL/mL的豬毛蒿精油和2 mL無(wú)水乙醇于5 mL試管中，記作A2；搖勻，避光放置30 min后在517 nm下測(cè)量吸光值。同理檢測(cè)其他不同濃度的豬毛蒿精油的吸光值。用以下公式計(jì)算豬毛蒿精油DPPH的自由基清除率，SR（%）＝（A0―A1―A2）/A0×100。

1.4 豬毛蒿精油及萜品-4-醇對(duì)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率

采用熏蒸法檢測(cè)豬毛蒿精油及萜品?4?醇對(duì)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)的抑制作用[24]，將培養(yǎng)7 d的黃曲霉菌餅（6 mm）接種至固體PDA（20 mL）培養(yǎng)基中央，在培養(yǎng)皿蓋中央均勻的放置直徑為6 mm的無(wú)菌濾紙片。分別吸取不同量豬毛蒿精油和萜品?4?醇于濾紙片上，使得豬毛蒿精油和萜品?4?醇的最終濃度分別為18.2、36.4、54.5、72.7、90.9、181.8、272.7、363.6、545.5和727.3 μL/L，以無(wú)菌培養(yǎng)基為對(duì)照。封口膜密封后置于（28±2）℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，通過(guò)十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理3個(gè)平行。參考文獻(xiàn)[25]的方法計(jì)算豬毛蒿精油和萜品?4?醇對(duì)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率 MGI（%）＝（dc＋dt）/dc×100，其中MGI（%）為豬毛蒿精油及萜品?4?醇對(duì)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率，dc（cm）為對(duì)照組的菌落直徑，dt（cm）為試驗(yàn)組的菌落直徑。

培養(yǎng)2 d后，無(wú)菌絲生長(zhǎng)的豬毛蒿精油和萜品?4?醇濃度被定義為最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC），并根據(jù)幾率值分析法求毒力回歸方程和50%的有效劑量（ED50），MIC及ED50值作為后續(xù)試驗(yàn)主要濃度。

1.5 豬毛蒿精油及萜品-4-醇對(duì)黃曲霉菌絲及孢子形態(tài)的影響

向新培養(yǎng)的黃曲霉平板內(nèi)加入MIC和ED50劑量的豬毛蒿精油和萜品?4?醇，以等量的無(wú)菌水作為對(duì)照，熏蒸培養(yǎng)7 d后，通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察其對(duì)黃曲霉菌絲及孢子形態(tài)的影響。用無(wú)菌手術(shù)刀劃取4 mm×4 mm，厚度約1.5 mm的黃曲霉菌塊，將菌塊放置在裝有2.5%戊二醛固定液的青霉素小瓶中固定24 h。采用PBS緩沖液將固定的菌絲塊洗滌3次后，乙醇（30%，50%，70%，85%，90%，100%）梯度脫水。自然干燥后，將菌塊置于導(dǎo)電膠上，鍍金并通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）進(jìn)行觀察并拍照。

1.6 豬毛蒿精油及萜品-4-醇對(duì)黃曲霉孢子萌發(fā)的影響

吸取100 μL（107cfu/mL）的黃曲霉孢子懸浮液于PDA固體培養(yǎng)基上并涂布均勻，添加MIC（727.3 μL/L）和 ED50（472.7 μL/L）劑量的豬毛蒿精油以及 MIC（272.7 μL/L）和 ED50（158.1 μL/L）劑量的萜品?4?醇熏蒸培養(yǎng)，以等量的無(wú)菌水作為對(duì)照，（28±2）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后觀察并拍照。

1.7 豬毛蒿精油及萜品-4-醇對(duì)花生中黃曲霉菌數(shù)的影響

參照屈璐璐[26]的方法分別探究了豬毛蒿精油和萜品?4?醇對(duì)花生中黃曲霉菌落數(shù)的影響。取2.5 g健康無(wú)病變的花生于10 mL無(wú)菌搖菌管中，移液槍吸取200 μL 濃度為105cfu/mL的黃曲霉孢子懸液于花生中，充分搖勻后在搖菌管蓋子中央分別加入 MIC（27.3 μL/L）和 ED50（472.7 μL/L）劑量的豬毛蒿精油以及MIC（272.7 μL/L）和ED50（158.1 μL/L）劑量的萜品?4?醇，用封口膜密封后放置在（28±2）℃生化培養(yǎng)箱中熏蒸培養(yǎng)5 d后測(cè)定霉菌數(shù)防控效果，以不加豬毛蒿精油及萜品?4?醇的花生作為空白對(duì)照。分別使用5 mL生理鹽水洗脫對(duì)照組和處理組中的孢子，振蕩20 min使樣品中的孢子均勻地懸浮于生理鹽水中。分別取100 μL孢子懸浮液加入3個(gè)無(wú)菌PDA培養(yǎng)基中，涂布均勻后在（28±2）℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d觀察記錄。選取適宜稀釋倍數(shù)下的培養(yǎng)基統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。樣品霉菌菌落數(shù)按下式計(jì)算，樣品菌落數(shù)（cfu/g）＝（3個(gè)平板菌落數(shù)的平均值×稀釋倍數(shù)）/2.5。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù) Duncan’s 新復(fù)極差法檢驗(yàn)在P＜0.05 水平的差異顯著性。用Origin Pro 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬毛蒿精油的GC-MS分析結(jié)果

豬毛蒿精油的GC?MS結(jié)果分析如表1所示。豬毛蒿精油含有24種化合物，占精油總量的99.99%。其主要成分為桉葉油醇（43.8%）、反 2,7?二甲基?4,6?辛二烯醇?2（11.16%）、大根香葉烯（8.88%）、松香芹酮（6.26%），其中萜品?4?醇在豬毛蒿精油中的含量為2.81%。

表1 豬毛蒿精油的化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of the essential oil derived from A.scoparia

2.2 抗氧化活性

豬毛蒿精油對(duì)DPPH自由基的清除率如圖1所示，豬毛蒿精油對(duì)DPPH自由基的清除率與濃度呈正相關(guān)。當(dāng)濃度為40 μL/L時(shí)，豬毛精油對(duì)自由基的清除率為79.3%；當(dāng)豬毛蒿精油濃度為20 μL/mL時(shí)，自由基清除率為56.9%。

圖1 豬毛蒿精油對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging effect of essential oil from A.scoparia (EOA) on DPPH radical

2.3 菌絲生長(zhǎng)抑制率

豬毛蒿精油和萜品?4?醇對(duì)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)都具有良好的抑制活性，且抑制活性與濃度呈正相關(guān)（圖2）。高濃度的豬毛蒿精油和萜品?4?醇在熏蒸處理的2 d后，完全抑制了黃曲霉菌絲的生長(zhǎng)，取這兩個(gè)值為最小抑菌濃度MIC做后續(xù)研究。由表2可知，在同一濃度熏蒸處理2 d后，萜品?4?醇對(duì)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)的ED50低于豬毛蒿精油，豬毛蒿精油和萜品?4?醇的ED50分別為727.3和272.7 μL/L。萜品?4?醇對(duì)黃曲霉的防治效果更最佳。

圖2 豬毛蒿精油和萜品-4-醇對(duì)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率Fig.2 Inhibitory effects of essential oil from A.scoparia (EOA)and terpinen-4-ol on the mycelial growth of A.flavus

表2 豬毛蒿精油和萜品-4-醇對(duì)黃曲霉的毒殺活性Table 2 Insecticidal activity of essential oil from A.scoparia (EOA) and terpinen-4-ol of A.flavus

2.4 豬毛蒿精油及萜品-4-醇對(duì)黃曲霉超微結(jié)構(gòu)的影響

為了進(jìn)一步探究豬毛蒿精油和萜品?4醇對(duì)黃曲霉的抑菌機(jī)理，分別以MIC和ED50為目標(biāo)濃度，熏蒸處理5 d后，對(duì)黃曲霉的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描電鏡觀察。豬毛精油及萜品?4?醇對(duì)黃曲霉超微結(jié)構(gòu)的影響如圖3所示，對(duì)照組黃曲霉菌絲表面平整均勻，具有較好的線性，粗細(xì)均一（圖3A）；黃曲霉分生孢子頭結(jié)構(gòu)圓整，分生孢子呈圓形（圖3B）。與對(duì)照組相比較用ED50（472.7 μL/L）豬毛蒿精油熏蒸培養(yǎng)5 d后，黃曲霉的菌絲表面出現(xiàn)了嚴(yán)重的皺縮，菌絲粗細(xì)變得不均一（圖3 C）；黃曲霉孢子頭不再是完整的圓形，孢子表面凹陷甚至破裂（圖3C）。豬毛蒿精油MIC（727.3 μL/L）熏蒸處理后的黃曲霉菌絲皺縮扭曲，出現(xiàn)疣狀表面，并且抑制了黃曲霉孢子的產(chǎn)生，在掃描電鏡下未看到有黃曲霉孢子產(chǎn)生（圖 3C）。在 ED50（158.1 μL/L）和 MIC（272.7 μL/L） 萜品?4?醇熏蒸處理 5 d后，與對(duì)照相比（圖3C）并未引起黃曲霉孢子頭及孢子顯微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的變化（圖3G，I）；但是菌絲形態(tài)都出現(xiàn)了明顯的變化，ED50（158.1 μL/L）濃度的萜品?4?醇可導(dǎo)致菌絲破裂并皺縮（圖3F），MIC（272.7 μL/L）濃度的萜品?4?醇在引起菌絲皺縮的同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致菌絲末端膨大，菌絲失去線性并折疊（圖3H）。

圖3 豬毛蒿精油和萜品-4-醇對(duì)黃曲霉超微結(jié)構(gòu)的影響掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron micrographs of A.flavus after treatment with essential oil from A.scoparia (EOA) and Terpinen-4-ol

2.5 孢子萌發(fā)

為了探究豬毛蒿精油和萜品?4?醇對(duì)黃曲霉孢子萌發(fā)的影響，同樣采取熏蒸法。熏蒸培養(yǎng)72 h后，對(duì)照組PDA培養(yǎng)基表面呈現(xiàn)肉眼可見濃密菌絲，菌絲表面呈黃綠色（圖4A）。在ED50（472.7 μL/L）濃度的豬毛蒿精油熏蒸培養(yǎng)72 h后，與承載豬毛蒿精油的濾紙片正對(duì)的PDA培養(yǎng)基上肉眼未見菌絲，未與濾紙片正對(duì)的PDA培養(yǎng)基表面呈現(xiàn)出濃密的白色菌絲，但沒(méi)有色素合成（圖4B）。MIC（727.3 μL/L）濃度的豬毛蒿精油熏蒸培養(yǎng)72 h后，PDA培養(yǎng)基表面肉眼未見菌絲（圖4 C）。與對(duì)照組相比，分別與濃度為ED50（158.1 μL/L）和MIC（272.7 μL/L）濃度的萜品?4?醇共培養(yǎng)72 h后，PDA培養(yǎng)基表面都出現(xiàn)了肉眼可見的菌絲，很明顯黃曲霉菌絲的量隨著萜品?4?醇濃度的增大而減少（圖4 D，E）。

圖4 豬毛蒿精油和萜品-4-醇對(duì)黃曲霉孢子萌發(fā)的影響Fig.4 Inhibitory effect of essential oil from A.scoparia (EOA) and terpinen-4-ol on the spore germination of A.flavus

2.6 花生體內(nèi)黃曲霉菌數(shù)

花生體內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，濃度為 MIC和 ED50的豬毛蒿精油和萜品?4?醇熏蒸處理可以顯著降低花生體內(nèi)霉菌數(shù)（圖5）。在濃度為MIC（727.3 μL/L）和 ED50（472.7 μL/L）的豬毛蒿精油熏蒸處理5 d后，花生中黃曲霉的菌落數(shù)分別為3.6×104和 5.64×105cfu/g，而濃度為和MIC（272.7 μL/L）和ED50（158.1 μL/L）萜品?4?醇熏蒸處理的花生中菌落數(shù)分別為4.24×105和1.46×106cfu/g，都顯著低于對(duì)照組花生中的霉菌數(shù)1.32×107cfu/g（P＜0.05）。

圖5 豬毛蒿精油和萜品-4-醇對(duì)花生中霉菌數(shù)的影響Fig.5 Effect of essential oil from A.scoparia (EOA) and terpinen-4-ol on peanut mold counts

3 討論

GC?MS結(jié)果表明，豬毛蒿精油中已鑒定的化合物種類有24種，與已報(bào)道的豬毛蒿精油的成分分析相比較[27,28]，發(fā)現(xiàn)不同豬毛蒿精油有效的種類及含量都各不相同，這可能與豬毛蒿生長(zhǎng)的地域及時(shí)間不同有一定的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，精油的抗菌活性并非由主要成分決定，次要成分也起著重要的角色[29]。精油的抗氧化能力對(duì)食品防腐具有一定的貢獻(xiàn)，Karoui和Hassoun[30]研究發(fā)現(xiàn)，羅勒葉精油因其具有較好的抗氧化能力在防止脂質(zhì)氧化方面更有效。

由于植物精油的疏水親脂性，精油可以擴(kuò)散到微生物的細(xì)胞膜中從而增加其滲透性導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)成分流失[31]，達(dá)到抑菌作用。有研究表明，植物精油可以通過(guò)破壞真菌細(xì)胞壁的完整性，從而抑菌真菌的生長(zhǎng)[32]，本文掃描電鏡結(jié)果顯示，豬毛蒿精油與其成分萜品?4?醇導(dǎo)致黃曲霉菌絲形態(tài)扭曲、塌陷、皺縮、甚至破損，這與Wang等[33]的結(jié)果一致。Oliveira等[34]發(fā)現(xiàn)百里香精油可以通過(guò)破壞黃曲霉細(xì)胞膜和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到抗真菌的效果。本研究發(fā)現(xiàn)，豬毛蒿精油和萜品?4?醇不僅可以通過(guò)破壞黃曲霉菌絲的形態(tài)，抑制黃曲霉菌絲的生長(zhǎng)，還可以有效地抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)，其原因可能是豬毛蒿精油可以通過(guò)破壞黃曲霉細(xì)胞膜來(lái)抑制黃曲霉。

精油作為保鮮材料已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)，Burt等[35]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂醛和香芹酚可以防治獼猴桃被致病菌的侵染；小茴香精油可以影響花生貯藏中黃曲霉群落，達(dá)到保鮮的效果[36]；Tahmasebi等[37]發(fā)現(xiàn)，肉桂精油可減少致病真菌對(duì)油桃的損害；萜品?4?醇做成殼聚糖材料，可以作為一種新型的抗真菌防腐劑來(lái)改善玉米樣品的貨架期，防止真菌和黃曲霉毒素的污染[38]。本研究通過(guò)豬毛蒿精油及萜品?4?醇對(duì)花生保鮮研究發(fā)現(xiàn)，兩者均可以達(dá)到保鮮效果。

綜上所述，豬毛蒿精油及其成分萜品?4?醇可以顯著抑制黃曲霉菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，為進(jìn)一步探究豬毛蒿精油及萜品?4?醇抑制黃曲霉菌的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，體內(nèi)抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，豬毛蒿精油及萜品?4?醇可以顯著減少花生中黃曲霉的菌落數(shù)，防止花生被黃曲霉侵染。