培元通腦膠囊重金屬生物利用度研究及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

李艷華，趙嘯虎，張紅梅

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院日間觀察病房，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林省藥品檢驗(yàn)所，吉林 長(zhǎng)春 130033；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院藥學(xué)部，吉林 長(zhǎng)春 130021）

中成藥所含重金屬成分的作用具有兩重性，既可作為藥物的有效成分，又會(huì)對(duì)人體有一定的毒性，如朱砂中的汞和雄黃中的砷等。例如在化風(fēng)丹中5種常見金屬元素中，日劑量的Pb元素少量超標(biāo)，Hg元素和As元素超標(biāo)較多[1]。由于化風(fēng)丹處方中含有朱砂和雄黃，Hg元素和As元素分別為其主要成分，且實(shí)驗(yàn)中含量測(cè)定樣品是經(jīng)硝酸、雙氧水消解制備而成，制備條件不同于人體消化環(huán)境，結(jié)果中得到的金屬離子并不完全是人體吸收的部分，故不能認(rèn)為人體吸收重金屬含量超標(biāo)。中藥中的重金屬含量與其在體內(nèi)的吸收含量是不同的，所含的重金屬是否會(huì)引起中毒取決于吸收的量，而不完全是其含量[2]。口服給藥時(shí)，藥物溶出后被人體吸收（生物可利用部分）才可能產(chǎn)生毒性，如果測(cè)定總濃度而不考慮生物利用度，會(huì)高估重金屬對(duì)人體造成的健康風(fēng)險(xiǎn)[3]。

由于重金屬具有不易降解性、食物鏈傳遞性和積累性，所以動(dòng)物類藥材重金屬超標(biāo)率較植物類藥材更高[4]。培元通腦膠囊由制何首烏、熟地黃、天冬、龜甲（醋制）、鹿茸、全蝎、燙水蛭和地龍等中藥精制而成，既包含了植物藥也包含了動(dòng)物藥。植物藥重金屬污染與藥材生長(zhǎng)的環(huán)境條件有關(guān)，如大氣、土壤、水、農(nóng)藥和化肥的施用等[5]。動(dòng)物藥重金屬污染的原因，一方面是動(dòng)物吃了受污染的植物藥，藥材含有有害重金屬，在生物體內(nèi)容易蓄積，半衰期長(zhǎng)，不易分解，在體內(nèi)慢慢富集，造成重金屬超標(biāo)；另一方面與動(dòng)物藥材的遺傳特性有關(guān)，即對(duì)重金屬元素的主動(dòng)吸收和富集。動(dòng)物藥的生長(zhǎng)環(huán)境易受重金屬的污染，特別是水蛭和地龍，具有較強(qiáng)的重金屬攝取和蓄積能力[6]。根據(jù)人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）頒布的Q3D對(duì)重金屬元素雜質(zhì)的潛在毒性進(jìn)行評(píng)估，提取重金屬元素雜質(zhì)分類要求和殘留限度規(guī)定了各金屬元素的允許日暴露量[7]，其中1類重金屬元素因具有明顯毒性被評(píng)估為高風(fēng)險(xiǎn)元素，1類元素有砷（As）、鉛（Pb）、汞（Hg）和鉻（Cd）4種元素，因?yàn)橹兴幉纳L(zhǎng)和炮制過(guò)程中很容易富集銅（Cu）元素，所以本研究將Cu元素加入檢測(cè)。鑒于目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)對(duì)該藥品重金屬及有害物質(zhì)檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道，本研究采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS），測(cè)定培元通腦膠囊中5種金屬元素含量并計(jì)算生物利用度，對(duì)培元通腦膠囊進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，本研究的總重金屬和可溶性重金屬的含量比較研究對(duì)中成藥的安全應(yīng)用具有重要意義。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 7700 series ICP-MS（美國(guó)Agilent公司）；MARS 5微波消解儀（美國(guó)CEM公司）；XS105DU型分析天平（瑞士梅特勒公司）；Milli-Q純水儀器（法國(guó)Millipore公司）；DSHZ-300A恒溫振蕩器（天津市天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

培元通腦膠囊（江南羚銳制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20000022，批號(hào)：1908112，1909061，1910301）規(guī)格為每粒裝0.6g。Cu單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（08615-17123，1 000g L-1）、As單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（08611-18021，1 000g L-1）、Cd單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（08612-16011，1 000g L-1）、Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（08617-17032，1 000g L-1）、Pb單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（08619-18031，1 000g L-1），以上元素標(biāo)準(zhǔn)溶液均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；金（Ar）元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（17725，1 000g mL-1）購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；內(nèi)標(biāo)溶液為鉍（Bi）、鍺（Ge）、銦（In）標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液（23-170 VYY2，100 mg L-1）購(gòu)自安捷倫公司，硝酸（優(yōu)級(jí)純，美國(guó)默克公司），胃蛋白酶（BCBZ7879，SIGMA），胰蛋白酶（SLBW1439，SIGMA）。

2 方法

2.1 ICP-MS工作條件

等離子功率：1 450 W；等離子氣流速：15.0 L min-1；載氣流速：0.9 L min-1；霧化氣流速：0.85 L min-1；預(yù)混室溫度：2℃。其中Hg和Pb的內(nèi)標(biāo)為Bi，Cd的內(nèi)標(biāo)為In，Cu和As的內(nèi)標(biāo)為Ge。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

表1 實(shí)驗(yàn)用重金屬標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度Table 1 The standard solution concentration of heavy metals for the experiment

2.3 培元通腦膠囊中重金屬含量待測(cè)液的預(yù)制備

精密稱取培元通腦膠囊內(nèi)容物0.5 g，置于消解管內(nèi)，加硝酸5 mL，雙氧水1 mL，混勻，置于微波消解儀內(nèi)消解[1]。完成消解后，混合物冷卻至室溫，置于100 mL容量瓶中，將消解管用少量水洗滌3次并合并于容量瓶中，加入Ar元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1g mL-1）200L，用水稀釋至刻度，充分搖勻，即得。

除不加Ar元素標(biāo)準(zhǔn)溶液外，同法制備試劑空白溶液。

2.4 體外消化實(shí)驗(yàn)

體外消化實(shí)驗(yàn)方法主要參考2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》第四部0921崩解時(shí)限檢查法中附錄來(lái)配制模擬胃、腸消化液[8]。

精密稱取培元通腦膠囊內(nèi)容物0.5 g，置于50 mL離心管中與20 mL模擬胃液混合并震蕩1 min。混合物用恒溫振蕩器以250 r min-1在37℃振蕩4 h，后以4 000 g min-1離心5 min，用0.45m濾膜過(guò)濾上清液15 mL，置于4℃冰箱中，后采用ICP-MS分析待測(cè)液中的金屬含量，即為人工胃液中溶出含量。殘?jiān)c20 mL模擬腸液混合，采取與模擬胃液相同的方法震蕩4 h，萃取，測(cè)定。

2.5 方法的線性關(guān)系、檢出限

以在線內(nèi)標(biāo)法對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白溶液（2%硝酸溶液）進(jìn)行檢測(cè)。以元素的質(zhì)量濃度（x，ng mL-1）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各元素的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，并以空白溶液所產(chǎn)生的信號(hào)響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（）的3倍所對(duì)應(yīng)的待測(cè)元素質(zhì)量濃度作為儀器的檢出限。

2.6 精密度試驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)曲線第3點(diǎn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，各元素含量RSD在0.90%~1.71%之間，表明儀器精密度較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號(hào)：1910301）0.5 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于放置0、2、6、10、12、24 h時(shí)測(cè)定樣品含量。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號(hào)：1910301）0.5 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行試驗(yàn)6份。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取培元通腦膠囊（批號(hào)：1910301）樣品0.5g，加各測(cè)定元素相應(yīng)的對(duì)照品溶液適量，按照“2.3”中的步驟制備供試品溶液，分別平行制備6份。

2.10 健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

本研究采用美國(guó)環(huán)保署（US EPA）發(fā)布的目標(biāo)危害熵值法（THQ）[9]對(duì)人群進(jìn)行潛在健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。如果THQ＞1，則暴露人群有健康風(fēng)險(xiǎn)；如果THQ≤1，則沒(méi)有明顯的健康風(fēng)險(xiǎn)。THQ值越高表明污染物對(duì)人體健康的危害越大。本文根據(jù)美國(guó)EPA的導(dǎo)則和相關(guān)數(shù)據(jù)確定了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估計(jì)算所涉及的參數(shù)以計(jì)算THQ。

式（1）中，C為培元通腦膠囊在體外模型中重金屬質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg kg-1），EF（exposure frequency）表示平均每年暴露于含重金屬培元通腦膠囊的頻率（治療周期為30~84 d[10,11]，取最大值約84 d/年），ED（exposure duration）表示平均暴露含重金屬培元通腦的年數(shù)，F(xiàn)IR（food ingestion rate）表示含有重金屬培元通腦膠囊的日攝入量，WAB（average body weight）表示平均體重，TA（average exposure time for non-carcinogens）為平均接觸含重金屬藥物的時(shí)間，RFD（oral reference dose）代表非致癌污染物的安全劑量[9,12-14]。

當(dāng)存在多個(gè)非致癌物質(zhì)同時(shí)暴露時(shí)，不考慮相互作用，將每種污染物的非致癌風(fēng)險(xiǎn)相加，得到總危害商值（HI）。當(dāng)HI＜1時(shí)，表示非致癌風(fēng)險(xiǎn)較??；當(dāng)HI≥1時(shí)，表示非致癌風(fēng)險(xiǎn)較大。

3 結(jié)果與討論

3.1 線性和檢出限

表2結(jié)果表明，5種金屬線性關(guān)系良好，符合分析要求。

表2 Cu、As、Cd、Hg和Pb 5種金屬元素線性方程、線性范圍和檢出限Table 2 The linear equation,linear range and detection limit of five heavy metals including Cu,As,Cd,Hg and Pb

3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

Cu、As、Cd、Hg和Pb的RSD分別為0.95%、1.21%、1.33%、1.54%和1.85%，表明5種元素在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

Cu、As、Cd、Hg和Pb的RSD分別為0.95%、1.01%、1.07%、1.58%和1.66%，表明本方法重復(fù)性較好。

3.4 加樣回收率試驗(yàn)

測(cè)定回收率在90.60%~101.17%之間，各元素的RSD在0.67%~3.88%之間，表明方法準(zhǔn)確性較好，見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result of the recovery test （n=6）

3.5 培元通腦膠囊中重金屬總量及生物利用度

取3批次樣品，測(cè)定樣品中、胃液中和腸液中各金屬的含量，每個(gè)樣品平行測(cè)定3份，計(jì)算各金屬總量及生物利用度，結(jié)果見表4。

表4 培元通腦膠囊中重金屬總量及生物利用度Table 4 The total content and bioaccessibility of heavy metals in Peiyuan Tongnao Capsules

由表4可以看出，重金屬生物可給量低于總重金屬總量，說(shuō)明重金屬（Cu、As、Cd、Hg和Pb）在模擬人工胃腸液中不能完全被溶出吸收。重金屬生物可給量均值由高到低依次為Hg（3.49 mg kg-1）＞As（3.11mg kg-1）＞Cu（1.82mg kg-1）＞Cd（0.32mg kg-1）＞Pb（0.26 mg kg-1），其中Cu的生物利用度為0.61~0.70，平均值為0.65；As元素為0.41~0.53，平均值為0.46；Cd元素為0.42~0.58，平均值為0.49；Hg為0.40~0.43，平均值為0.41；Pb元素為0.51~0.53，平均值為0.52。模擬人工胃液中各重金屬的生物利用度大于其在模擬人工腸液中，表明重金屬在胃液中較易溶出而在腸液中溶出較少。同一重金屬在不同批次樣品中生物利用度有一定的差異，可能和培元通腦膠囊中重金屬的總量及存在的形態(tài)有關(guān)。

根據(jù)培元通腦膠囊（0.6 g 27粒）說(shuō)明書，用法用量為每次3粒，每日3次，計(jì)算每日用量中含有Cu元素總量15.23g，生物可給量9.83g；As元素總量36.72g，生物可給量16.79g；Cd元素總量3.56g，生物可給量1.73g；Hg元素總量46.00g，生物可給量18.85g；Pb元素總量2.65g，生物可給量1.40g。參照FAO/WHO（JECFA）推薦的有害元素限量標(biāo)準(zhǔn)[15]，日劑量總量Hg元素超標(biāo)，而生物可給量各元素均符合規(guī)定，說(shuō)明培元通腦膠囊經(jīng)過(guò)人工胃液和腸液模擬體內(nèi)消化環(huán)境進(jìn)行處理后，重金屬生物可給量明顯下降，遠(yuǎn)低于藥物總重金屬含量，5種重金屬元素生物可給量均處于安全范圍內(nèi)，因此不能單純以制劑中總重金屬量作為評(píng)價(jià)中成藥的毒性限度指標(biāo)。

3.6 重金屬風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

根據(jù)公式（1）計(jì)算THQ，求和值為HI，結(jié)果見表5。HI＜1，說(shuō)明培元通腦膠囊中重金屬對(duì)接觸人群健康影響不明顯。此外，HI生物可給量＜HI總量，表明用生物可給量評(píng)估重金屬對(duì)人體危害小于以總重金屬計(jì)。

表5 培元通腦膠囊的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估Table 5 The risk assessment of Peiyuan Tongnao Capsules

3.7 優(yōu)勢(shì)與不足

目前對(duì)中藥重金屬生物利用度研究較少，經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)，有學(xué)者做了野生青蒿[2]和柴胡飲片[12]的重金屬生物利用度研究，但目前還沒(méi)有中成藥制劑生物利用度研究的報(bào)道。作者研究化風(fēng)丹中5種常見金屬的含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，化風(fēng)丹處方中含有朱砂和雄黃，Hg元素和As元素分別為其主要成分，故含量測(cè)定時(shí)日劑量Pb元素少量超標(biāo)，Hg元素、As元素超標(biāo)較多[1]。經(jīng)過(guò)研究培元通腦膠囊的生物利用度測(cè)定結(jié)果，考慮化風(fēng)丹中測(cè)得的Pb元素、Hg元素、As元素含量也未必是人體吸收含量。陳勇[16]研究發(fā)現(xiàn)化風(fēng)丹治療腦卒中療效顯著，不良反應(yīng)少，考慮其中重金屬元素含量在有效治療范圍，且不會(huì)引起毒性反應(yīng)。李燕梅等[10]和孟憲舉等[11]研究發(fā)現(xiàn)，培元通腦膠囊療效顯著，可明顯改善患者癥狀，且不良反應(yīng)少，考慮其吸收含量可達(dá)到有效治療范圍。

本實(shí)驗(yàn)方法存在一定的局限性，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們會(huì)采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以便對(duì)中藥制劑中重金屬含量和其潛在毒性之間的相關(guān)性進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估。另外，本實(shí)驗(yàn)由于所選樣品為心腦血管疾病所用藥品，兒童用藥幾率較少，故未對(duì)兒童進(jìn)行重金屬風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

4 結(jié)論

培元通腦膠囊在臨床使用量較大，2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）未規(guī)定其限量標(biāo)準(zhǔn)，為提高安全性，有必要對(duì)其中重金屬含量進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)以ICP-MS法建立了一種迅速有效、專屬性強(qiáng)的分析方法同時(shí)測(cè)定培元通腦膠囊中Cu、As、Cd、Hg和Pb的含量及這5種元素在人工胃液和腸液中的溶出情況，構(gòu)建了體外消化模型，應(yīng)用目標(biāo)危害熵值法評(píng)估培元通腦膠囊中的重金屬污染水平及人群的接觸風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果表明，培元通腦膠囊中人體吸收重金屬含量均處于安全范圍內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)可為培元通腦膠囊質(zhì)量控制提供依據(jù)，對(duì)其他中成藥重金屬生物利用度研究及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。