基于脾氣虛模型的四君子湯藥理作用研究進展

闞鴻，曲帥

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；3.吉林省生物研究所，吉林 長春 130012）

脾胃學說是中醫(yī)脾臟象理論的重要組成部分，傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為脾為五臟六腑之一，是氣血生化之源，后天之本，主司運化、主統(tǒng)血、主肌肉四肢?，F(xiàn)代理論[1,2]認為脾的生理功能可能涉及到3個方面:（1）直接方面，主要是包括消化系統(tǒng)及能量代謝直接相關(guān)的一切器官系統(tǒng)；（2）間接方面，主要是指肌肉組織、血液系統(tǒng)和免疫功能；（3）調(diào)節(jié)方面，主要與神經(jīng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)有關(guān)。在各種疾病因素作用下，脾運化功能失常時，可在臨床上表現(xiàn)為脾氣虛證，即面黃食少、泄瀉或便秘、神疲乏力、少氣懶言、舌淡苔白及脈虛弱等現(xiàn)象，在現(xiàn)代醫(yī)學中則體現(xiàn)在胃腸道的消化吸收功能失調(diào)；神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌和運動等系統(tǒng)調(diào)節(jié)紊亂；營養(yǎng)物質(zhì)代謝低下的虛損性疾病狀態(tài)，表現(xiàn)為多系統(tǒng)和多器官功能衰弱的綜合病理變化[3]。

近年來，脾氣虛理論、脾氣虛癥候本質(zhì)及治療隨著中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展得到進一步深入地研究。健脾益氣是中醫(yī)治療脾氣虛證的基本方法，臨床上最經(jīng)典的補脾益氣方劑為四君子湯。四君子湯出自宋代《太平惠民合劑局方》，由人參、白術(shù)、茯苓和炙甘草4味藥組成。方中人參大補脾胃之氣；白術(shù)助君藥人參燥濕健脾；茯苓健脾，滲濕利水；炙甘草和中益氣，四藥相輔，具有益氣健脾之功效，臨床上療效顯著。目前，四君子湯已經(jīng)成為治療脾氣虛癥的研究熱點，其在器官水平、細胞水平和分子水平相關(guān)的藥理藥效研究也取得了一定的成果。因此本文從上述脾的3個方面生理功能，就近年來基于脾氣虛證中四君子湯的藥理作用相關(guān)研究進行綜述，以期為四君子湯以及治療脾氣虛證的相關(guān)研究提供參考。

1 脾氣虛證模型的建立

動物模型是表征中醫(yī)癥候模型、探究中醫(yī)理論及中藥藥效的主要手段。脾氣虛模型一般采用大鼠進行建模，其中以雄性Wistar大鼠，雄性SD大鼠最為常見，也有使用BALB/c雄性小鼠、昆明雌性小鼠、ICR小鼠、北京鴨和比格犬等動物進行造模[4,5]。造模方法主要有單因素造模法和復(fù)合造模法。單因素造模法即采用瀉下方劑及利血平等藥物或通過飲食、力竭法等單一方法刺激模型動物產(chǎn)生脾氣虛證；而復(fù)合造模法多利用藥物、飲食結(jié)合勞倦過度等方法聯(lián)合制備脾氣虛證，由于其癥狀更貼近于臨床、重復(fù)性好，因此成為目前脾氣虛證的主要造模方法。另外手術(shù)法和基因小鼠造模法也是研究脾氣虛癥的模型方法，但由于技術(shù)水平要求較高，目前沒有得到廣泛應(yīng)用[6]。

造模成功的標準主要以《中藥治療脾虛證的臨床研究指導(dǎo)原則》《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》《大鼠脾虛證的內(nèi)分泌研究》中脾氣虛的宏觀標準為指標進行判斷，主要包括便形質(zhì)軟或溏??；體重減輕、消瘦；食量減少；弓背，扎堆、蜷縮或瞇眼；毛無光澤，肛溫無明顯變化；游泳耐力下降等多項指標。隨著對脾氣虛證的深入研究，一些微觀指標例如木糖吸收率、免疫相關(guān)指標和血常規(guī)等指標也成為判斷模型成功的補充證據(jù)[6]。

2 脾氣虛證藥理作用研究進展

2.1 四君子湯對脾氣虛證消化系統(tǒng)及能量代謝方面的調(diào)節(jié)作用

中醫(yī)理論中脾最根本的本質(zhì)主要體現(xiàn)在物質(zhì)代謝和機體能量轉(zhuǎn)換。脾氣虛證最典型的病癥為胃腸功能失調(diào)紊亂，表現(xiàn)為消化吸收功能減弱等癥狀。四君子湯可從保護胃腸黏膜、調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)的信號通路和維護胃腸道微生態(tài)等多方面對脾氣虛證進行改善治療。

脾氣虛證大鼠胃腸黏膜上皮會出現(xiàn)壞死和脫落，上皮細胞內(nèi)含有大量自噬泡、胃腺和腸腺萎縮及黏膜下層水腫等現(xiàn)象[7]，因此，細胞凋亡對黏膜上皮、腺體的損傷、再生和修復(fù)有很大的影響，在胃黏膜防御屏障的第5級防線中起重要作用[8]。研究表明，多胺對胃腸黏膜屏障功能具有重要的調(diào)控作用[9,10]，四君子湯可在分子水平上調(diào)精胺合酶mRNA，提高脾氣虛證大鼠胃、腸黏膜多胺的含量，進一步提高胃黏膜緊密蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-3、粘附連接蛋白E-cadherin和-catenin的表達，降低大鼠胃黏膜caspase-3含量，抑制胃腸黏膜細胞凋亡，同時提高大鼠小腸黏膜三葉因子（TFF3）蛋白表達，促進受損胃腸黏膜的增殖與修復(fù)，增強胃腸黏膜的防御能力[11-15]。

在消化系統(tǒng)信號通路的研究上，陳玉龍等[16]發(fā)現(xiàn)四君子湯可恢復(fù)脾氣虛大鼠唾液淀粉酶的分泌；進一步對脾氣虛證大鼠腮腺中的VIP-cAMP信號通路研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯可通過提高血管活性腸肽（VIP）含量，恢復(fù)cAMP和cAMP依賴蛋白激酶（protein kinase A，PKA）的活性，并提高PKA下游產(chǎn)物SNAP-23和VAMP-8蛋白表達，改善唾液淀粉酶的分泌障礙。四君子湯還可通過干預(yù)CNP-NPRB-cGMP信號通路，使大鼠血清中的C型鈉尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP）含量減少，降低位于胃竇平滑肌細胞膜上的B型鈉尿肽受體（NPRB）的表達量，從而降低cGMP生成量，增強平滑肌自主收縮能力和大鼠胃排空能力；鈣調(diào)素-肌球蛋白輕鏈激酶（CaM-MLCK）信號系統(tǒng)是胃腸道平滑肌細胞收縮舒張的核心步驟，在CaM-MLCK通路中，四君子湯可降低平滑肌組織CaM、MLCK表達量和Mg2+-ATPase活性，舒緩胃平滑肌的高張力，間接促進胃腸動力[17,18]。另外，段永強等[19]研究表明，四君子湯可通過降低脾氣虛證大鼠血清、小腸中的P物質(zhì)/膽囊收縮素（substance P/cholecystokinin，SP/CCK）含量，同時降低小腸MAPK14 mRNA相對表達量，調(diào)整MAPK信號通路，改善小腸蠕動速度，起到減少腹瀉的作用。由于脾氣虛證涉及多臟器、多系統(tǒng)，因此田茸等[20]將與機體多系統(tǒng)多臟器生理功能密切相關(guān)的鈣調(diào)蛋白信號傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因鈣調(diào)蛋白/Ⅱ型鈣調(diào)蛋白激酶（calmodulin/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaM/CaMKⅡ）的表達作為檢測指標，從基因和蛋白水平對脾氣虛證癥候?qū)嵸|(zhì)進行客觀化研究，發(fā)現(xiàn)四君子湯具有抑制脾氣虛證大鼠小腸組織中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達、促進脾氣虛證大鼠腦組織中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達的作用，揭示了四君子湯可通過CaM信號傳導(dǎo)途徑作用于脾氣虛證中的腦腸微環(huán)境中，達到治療的作用。

脾氣虛證會引起腸道微生態(tài)失衡，菌群失調(diào)[21]。四君子湯可顯著升高腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌菌量，調(diào)節(jié)腸道菌群的生長，使其產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，進而達到抑制致病菌和營養(yǎng)維持腸道黏膜防御屏障的功能[22]。除此之外，運用腸桿菌基因間重復(fù)一致序列-聚合酶鏈式反應(yīng)（ERIC-PCR）技術(shù)、動態(tài)追蹤分析及16SrDNA測序法和指紋圖譜法等現(xiàn)代技術(shù)分析腸道菌群多樣性變化后，發(fā)現(xiàn)四君子湯還可以通過提高腸道菌群的多樣性，營養(yǎng)腸道黏膜，增強腸道黏膜防御能力[23,24]。

劉友章[25]在80年代提出了脾主肌肉與線粒體有密切的關(guān)系，并報道了脾氣虛病人胃黏膜壁細胞線粒體數(shù)目減少、超微結(jié)構(gòu)受損和能量代謝障礙，提出了中醫(yī)脾-線粒體相關(guān)學說，為脾氣虛的本質(zhì)研究奠定了基礎(chǔ)。研究證實[26,27]脾氣虛證的病人及相關(guān)動物模型中動物胃黏膜中的主細胞和壁細胞、骨骼肌、心肌、十二指腸和肝細胞線粒體均可出現(xiàn)數(shù)目減少、腫脹、基質(zhì)變淺、空泡變淡和嵴斷裂等超微結(jié)構(gòu)的改變，經(jīng)四君子湯治療后，脾氣虛病癥中的線粒體可以得到修復(fù)，形態(tài)和結(jié)構(gòu)得到改善。

何麗娟等[28]采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測大鼠胃組織cAMP及ATP活性，分別采用實時熒光定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法（western blot）檢測PKA、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cyclic-AMP response binding protein，cREB）、糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase，GP）、磷酸化酶激酶（phosphorylase kinase，PHK）mRNA和蛋白的表達，結(jié)果表明四君子湯均可增強脾氣虛大鼠上述指標的表達，因此推測四君子湯治療脾氣虛證可能是通過激活胃cAMP-PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使cREB以及GP磷酸化，加速糖原酵解，從而產(chǎn)生能量。另外在腸道中，四君子湯通過調(diào)節(jié)小腸黏膜能量代謝功能相關(guān)酶琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）活性和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性，改善脾氣虛模型大鼠尿木糖排泄率，提高小腸黏膜ATP的含量，來修復(fù)脾氣虛證中的能量代謝障礙[29,30]。

2.2 四君子湯對脾氣虛證肌肉、血液及免疫方面的調(diào)節(jié)作用。

“脾氣虛四肢不用”是脾氣虛證的癥候之一，表現(xiàn)出倦怠、乏力、納呆等脾氣虛癥狀。劉文俊等[31]認為“脾氣虛四肢不用”可能與AMPK/ULK1途徑激活的線粒體自噬水平提高不足有關(guān)，進一步通過對股四頭肌線粒體自噬研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯可減少線粒體過度自噬，降低線粒體的代謝副產(chǎn)物活性氧（reactive oxygen species,ROS）的累積，并顯著降低股四頭肌細胞凋亡水平[32]。對脾氣虛模型大鼠的骨骼肌線粒體研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增殖物激活受體-共激活因子-1（peroxisome proliferatoractivated receptor-coactivator-1,PGC-1）調(diào)控的信號通路異常，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異常，呼吸鏈酶活性降低，線粒體氧化磷酸化下降，機體生物合成、能量代謝障礙，四君子湯可通過提高大鼠骨骼肌線粒體氧化磷酸化水平，修復(fù)骨骼肌線粒體損傷，同時升高大鼠骨骼肌線粒體超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和鈉-鉀ATP酶（Na+-K+-ATPase）活性，降低丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量，減輕線粒體氧化損傷，調(diào)節(jié)機體能量代謝[33,34]。通過采用激光共聚焦技術(shù)檢測骨骼肌組織［Ca2+］i（細胞內(nèi)Ca2+濃度）濃度發(fā)現(xiàn)，四君子湯可以升高［Ca2+］i濃度，同時提高脾氣虛證大鼠骨骼肌組織能量代謝相關(guān)酶Na+-K+-ATPase和鈣-鎂ATP酶（Ca2+-Mg2+-ATPase）活性，恢復(fù)骨骼肌組織Ca2+/CaM-CaMKⅡ信號通路關(guān)鍵分子CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白正常表達[35]。

脾氣虛的免疫學本質(zhì)主要體現(xiàn)在紅細胞C3b受體水平下降，T淋巴細胞亞群比例失衡，淋巴細胞分化能力下降甚至處于抑制狀態(tài)，同時細胞因子表達異常，巨噬細胞功能受到抑制，免疫器官脾臟和胸腺的超微結(jié)構(gòu)破壞[36]。

四君子湯能激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，提高外周血中T淋巴細胞百分率[37]，明顯增加胃黏膜和外周血CD4+T細胞數(shù)量，降低CD8+T細胞的數(shù)量，使CD4+/CD8+比值升高，調(diào)節(jié)T淋巴細胞亞群的比例，增強胃黏膜免疫功能，防治慢性胃病的發(fā)生和發(fā)展[38,39]；同時增加胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，提高機體免疫功能。針對脾氣虛證細胞因子的表達異常，有研究表明四君子湯還可以調(diào)節(jié)小腸組織中的細胞因子IL-1、IL-6、IL-2、IL-4和IL-8水平，提高體液免疫中的免疫球蛋白IgG、IgM和IgA，通過平衡參和細胞與體液免疫的細胞因子免疫應(yīng)答，發(fā)揮小腸黏膜免疫防御和抗炎的作用[5,16,38,40]。趙寧等[41]研究表明四君子湯可以調(diào)節(jié)脾氣虛癥大鼠空腸黏膜內(nèi)的細胞因子TNF-和TNF-的含量，糾正空腸內(nèi)細胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡，提高免疫抑制作用，增強機體的抵抗力和防御能力，使脾氣虛證模型大鼠免疫能力趨向于正常大鼠。

2.3 四君子湯對脾氣虛證神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及其他方面的作用。

通常消化道系統(tǒng)黏膜損傷患者體內(nèi)會出現(xiàn)5-羥色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）代謝異常，表現(xiàn)為血漿中5-HT、5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindole acetic acid,5-HIAA）增高，尿中5-HIAA排泄降低，四君子湯可抑制血漿中5-HIAA升高，調(diào)節(jié)胃腸運動，作用于攝食中樞促進進食[42]。馮曉帆等[43]采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）和ELISA的技術(shù)檢測了大鼠下丘腦及海馬中神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫共同識別的信號物質(zhì)P物質(zhì)的含量以及mRNA的表達，結(jié)果顯示四君子湯治療組可顯著升高大鼠下丘腦和海馬中的P物質(zhì)含量，提示四君子湯可通過調(diào)整脾氣虛型大鼠腦區(qū)的P物質(zhì)的量，起到調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能的作用[44]。

內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的胃腸激素與生物體的消化機能息息相關(guān)，可以促進胃腸運動，增加消化能力。例如神經(jīng)肽-內(nèi)啡肽（-EP）參與胃腸運動、胃和胰腺的分泌、攝食行為和糖代謝等活動，具有應(yīng)激適應(yīng)和減輕應(yīng)激所致中樞及外周病理損害的作用[45,46]；內(nèi)原性縮血管活性肽神經(jīng)肽（neuropeptide Y,NPY）在體內(nèi)可刺激食欲、增強營養(yǎng)物質(zhì)吸收，是胃腸道體液和電解質(zhì)分泌的強抑制劑[47,48]；降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）是廣泛分布于胃腸部位的生物活性肽，可在胃黏膜受損時大量釋放，提高局部血流量，修復(fù)黏膜，還可以同時減少胃酸分泌，減輕受損黏膜的刺激[49,50]。四君子湯一方面可促進生長抑素（somatostatin,SS）、膽囊收縮素（cholecystokinin,CCK）、胃動素（motilin,MTL）、胃泌素（gastrin,GAS）、VIP和醛固酮的分泌，加速胃排空[51-54]；另一方面，四君子湯通過調(diào)節(jié)血漿-EP的含量，參與機體全身應(yīng)激的調(diào)節(jié)，應(yīng)激時起到保護急性胃黏膜損傷的作用，同時提高脾氣虛型大鼠血漿中的NPY含量，刺激食欲，改善CGRP的異常釋放，緩解脾氣虛證的胃腸功能和代謝紊亂[55]。

此外，四君子湯可通過改善胃黏膜血流量，升高血清SOD含量、降低血清MDA的含量[56]，恢復(fù)與增強體內(nèi)抗氧化酶防御系統(tǒng)能力，增強機體清除自由基的能力，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，實現(xiàn)對脾氣虛型慢性萎縮性胃炎的治療作用[57]。甄畢賢等[58]通過主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘運用代謝組學技術(shù)對脾氣虛型大鼠進行分析，發(fā)現(xiàn)四君子湯可以通過調(diào)整脾氣虛大鼠的脂類代謝、氨基酸代謝等多種代謝通路來完成其對脾氣虛證的治療作用。

3 總結(jié)與展望

脾氣虛證的本質(zhì)是四君子湯發(fā)揮治療作用的理論基礎(chǔ)，四君子湯治病機制的探討也輔助認清脾氣虛證的本質(zhì)，二者相輔相成，相互促進。目前脾氣虛證的模型建立成功與否多數(shù)依靠外觀觀察及行為學指標進行判斷，還不能夠完全模擬臨床上的癥狀。隨著脾氣虛證的本質(zhì)的不斷深入研究，脾氣虛證模型可通過更客觀的檢測性指標來進行判斷和完善。目前，四君子湯的藥理作用研究主要集中在對消化系統(tǒng)及能量代謝方面上，其他方面例如對免疫系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，治療脾氣虛證的相關(guān)通路和機制需要進一步挖掘和完善。中藥復(fù)方雖然應(yīng)用有上千年的歷史，但是由于其化學成分復(fù)雜，作用于多器官、多靶點，組方藥物之間具有高度協(xié)同性，因此需要不斷深入挖掘其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，明確其治療疾病的機制與靶點，為推廣傳統(tǒng)方劑、開發(fā)利用中藥新藥及促進中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展奠定強有力的理論基礎(chǔ)。