大蒜根系分泌物對煙草鐮刀菌根腐病的控制作用

吳曉婷，賴榮泉*，米月娥，顧 鋼，張 榜，王巧妮

（1.閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室/福建農(nóng)林大學植物保護學院，福州 350002；2.中國煙草總公司福建省公司，福州 350003）

煙草鐮刀菌根腐病Fusariumoxysporum是由鐮刀菌引起的一種主要的煙草根莖類病害，在福建省各大煙區(qū)普遍發(fā)生[1]。該病害局部發(fā)生且具有潛在危害，可單獨發(fā)生，也可與煙草根莖病害（如煙草青枯病或煙草黑脛?。┑然旌习l(fā)生，給煙葉生產(chǎn)帶來巨大的損失[2]。鐮刀菌一般存在于煙株根、莖、葉和花等部位，但根部相對較多[3]。目前煙草根腐病防治方法有：農(nóng)業(yè)防治、化學防治和生物防治等。目前，在生產(chǎn)上仍主要依賴于化學防治，但由于化學農(nóng)藥長期大量使用導致病原菌抗藥性增強、環(huán)境污染嚴重、煙葉品質(zhì)下降和危害人類身體健康等一系列問題的出現(xiàn)，該方法已然不是一種經(jīng)濟、安全的防控措施[4]。而生物防治雖已取得一定的研究成果，但還未有一個具體的有效防治方法。煙草根腐病的防治仍是世界面臨的一大難題，而發(fā)展一個新型抗菌劑，對煙草根腐病菌的防治具有重要的意義。

大蒜AlliumsativumL.為百合科蔥屬植物，種質(zhì)資源豐富，我國大蒜種植面積占全球的85%以上[5,6]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，大蒜是公認的良好前茬作物，一些作物與大蒜輪間套可減輕病蟲害的發(fā)生[7-10]。其原因可能是大蒜根系分泌物或其根系中的物質(zhì)影響下茬作物[11]。前人研究表明，利用大蒜根系分泌物的抑菌作用在許多植物真菌、細菌病原物上均表現(xiàn)出較好的防治效果[12-14]。釧有聰?shù)萚15]報道了大蒜與烤煙輪作可有效降低煙草黑脛病的發(fā)生。大蒜粗提物對煙草青枯病和黑脛病均有不同程度的抑制作用[13,16,17]。然而，大蒜根系分泌物中的抑菌成分及其對煙草主要病害煙草鐮刀菌根腐病菌的抑制活性目前未見報道。

因此，為有效控制煙草根莖病的發(fā)生，減少化學農(nóng)藥的使用，本課題組前期在煙田利用大蒜與其套種等來防控煙草根莖病害，取得了明顯的控害效果[7,8,17,18]。在前期研究的基礎上，本研究繼續(xù)通過收集、鑒定大蒜根系分泌物主要成分，測定分析其主要成分對煙草鐮刀菌根腐病的影響，以期為利用大蒜控制煙草主要病害或研制植物性抑菌劑提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大蒜品種：山東紫皮蒜，孝賢故里尋味魚臺生產(chǎn)。

煙草品種：烤煙紅花大金元，由福建省煙草農(nóng)業(yè)科學研究所南平分所提供。

病原：煙草尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum由福建農(nóng)林大學生物農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室提供。

試劑：99.5%鄰苯二甲酸二丁酯，天津市恒興化學試劑制造有限公司；98.0% 2,6?二異丙基苯酚，上海麥克林生化科技有限公司；85.0%二烯丙基二硫，上海麥克林生化科技有限公司；AR，2,6?二叔丁基對甲酚，上海麥克林生化科技有限公司；99.5%甲醇，西隴科學股份有限公司。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂14.0 g，pH 5.8～6.2。

儀器材料：Agilent 7890B?5977A氣相色譜?質(zhì)譜儀（GC?MS），美國安捷倫公司；MRC?250B?LED人工氣候箱，寧波普朗特儀器有限公司；AUY120電子天平，日本島津公司；OLYMPUS BX43生物顯微鏡，福建遠明生物科技有限公司；MLS?3781L?PC滅菌鍋，日本Panasonic公司；RE?52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；品氏泥炭基質(zhì)，丹麥品氏托普公司；塑料瓶（瓶口直徑95 mm，瓶底直徑80 mm，高85 mm，容積450 mL）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 大蒜根系分泌物的收集 參考周艷麗等[19]和劉素慧等[20]方法。采用固體瓊脂培養(yǎng)法，挑選大小一致且無病斑的蒜瓣，自來水流水沖洗0.5～1 h，在無菌條件下，用75%乙醇將蒜瓣消毒1 min，經(jīng)無菌水沖洗3次后，再用10%次氯酸鈉消毒30 min，無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸干蒜瓣表面水分。播入裝有50 mL瓊脂培養(yǎng)基（6‰）的塑料瓶中，每瓶 5瓣，以不種大蒜的瓊脂培養(yǎng)基作為對照。每個處理或?qū)φ罩貜?3次，共6個塑料瓶，置于25 ℃室溫下自然生長。30 d后拔掉大蒜，稱根質(zhì)量后，按1 g根質(zhì)量和5 mL蒸餾水的比例加入塑料瓶中浸提瓊脂，即得含有大蒜根系分泌物的培養(yǎng)基。

1.2.2 大蒜根系分泌物粗提物對煙草鐮刀菌根腐病菌的影響測定 參考王軍等[14]的菌絲生長速率法測定大蒜根系分泌物粗提物對煙草鐮刀菌根腐病菌的影響。大蒜根系分泌物處理濃度為0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 g/mL。將PDA培養(yǎng)基倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后，吸取2 mL不同濃度大蒜根系分泌物滴加至培養(yǎng)基表面，用涂布棒涂抹均勻。待分泌物浸入培養(yǎng)基表面后，用消過毒的5 mm打孔器在供試病原菌菌落邊緣打制菌餅，再將其接種在培養(yǎng)基表面中央，每皿1個菌餅，每個處理3個重復，以不加大蒜根系分泌物為對照。置于溫度28 ℃，相對濕度75%的人工氣候箱中暗培養(yǎng)，5 d后利用十字交叉法測定菌落直徑，抑制率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

參考程智慧等[21]的方法，采用水瓊脂孢子萌發(fā)法。將病原菌培養(yǎng)一段時間后，使其產(chǎn)孢，用含0.1%的吐溫80無菌水將孢子洗脫，并稀釋至其在40倍物鏡下每個視野含20個孢子左右的菌懸液。大蒜根系分泌物處理濃度為0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 g/mL，以不加大蒜根系分泌物為對照。分別吸取100 μL菌懸液，與100 μL不同濃度大蒜根系分泌物混勻。將載玻片放入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，用直徑15 mm的打孔器打取水瓊膠培養(yǎng)基（2%）置于載玻片上，用移液槍吸取混合液20 μL于水瓊膠培養(yǎng)基上，每皿2片。置于溫度28 ℃、相對濕度為75%的人工氣候箱中保濕暗培養(yǎng)，8 h后在顯微鏡（40倍物鏡）下觀察病原菌孢子萌發(fā)情況，孢子萌發(fā)率（%）＝萌發(fā)孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100，孢子萌發(fā)抑制率（%）＝（對照孢子萌發(fā)率－處理孢子萌發(fā)率）×100。

1.2.3 大蒜根系分泌物的分離、鑒定 參考周艷麗和程智慧[22]的方法。大蒜根系分泌物，與乙酸乙酯按1∶2體積比例萃取，經(jīng)分液漏斗分離，收集乙酸乙酯層，水相再與乙酸乙酯按1∶2體積比例萃取，萃取3次，并合并3次的乙酸乙酯層，將乙酸乙酯層經(jīng)無水Na2SO4干燥，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃下減壓濃縮至干，將濃縮液溶于5 mL甲醇中，并用細菌過濾器過濾濃縮液后，供GC－MS分析測試用。

參考劉素慧[20]方法測定：色譜條件為HP～5色譜柱；載氣為He；50 ℃保持5 min，以5 ℃/min速度升至280 ℃，保持25 min；質(zhì)譜條件：EI源；掃描的范圍在30～600 amu。

1.2.4 大蒜根系分泌物主要成分對煙草尖孢鐮刀菌根腐病菌的影響 參考釧有聰?shù)萚15]的方法，測定菌絲生長。選取大蒜根系分泌物主要成分鄰苯二甲酸二丁酯、2,6?二叔丁基對甲酚、二烯丙基二硫和2,6?二異丙基苯酚進行試驗。用甲醇將以上化合物制成濃度為20 mmol/L的母液，將母液按不同比例加入PDA培養(yǎng)基中，制成終濃度為0.00（CK）、0.05、0.10、0.50、1.00和5.00 mmol/L的帶藥平板，用消過毒的5 mm打孔器在供試病原菌菌落邊緣打制菌餅，將其接種在培養(yǎng)基表面中央，每皿1個菌餅，每個處理3個重復。置于溫度28 ℃、相對濕度為75%的人工氣候箱中保濕暗培養(yǎng)，5 d后利用十字交叉法測定菌落直徑，并計算生長抑制率。

參考程智慧等[21]的方法，采用水瓊脂孢子萌發(fā)法。除用20%甲醇將鄰苯二甲酸二丁酯、2,6?二叔丁基對甲酚、二烯丙基二硫和2,6?二異丙基苯酚稀釋為濃度為0.00（CK）、0.05、0.10、0.50、1.00和5.00 mmol/L外，其他試驗方法同1.2.2。

1.2.5 試劑對煙草尖孢鐮刀菌根腐病的控制作用測定 參考楊瑞秀等[23]的傷根法接種，把事先育好的大小一致5葉1心煙苗移栽入裝有基質(zhì)的花盆中（外徑84 mm，高72 mm），選取長勢、株高等基本一致的煙草幼苗進行處理。分別選取對煙草尖孢鐮刀菌菌絲和孢子有較好抑制作用的2,6?二異丙基苯酚和鄰苯二甲酸二丁酯進行試驗。處理濃度為0.05、0.10、0.50、1.00和5.00 mmol/L，每株澆灌20 mL的不同濃度的2,6?二異丙基苯酚和鄰苯二甲酸二丁酯，每隔7 d澆1次，共澆3次。試驗共5個處理和1個對照，每處理5株，重復3次，自然生長。接種尖孢鐮孢菌時，用刀片在每盆煙株間靠近幼苗處劃3 cm的深溝，將孢子懸浮液（1×106cfu/mL）灌入溝內(nèi)，每株澆灌15 mL，以只接種尖孢鐮孢菌為對照（CK）。置于溫度為28 ℃、相對濕度為90%的人工氣候箱中培養(yǎng)，每隔7 d調(diào)查、統(tǒng)計1次發(fā)病情況，共3次。煙草尖孢鐮刀菌根腐病病害分級標準[24]：0級：全株無病狀；1級：輕度維管褪色，無外部癥狀；2級：中度維管褪色，無外部癥狀；3級：下部葉片變黃，并逐漸萎蔫；4級：大部分萎蔫；5級：植株枯死。病情指數(shù)＝∑（病情指數(shù)×該級發(fā)病株數(shù)）/（總調(diào)查株數(shù)×病情最高級數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

文中數(shù)據(jù)統(tǒng)計均用Excel 2003和SPSS 22.0軟件進行處理、分析。單因素方差分析（α＝0.05），文中數(shù)據(jù)均為（平均值±標準誤）。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜根系分泌物對尖孢鐮刀菌的抑制作用

由圖1和圖2可知，隨著大蒜根系分泌物粗提物濃度的升高，大蒜根系分泌物粗提物對煙草尖孢鐮刀病菌菌絲生長的抑制率和孢子萌發(fā)抑制率逐漸增強，且抑制率間達極顯著差異（F5,12＝37.377，P＝0.000；F5,12＝159.836，P＝0.000），而煙草尖孢鐮刀病菌孢子萌發(fā)率逐漸下降。大蒜根系分泌物粗提物對煙草尖孢鐮刀病菌孢子萌發(fā)率和孢子萌發(fā)抑制率分別為13.91%～88.87%和6.78%～100.00%，且其孢子萌發(fā)率間差異達極顯著（F5,12＝312.026，P＝0.000）。

圖1 大蒜根系分泌物粗提物對煙草尖孢鐮刀病菌菌絲生長的影響Fig.1 Effects of crude extracts of garlic root exudates on mycelial growth of F.oxysporum

圖2 大蒜根系分泌物粗提物對煙草尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響Fig.2 Effects of crude extracts of garlic root exudates on spore germination of F.oxysporum

2.2 大蒜根系分泌物的收集、分離和鑒定

由表1可知，大蒜根系分泌物為有機酸類、烷烴類、芳香族、酯類和雜環(huán)類化合物。主要有20種，按照相對含量多少依次為鄰苯二甲酸二丁酯＞乙酸丁酯＞己二酸二辛酯＞間叔丁基苯酚＞對二甲苯＞苯甲酸甲酯＞4?（1,1,3,3?四甲基丁基）?苯酚＞苯甲酸，2,5?雙（三甲基甲硅烷氧基），三甲基甲硅烷基酯＞苯乙烯＞1?甲基萘＞N?芐基?N?乙基?對異丙基苯甲酰胺＞N?（3?甲基苯基）?乙酰胺＞1,2?苯二甲酸雙（2?甲基丙基）酯＞2,3,4?三氟苯甲酰氯＞甘菊藍＞2,7?二甲基萘＞9,9?二甲基?9?硅芴＞6?甲基?4?吲哚醇＞鄰苯二甲酸二異辛酯＞2,6－二叔丁基對甲酚等。

表1 大蒜根系分泌物的化學成分Table 1 Chemical constituents of garlic root exudates

2.3 大蒜根系分泌物主要成分對煙草尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制作用

從表2可以看出，除二烯丙基二硫在濃度為0.05 mmol/L時對菌絲生長稍有促進作用外，其他濃度下4種主要成分對煙草尖孢鐮刀病菌菌絲生長均有不同的抑制作用。2,6?二異丙基苯酚和2,6?二叔丁基對甲酚對煙草尖孢鐮刀病菌菌絲生長抑制率間差異均達極顯著（F5,12＝65.463，P＝0.000；F5,12＝49.267，P＝0.000），且2,6?二異丙基苯酚比其他試劑的抑菌效果較好。在濃度為5.00 mmol/L時，其抑菌率達到83.45%。當濃度達到1.00 mmol/L時，二烯丙基二硫和鄰苯二甲酸二丁酯對其菌絲生長抑制率間均達極顯著差異（F5,12＝9.437，P＝0.001；F5,12＝26.719，P＝0.000）。因此，4種主要成分對煙草尖孢鐮刀病菌菌絲生長的抑菌效果強弱順序為 2,6?二異丙基苯酚＞鄰苯二甲酸二丁酯＞2,6?二叔丁基對甲酚＞二烯丙基二硫。

表2 大蒜根系分泌物主要成分對煙草尖孢鐮刀病菌菌絲生長的抑制活性Table 2 Inhibitory activity of main components of garlic root exudates on the growth of F.oxysporum

2.4 大蒜根系分泌物主要成份對煙草尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響

由表3和表4可知，4種主要成分對煙草尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)均有不同抑制作用，且其萌發(fā)率、抑制率間均達顯著性差異。除2,6?二異丙基苯酚處理外，其他處理濃度為1.00、5.00 mmol/L時，孢子萌發(fā)率為0，孢子抑制率100%。當各處理濃度達到0.50 mmol/L時，鄰苯二甲酸二丁酯、2,6?二叔丁基對甲酚、二烯丙基二硫和 2,6?二異丙基苯酚對煙草尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)率分別為 35.36%、63.79%、48.63%和87.52%，其抑制率分別為88.12%、34.68%、50.21%和10.39%。其中，鄰苯二甲酸二丁酯對煙草尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)率最小（F5,12＝1331.419，P＝0.000），其抑制率最大（F5,12＝5690.018，P＝0.000）。因此，4種主要成分對煙草尖孢鐮刀菌孢子抑制效果強弱順序為鄰苯二甲酸二丁酯＞二烯丙基二硫＞2,6?二叔丁基對甲酚＞2,6?二異丙基苯酚。

表3 大蒜根系分泌物主要成分對煙草尖孢鐮刀病菌孢子萌發(fā)率的影響Table 3 Effects of garlic root secretions on germination rate of F.oxysporum

表4 大蒜根系分泌物主要成分對煙草尖孢鐮刀病菌孢子萌發(fā)抑制率的影響Table 4 Effects of garlic root exudates on the inhibition rate of spore germination of F.oxysporum

2.5 試劑對煙草尖孢鐮刀菌根腐病的防控作用

由表5和表6可知，2,6?二異丙基苯酚和鄰苯二甲酸二丁酯對煙草尖孢鐮刀菌根腐病均有一定的防治效果，且其防治效果均與濃度成正比。2,6?二異丙基苯酚對煙草尖孢鐮刀菌根腐病的防控效果間差異不顯著，接菌7、14和21 d后，病情指數(shù)分別在50.00～60.00、51.11～64.33和60.00～72.00，與對照間差異顯著（F5,12＝3.750，P＝0.028；F5,12＝4.352，P＝0.017；F5,12＝5.311，P＝0.008），防治效果分別在 20.58%～33.82%、18.45%～35.21%和 11.48%～26.23%，其防治效果間無顯著差異（F5,12＝1.125，P＝0.398；F5,12＝1.268，P＝0.345；F5,12＝1.943，P＝0.180）。

表5 2,6?二異丙基苯酚對煙草尖孢鐮刀菌根腐病的防控作用Table 5 Control effects of 2,6-diisopropylphenol on F.oxysporum

表6 鄰苯二甲酸二丁酯對煙草尖孢鐮刀菌根腐病的防控作用Table 6 Control effects of dibutyl phthalate on F.oxysporum

同一時間不同濃度，鄰苯二甲酸二丁酯對煙草尖孢鐮刀菌根腐病的病情指數(shù)間有不同程度的差異性。在接菌7、14和21 d后，病情指數(shù)分別在43.33～70.00、50.00～71.11和55.00～72.44，其病情指數(shù)間差異極顯著（F5,12＝8.986，P＝0.001；F5,12＝5.626，P＝0.007；F5,12＝7.932，P＝0.002），其防治效果分別在7.35%～42.65%、9.86%～36.62%和10.66%～32.38%；接菌7、21 d后防治效果間差異顯著，接菌14 d后其防治效果間差異不顯著（F4,10＝12.753，P＝0.001；F4,10＝4.375，P＝0.027；F4,10＝3.256，P＝0.059）。在接菌7、14和21 d后，對照組的病情指數(shù)分別為75.55、78.89和81.33。總體上，鄰苯二甲酸二丁酯比 2,6?二異丙基苯酚對煙草尖孢鐮刀菌根腐病有一定防控效果，其控制效果在 7.35%～42.65%。

3 討論

本研究采用固體瓊脂培養(yǎng)法，對大蒜根系分泌物中的成分進行分析確定。經(jīng)GC?MS分析表明，大蒜根系分泌物為有機酸類、烷烴類、芳香族、酯類和雜環(huán)類化合物。其主要成分有鄰苯二甲酸二丁酯、乙酸丁酯、己二酸二辛酯、間叔丁基苯酚和對二甲苯等20種。這與周艷麗等[22]和吳曉婷等[25]結(jié)果類似，但不完全一致[22]。周艷麗等[22]對大蒜根系分泌物研究發(fā)現(xiàn)，瓊脂乙酸乙酯中主要成分為2,6?二叔丁基對甲酚、二烯丙基二硫化物、2,6?二異丙基苯酚和鄰苯二甲酸二丁酯4種化感物質(zhì)。造成這種結(jié)果的原因可能是由于大蒜品種不同、培養(yǎng)條件不同等原因所致。吳曉婷等[25]研究發(fā)現(xiàn)用沙培法、砂土培法和水培法培養(yǎng)大蒜時，其主要成分均含有鄰苯二甲酸二丁酯，本試驗瓊脂培養(yǎng)大蒜，其主要成分也含有鄰苯二甲酸二丁酯，但其他主要成分與本試驗相比均不相同，究其原因可能是由于大蒜品種、收集方法和培養(yǎng)條件的不同致使大蒜生理代謝出現(xiàn)差異，進而導致大蒜根系分泌物主要成分不同。

本研究發(fā)現(xiàn)大蒜根系分泌物對煙草尖孢鐮刀菌菌絲和孢子萌發(fā)均具有極顯著的抑制作用，特別對孢子萌發(fā)抑制效果更好，其抑制率達100.00%。這與湯東生等[26]及張瀟丹等[27]報道大蒜根系分泌物對石榴枯萎病菌、枯草芽胞桿菌、鐮刀菌均具有抑制作用結(jié)果相一致。大蒜根系分泌物主要成分對煙草尖孢鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發(fā)也具有顯著的抑菌效果，2,6?二異丙基苯酚濃度為5 mmol/L時，對煙草尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制率達 83.45%。以鄰苯二甲酸二丁酯對煙草尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)抑制效果較強，當其濃度高于0.5 mmol/L時，其孢子萌發(fā)抑制率在88.12%以上。其次依次為二烯丙基二硫、2,6?二叔丁基對甲酚和2,6?二異丙基苯酚。這與周寶利等[28]、關曄晴等[29]和劉海嬌等[30]報道的結(jié)果相一致。周寶利等[28]報道了鄰苯二甲酸二異丁酯茄子黃萎病菌菌絲有較好的抑制作用。關曄晴等[29]發(fā)現(xiàn)了2,6?二叔丁基對甲酚對番茄灰霉病菌、小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、辣椒枯萎病菌、梨黑斑病菌、小麥葉枯病菌六種病原菌均有不同程度的抑菌作用。劉海嬌等[30]報道了二甲基二硫醚、二甲基三硫醚和異硫氰酸烯丙酯三七根腐病菌均有較強的抑菌效果。

本研究通過對大蒜根系分泌物的組分分析，推測大蒜根系分泌物對煙草尖孢鐮刀菌根腐病菌的抑制作用可能與鄰苯二甲酸二丁酯、2,6?二叔丁基對甲酚、二烯丙基二硫和2,6?二異丙基苯酚4種化感物質(zhì)有關。通過功能鑒定，發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸二丁酯比2,6?二異丙基苯酚對煙草尖孢鐮刀菌根腐病有更強的防控作用，其控制效果在7.35%～42.65%。這說明大蒜具有防治煙草尖孢鐮刀菌根腐病中的潛在應用前景和煙田間套種大蒜對煙草主要病害防控作用。但關于大蒜根系分泌物及其主要成分對煙草尖孢鐮刀菌根腐病菌的生理生化及分子機制，有待進一步研究。

致謝：本試驗中煙草尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum由福建農(nóng)林大學生物農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室肖順教授提供，該試驗也得到福建農(nóng)林大學應用生態(tài)研究所儀器等支持、幫助，在此表示感謝！