人參杞黃顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定

李素凱，劉露，劉夢(mèng)燕，李萍，陳笑宇，李冬冬，楊錦竹※，王偉

（1.吉林大學(xué)，吉林 長春 130012;2.吉林省食品檢驗(yàn)所，吉林 長春 130012）

人參杞黃顆粒是以黃芪、人參和枸杞經(jīng)提取、濃縮、干燥得到的干膏粉碎后與糊精、甜蜜素和糖精鈉等輔料混合、以88%的乙醇制粒而得到的中藥制劑。黃芪為豆科植物膜莢黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch）Bge.]或蒙古黃芪[Astragalusmembranaceus（Fisch）Bge.Var.mongholicus（BgRe.）Hsio]的干燥根[1]。黃芪氣微，味微甜，性微溫，具有提高免疫、益氣保肝、托瘡利尿、減緩衰老、抗應(yīng)激及抗菌等廣泛作用?？墒秤每伤幱?，用于臨床和保健食品的研制。黃芪含有皂甙類、多糖類和黃酮類等多種化學(xué)成分[2]，研究表明，黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪的活性指標(biāo)成分，有相關(guān)研究也報(bào)道了毛蕊異黃酮苷的含量測定方法[3-8]，將毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為指標(biāo)去評(píng)價(jià)黃芪的文獻(xiàn)近400篇，通過閱讀就會(huì)發(fā)現(xiàn)藥典中黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定方法對(duì)黃芪藥材的含量測定效果較好，但是涉及到成分復(fù)雜的中藥制劑往往就不能夠達(dá)到想要的效果，而且目前約15%臨床使用的方劑中均含有黃芪，且多作為君藥使用[9]。如果使用藥典中的測定方法，由于毛蕊異黃酮葡萄糖苷出峰時(shí)間太早（約11 min），分離效果差，那么大多數(shù)復(fù)方中黃芪的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是沒辦法制定的，所以在此情況下會(huì)通過改變色譜條件以控制質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，目前我們常見的中藥制劑均采用企業(yè)自擬標(biāo)準(zhǔn)，而且至今也尚未形成國家統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[10,11]。為了有效控制和評(píng)價(jià)人參杞黃顆粒的質(zhì)量，我們通過改善藥典中黃芪的供試品處理方法和加大甲酸比例、加長流動(dòng)相大極性段洗脫時(shí)間等方法到達(dá)分離目的，從而建立人參杞黃顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

Acchrom S3000型高效液相色譜儀（華譜科技有限公司）；Amethyst C18-H柱（4.6 mm 250 mm，5m）色譜柱（蘇州賽分科技有限公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限責(zé)任公司）；Sartorius BT 25s電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試劑與材料

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)111920-201606，中國食品藥品檢定研究院）；人參杞黃顆粒為實(shí)驗(yàn)室自制（人參、黃芪、枸杞子按1:1.72:1.84比例配比，輔料為糊精、甜蜜素、糖精鈉。顆粒劑規(guī)格為8 g/袋，食用方法為每日1次，1袋/次）；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；甲酸（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；水為試驗(yàn)室雙蒸水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜填充柱：Amethyst C18-H柱（4.6 mm 250 mm，5m），流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0~50 min，12%A；50~80 min，12%~50%A）；檢測波長：260 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20L。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品1 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得到濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.1 藥典色譜條件 參考藥典“黃芪”項(xiàng)下毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定的色譜條件[12]。以Amethyst C18-H柱（4.6 mm 250 mm，5m）為色譜柱，乙腈為流動(dòng)相A，0.2%甲酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0~20 min，20%→40%A；20~30 min，40%A）；流速為1 mL/min；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為20L，進(jìn)行測定，得到結(jié)果見圖1。

2.2.3 黃芪陰性對(duì)照溶液的制備 取除黃芪以外的兩種藥材進(jìn)行提取干燥與輔料進(jìn)行制粒，將所得產(chǎn)品按“2.2.2”中方法進(jìn)行處理，得到陰性對(duì)照溶液。

2.3 優(yōu)化毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定色譜條件

2.2.2 供試品溶液的制備 取人參杞黃顆粒，磨成粉，過四號(hào)篩，精密稱定7 g，加入到圓底燒瓶中，量取甲醇50 mL加入并進(jìn)行稱定，放置于水浴鍋中加熱回流4 h，放冷，再進(jìn)行稱定，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，回收溶劑至干，得供試品殘?jiān)瑐溆?；將少量脫脂棉放在?nèi)徑為15 mm層析柱的出口處，加入乙醇處理好的D101大孔樹脂適量，高度約為20 cm，用蒸餾水沖洗大孔樹脂，直至流出的液體不呈白色渾濁且無味為止，將上述供試品殘?jiān)苡?0 mL蒸餾水中，完全轉(zhuǎn)移至層析柱上，用200 mL蒸餾水洗脫，棄去洗脫液，再用20%乙醇200 mL進(jìn)行洗脫，棄去洗脫液，最后用70%乙醇200 mL進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，用甲醇定容到10 mL量瓶中即得。

圖1 藥典色譜條件下兩種樣品的HPLC圖Fig.1 The HPLC chromatograms of 2 kinds of samples under the pharmacopoeia chromatogram condition

2.4.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備的方法對(duì)6份同一批次人參杞黃顆粒的樣品進(jìn)行處理，取各溶液20L，注入HPLC儀器中進(jìn)行測定，記錄峰面積。結(jié)果表明，6份人參杞黃顆粒的平行樣中所含的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量平均值為2.562 mg/g，RSD為0.757 6%（n=6），說明該方法的重現(xiàn)性良好。

5個(gè)村莊的規(guī)劃充分挖掘了地方特色，因地制宜。丹徒區(qū)世業(yè)鎮(zhèn)聘請(qǐng)了東南大學(xué)韓冬青設(shè)計(jì)大師團(tuán)隊(duì)，定位于“江島水鄉(xiāng)、健康之舟”，依托獨(dú)特的洲島生態(tài)環(huán)境，傳承并彰顯鄉(xiāng)居、河塘、田野共生的水鄉(xiāng)圩村肌理，構(gòu)建面向村民和游客的公共服務(wù)體系，培植健康農(nóng)業(yè)、創(chuàng)意農(nóng)業(yè)、參與式生產(chǎn)體驗(yàn)+度假等多種形式的大健康產(chǎn)業(yè)。韓冬青教授在全省特色田園鄉(xiāng)村建設(shè)試點(diǎn)工作推進(jìn)電視電話會(huì)議上將此規(guī)劃作為范例進(jìn)行了講解。

圖2 色譜條件優(yōu)化后和大孔樹脂洗脫后的供試品HPLC圖Fig.2 HPLC diagrams of test products after optimized chromatographic conditions and elution of macroporous resin

2.4 方法學(xué)考察

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將同一份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件在0、2、4、8、12、24 h時(shí)進(jìn)樣，測定峰面積，得到RSD為1.340 9%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖3 人參杞黃顆粒中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷的HPLC圖Fig.3 HPLC diagrams of Calycosin Glycoside in Renshen Qihuang Granules

在洛陽城里，從朝陽到夕陽，平時(shí)溫暖的風(fēng)，漸漸有了寒意，平時(shí)那些充滿活力的翠綠葉子，也變成了經(jīng)歷人間滄桑的枯黃葉子，以往繁華熱鬧的街道也變得冷清了，洛陽城里一切都變了。

2.4.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取6份人參杞黃顆粒粉末，計(jì)算顆粒粉末中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，再將等量毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品加入到6份粉末中，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液處理方法進(jìn)行制備，計(jì)算各樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷實(shí)測值，計(jì)算平均回收率為99.26%，RSD為0.81%（n=6）（表1），表明該測定方法回收率良好。

2.4.2 線性關(guān)系考察 將“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液用甲醇逐步稀釋，得到濃度分別為0.004mg/mL、0.008mg/mL、0.012 mg/mL、0.016 mg/mL、0.020 mg/mL及0.024 mg/mL的一系列毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液，依次進(jìn)樣，記錄得到的峰面積并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，毛蕊異黃酮葡萄糖苷回歸方程為y=55201x-6.0087（r=0.9996），線性范圍為0.004~0.024 mg/mL，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在此濃度范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系。

2.4.1 專屬性考察 將“2.2”項(xiàng)下各個(gè)溶液通過微孔濾膜過濾后注入自動(dòng)液相儀器中進(jìn)行測定，得到色譜圖見圖3：

2.3.2 藥典色譜條件優(yōu)化 經(jīng)過查閱資料并進(jìn)行多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0~50 min，12%A；50~80 min，12%~50%A），檢測波長為260nm，柱溫為25℃，流速為1.0mL/min的色譜條件時(shí)峰位置的前后色譜峰對(duì)其干擾小，但是其分離度未能達(dá)到要求。所以將供試品過大孔樹酯進(jìn)行洗脫，除雜，使其分離度達(dá)到要求。兩種情況色譜圖見圖2。因此，確定該條件為毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定的優(yōu)選色譜條件。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 將“2.2.2”項(xiàng)下的供試品溶液，按照時(shí)間順序連續(xù)進(jìn)6次，每次進(jìn)樣20L，記錄峰面積，求得峰面積的RSD值為0.7449%（n=6），表明儀器精密度良好。

另外，為了防止鼻子嗆水，女選手們都用一只肉色的夾子夾住兩個(gè)鼻孔，因此，從遠(yuǎn)處望去，她們表演時(shí)鼻子特別尖長。表演一結(jié)束，她們趕緊將夾子取下，這不光是為了好看，恐怕夾得也難受了吧。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of recovery tests

2.4.7 樣品含量測定 從3批人參杞黃顆粒中各取3個(gè)平行樣，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備的方法進(jìn)行處理，分別吸取20L，注入HPLC儀器中進(jìn)行測定，3個(gè)批次平行樣平均值分別為2.688 mg/100g、2.668 mg/100g、2.630 mg/100g。3批含量RSD值為1.494 7%。表明該品毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量穩(wěn)定，均一性良好。

[36]Royal Government of Cambodia,“Political Platform of Royal Government of Cambodia of the Fifth Legislature of National Assembly”, https://www.cambodianembassy.org.uk/f_home/PDF/Political_Platform_Royal_Government_Cambodia_5th.pdf, 2013年9月。

陳友益(2018)研究了影響供應(yīng)鏈金融發(fā)展的因素。在整個(gè)鏈中上下游、多級(jí)企業(yè)存在一些操作、法律、市場等的風(fēng)險(xiǎn)。會(huì)影響其發(fā)展。

3 討論

在研究中，采用藥典方法得到的毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜峰基線不能分離，可能是由于中藥制劑的成分復(fù)雜，雜質(zhì)干擾作用大[13]。通過多次實(shí)驗(yàn)摸索，梯度洗脫為（0~50 min，12%A；50~80 min，12%~50%A），流速為1.0 mL/min時(shí)，能夠使出峰位置受到的干擾最小，但是由于前面的雜質(zhì)太多使得毛蕊異黃酮葡萄糖苷的分離效果達(dá)不到預(yù)期，我們又進(jìn)一步將供試品溶液通過大孔樹酯進(jìn)行洗脫，處理得到新的供試品溶液，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷與雜質(zhì)峰能夠有效分離，分離度＞1.5，因此，確定該條件為毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定的優(yōu)選色譜條件。后對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定方法專屬性較好，陰性無干擾，分離度能達(dá)到要求，重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性和回收率等均符合要求，可用于人參杞黃顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制。

之后實(shí)驗(yàn)遇到雜質(zhì)成分過多的情況，可優(yōu)先考慮改善前處理方法，再進(jìn)行色譜條件優(yōu)化，以減少摸索時(shí)間。此方法條件下毛蕊異黃酮葡萄糖苷出峰位置前后有一段范圍的無干擾區(qū)域，所以其他黃芪的中藥制劑可根據(jù)此方法通過增大和減小流速來使出峰位置合適，希望能對(duì)以后的實(shí)驗(yàn)研究有所幫助。