黃水枝醇提物對(duì)CCl4致小鼠肝纖維化的改善作用及其機(jī)制初探

黃甫靜 張金娟 董莉 李雕 張春雷 廖尚高 何迅

中圖分類(lèi)號(hào) R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）14-1685-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.14.04

摘 要 目的：考察黃水枝醇提物（TPME）對(duì)四氯化碳（CCl4）致小鼠肝纖維化的改善作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制。方法：將60只雄性昆明種小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（秋水仙堿0.1 mg/kg）和TPME低、中、高劑量組（250、500、1 000 mg/kg），每組10只。除正常組外，其余各組小鼠均腹腔注射20%CCl4橄欖油溶液誘導(dǎo)肝纖維化，每周2次，連續(xù)8周。從造模的第5周起，各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥液，正常組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周。末次給藥12 h后，稱(chēng)定各組小鼠肝臟質(zhì)量并計(jì)算肝指數(shù)，檢測(cè)血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）、Ⅲ型前膠原（PC-Ⅲ）、Ⅳ型膠原（C-Ⅳ）、層粘連蛋白（LN）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）含量;采用Western blot法檢測(cè)肝組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）和Smad3蛋白的表達(dá)水平;以蘇木精-伊紅（HE）、Masson染色后觀(guān)察肝組織病理變化。結(jié)果：與正常組比較，模型組小鼠肝指數(shù)和血清中ALT、AST活性以及MDA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN、TNF-α、IL-6含量均顯著升高，SOD活性顯著降低（P<0.01），肝組織中α-SMA、TGF-β1和Smad3蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），鏡下可見(jiàn)肝組織出現(xiàn)明顯的纖維化病變。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和TPME各劑量組小鼠肝指數(shù)和血清中ALT、AST活性以及MDA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN、TNF-α、IL-6含量均顯著降低，SOD活性均顯著升高（P<0.05或P<0.01），肝組織中α-SMA、TGF-β1和Smad3蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），鏡下可見(jiàn)肝纖維化病變均有不同程度的改善。與TPME低劑量組比較，TPME高劑量組小鼠血清中PC-Ⅲ、LN、IL-6含量和肝組織中TGF-β1、Smad3蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：TPME對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化具有一定的改善作用，該作用可能與抑制膠原合成、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、降低炎癥因子含量、下調(diào)α-SMA和TGF-β1/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 黃水枝;肝纖維化;炎癥反應(yīng);氧化應(yīng)激;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1/Smad信號(hào)通路;小鼠

Preliminary Study on Improvement Effect of Tiarella polyphylla Ethanol Extract on CCl4-induced Hepatic Fibrosis in Mice and Its Mechanism

HUANG Fujing1，ZHANG Jinjuan2，DONG Li1，LI Diao1，ZHANG Chunlei1，LIAO Shanggao1，HE Xun1（1. School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550025， China; 2. School of Basic Medicine， Guizhou Medical University， Guiyang 550025， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the improvement effect of Tiarella polyphylla ethanol extract （TPME） on CCl4-induced hepatic fibrosis in mice， and to explore its possible mechanism preliminarily. METHODS： Totally 60 male Kunming mice were randomly divided into normal group， model group， positive control group （colchicine 0.1 mg/kg）， TPME low-dose， medium-dose and high-dose groups （250， 500， 1 000 mg/kg） according to body weight， with 10 mice in each group. Except for normal group， other groups were given 20% CCl4 olive oil solution intraperitoneally to induce hepatic fibrosis， twice a week， for consecutive 8 weeks. From the fifth week after modeling， administration groups were given relevant medicine intragastrically， normal group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 4 weeks. Twelve hours after last administration， the liver weight of mice in each group was measured and the liver index was calculated. The serum contents of ALT， AST， SOD， MDA， PC-Ⅲ， C-Ⅳ， LN， TNF-α and IL-6 were determined. Western blot assay was used to detect the protein expression of α-SMA， TGF-β1 and Smad3 in liver tissue. HE and Masson staining were used to observe the pathological changes of hepatic tissue. RESULTS： Compared with normal group， the liver index， the activities of ALT and AST and the contents of MDA， LN， PC-Ⅲ， C-Ⅳ， LN， TNF-α and IL-6 in serum were increased significantly， while the activity of SOD was decreased significantly in model group （P<0.01）; the protein expression of α-SMA， TGF-β1 and Smad3 in liver tissues were increased significantly （P<0.01）. Obvious fibrosis lesions was observed in liver tissue. Compared with model group， the live indexes， the activities of ALT and AST， the contents of MDA， PC-Ⅲ， C-Ⅳ， LN， TNF-α and IL-6 in serum were decreased significantly in positive control group and TPME groups， while the activities of SOD were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The protein expression of α-SMA， TGF-β1 and Smad3 in liver tissue were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， and liver fibrosis was improved to different extent. Compared with TPME low-dose group， the contents of PC-Ⅲ， LN and IL-6? in serum， protein expression of TGF-β1 and Smad3 in liver tissue were decreased significantly in TPME high-dose group （P<0.05）. CONCLUSIONS： TPME can improve hepatic fibrosis induced by CCl4 in mice， the mechanism of which may be associated with the inhibition of collagen synthesis and oxidative stress， the reduction of inflammatory factors， and the down-regulation of the expression α-SMA and relative proteins of TGF-β1/Smad signal pathway.

KEYWORDS? ?Tiarella polyphylla; Hepatic fibrosis; Inflammation response; Oxidative stress; TGF-β1/Smad signal pathway; Mice

肝纖維化（hepatic fibrosis）是肝臟遭到病毒、自由基、炎癥因子等損傷因素攻擊時(shí)出現(xiàn)的損傷-修復(fù)反應(yīng)，是各種慢性肝病向肝硬化乃至肝癌發(fā)展的中間環(huán)節(jié)[1]。研究表明，肝纖維化具有可逆性[2]，抑制并逆轉(zhuǎn)肝纖維化對(duì)阻止慢性肝病向肝硬化、肝癌發(fā)展具有重要意義。

目前，臨床上尚無(wú)有效的肝纖維化治療藥物[3]。因此，尋找有效的抗肝纖維化藥物成為了藥物研發(fā)者的重要任務(wù)之一。近年來(lái)，越來(lái)越多的基礎(chǔ)和臨床研究均發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥對(duì)肝纖維化有良好的治療作用[4-6]，已成為了近年來(lái)抗肝纖維化藥物研究的熱點(diǎn)。黃水枝Tiarella polyphylla D. Don為虎耳草科植物，具有活血祛瘀、消腫止痛的功效;其主要化學(xué)成分為黃酮類(lèi)、三萜皂苷類(lèi)、揮發(fā)油等，具有抗腫瘤、抗補(bǔ)體、抗哮喘、保肝等方面的作用[7-8]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)， 黃水枝醇提物（TPME）具有抑制人肝星狀細(xì)胞（HSC）——LX-2細(xì)胞增殖的活性，故推測(cè)其具有抗纖維化的作用。為了驗(yàn)證此推測(cè)，本研究采用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)建立小鼠肝纖維化模型，觀(guān)察TPME對(duì)模型小鼠肝纖維化的改善作用，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，旨在為尋找有效的抗肝纖維化藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括ELX-800型全波段多功能酶標(biāo)儀、Universal HoodⅡ型凝膠成像分析儀（美國(guó)BioTek公司），TGL16M型高速冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司），CP124C型電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]，Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司），ZYCGF-Ⅱ-10T型超純水機(jī)（四川卓越水處理設(shè)備有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

黃水枝全草（批號(hào)202010）由昆明采智生物技術(shù)有限公司提供，采集地為湖北省恩施市建始縣芭蕉鄉(xiāng)，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)龍慶德副教授鑒定為黃水枝T. polyphylla D. Don的全草;秋水仙堿對(duì)照品（批號(hào)S15A8C34051，純度≥99%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒[水溶性四氮唑法（WST-1）]、丙二醛（MDA）試劑盒[硫代巴比妥酸法（TBA）]（批號(hào)分別為20201204、20201207、20201230、20201223）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;腫瘤壞死因子α（TNF-α，批號(hào)M2001106-102a）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購(gòu)自深圳欣博盛生物科技有限公司;白細(xì)胞介素6（IL-6，批號(hào)Nov 2020）ELISA試劑盒購(gòu)自河南九邦生物科技有限公司;Ⅲ型前膠原（PC-Ⅲ）ELISA試劑盒、Ⅳ型膠原（C-Ⅳ）ELISA試劑盒（批號(hào)分別為L(zhǎng)210104920、L210104913）均購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司;層粘連蛋白（LN）ELISA試劑盒（批號(hào)A22011449）購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司;蘇木精-伊紅（HE）、Masson染料（批號(hào)分別為ZH203012、CR2101109）均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司;高效RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、彩虹180廣譜蛋白mar- ker、ECL Plus超敏發(fā)光液（批號(hào)分別為R0010、PC0020、P1200、PR1910、PE0010）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×，批號(hào)121817171214）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）單克隆抗體（批號(hào)分別為ab179695、ab124964）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;兔抗鼠Smad3單克隆抗體（批號(hào)L1602077）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號(hào)9300014001）購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司;兔抗鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（批號(hào)T0004）購(gòu)自美國(guó)Affinity公司;聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（批號(hào)P2938）購(gòu)自德國(guó)Merck公司;其余試劑均為分析純或者實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)雄性昆明種小鼠，60只，體質(zhì)量18～22 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（黔）2018-0001。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，溫度18～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h光照晝夜循環(huán)。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)了貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（編號(hào)2000069）。

2 方法

2.1 TPME的制備

取黃水枝全草，粉碎成粗粉，過(guò)24目篩;稱(chēng)取粗粉200 g，第1次加入甲醇2 000 mL，浸泡1 h后，加熱回流提取1 h;第2次加入等體積甲醇，加熱回流提取1 h;合并兩次提取液，濾過(guò)，取濾液，減壓回收溶劑，冷凍干燥后即得干浸膏44.58 g，提取率為22.29%。

2.2 分組、造模與給藥

造模方法根據(jù)文獻(xiàn)[9]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定，按體質(zhì)量隨機(jī)將60只雄性昆明種小鼠分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（秋水仙堿0.1 mg/kg）和TPME低、中、高劑量組（250、500、1 000 mg/kg，劑量按臨床用藥劑量的0.5、1、2倍設(shè)置），每組10只。除正常組小鼠腹腔注射等體積橄欖油外，其余5組小鼠均腹腔注射20%CCl4橄欖油溶液（橄欖油與CCl4的體積比為4 ∶ 1）1 mL/kg以建立肝纖維化模型，每周2次，連續(xù)8周。從造模的第5周起，正常組、模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥液（以生理鹽水為溶劑），每天1次，連續(xù)4周。末次給藥后，所有小鼠均禁食、不禁水12 h，再稱(chēng)定其體質(zhì)量;腹腔注射戊巴比妥進(jìn)行麻醉，于眼眶取血約1 mL，常溫靜置2 h，以3 500 r/min離心15 min，取血清，保存于-20 ℃，備用。采血后，脫頸椎處死小鼠，剖取其肝臟，稱(chēng)定質(zhì)量，部分肝組織固定于4%多聚甲醛溶液中保存，備用;另一部分肝組織于-80 ℃冰箱中保存，備用。

2.3 臟器指數(shù)計(jì)算

計(jì)算各組小鼠末次給藥后的肝指數(shù)：肝指數(shù)=肝質(zhì)量/末次體質(zhì)量×100%。

2.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

采用微板法以酶標(biāo)儀檢測(cè)各組小鼠血清中ALT、AST的活性，ELISA法以酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN、TNF-α、IL-6的含量，TBA法以酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中MDA的含量，WST-1法以酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中SOD的活性。上述檢測(cè)均嚴(yán)格按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.5 肝組織中α-SMA、TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取于-80 ℃凍存的肝組織，復(fù)溫后，稱(chēng)取每個(gè)肝組織樣本100 mg，加高效RIPA 裂解液1 mL，于冰上勻漿，再于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，即得各組小鼠肝組織蛋白。采用BCA法測(cè)定肝組織樣本的蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，于100 ℃加熱5 min變性;取變性蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h;用TBST緩沖液清洗10 min×3次后，分別加入α-SMA、TGF-β1、Smad3、GAPDH一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過(guò)夜;用TBST緩沖液清洗10 min×3次后，加入山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1 ∶ 3 000），室溫孵育1 h;用TBST緩沖液清洗10 min×3次，用ECL Plus超敏發(fā)光液顯影并置于凝膠成像分析儀上成像。采用Image J 1.8.0 軟件分析條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2.6 肝組織病理學(xué)觀(guān)察

取固定于4%多聚甲醛溶液中的肝組織，經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋后切片，分別經(jīng)HE、Masson染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察各組小鼠肝組織的病理學(xué)變化。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)則采用Dunnetts T3檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 TPME對(duì)肝纖維化模型小鼠肝指數(shù)的影響

與正常組比較，模型組小鼠的肝指數(shù)顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和TPME各劑量組小鼠的肝指數(shù)均顯著降低（P<0.01），而TPME各劑量組上述指標(biāo)組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見(jiàn)表1。

3.2 TPME對(duì)肝纖維化模型小鼠血清中ALT和AST活性的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清中ALT和AST的活性均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和TPME各劑量組小鼠血清中ALT和AST的活性均顯著降低（P<0.01），而TPME各劑量組上述指標(biāo)組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見(jiàn)表2。

3.3 TPME對(duì)肝纖維化模型小鼠血清中PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清中PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN的含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和TPME各劑量組小鼠血清中PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN的含量均顯著降低（P<0.01）。與TPME低劑量組比較，TPME高劑量組小鼠血清中PC-Ⅲ、LN的含量均顯著降低（P<0.05），詳見(jiàn)表3。

3.4 TPME對(duì)肝纖維化模型小鼠血清中MDA含量和SOD活性的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清中MDA的含量顯著升高，SOD的活性顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和TPME各劑量組小鼠血清中MDA的含量均顯著降低，SOD的活性均顯著升高（P<0.05或P<0.01），而TPME各劑量組上述指標(biāo)組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見(jiàn)表4。

3.5 TPME對(duì)肝纖維化模型小鼠血清中TNF-α和IL-6含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和TPME各劑量組小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與TPME低劑量組比較，TPME高劑量組小鼠血清中IL-6的含量顯著降低（P<0.05），詳見(jiàn)表5。

3.6 TPME對(duì)肝纖維化模型小鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、Smad3蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和TPME各劑量組小鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、Smad3蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與TPME低劑量組比較，TPME高劑量組小鼠肝組織中TGF-β1和Smad3蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），詳見(jiàn)圖1、表6。

3.7 TPME對(duì)肝纖維化模型小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響

HE染色顯示，正常組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝細(xì)胞以匯管區(qū)或中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，肝組織未見(jiàn)明顯肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞病變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);模型組小鼠的肝細(xì)胞排列紊亂且有部分肝細(xì)胞壞死，肝組織結(jié)構(gòu)被破壞，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和脂肪空泡;陽(yáng)性對(duì)照組和TPME各劑量組小鼠肝組織上述病理改變均有不同程度緩解，詳見(jiàn)圖2。

Masson染色顯示，正常組小鼠肝組織僅在中央靜脈和匯管區(qū)有少量膠原沉積，未見(jiàn)增生的纖維組織;模型組小鼠肝組織匯管區(qū)出現(xiàn)大量膠原沉積，增生的纖維組織形成的纖維條索將相鄰的匯管區(qū)連接形成假小葉;陽(yáng)性對(duì)照組和TPME各劑量組小鼠肝組織中的膠原沉積均有不同程度減少，肝纖維化程度均有所減輕，詳見(jiàn)圖3。

4 討論

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化惡性發(fā)展的必經(jīng)病理過(guò)程，其實(shí)質(zhì)是肝組織損傷后機(jī)體的過(guò)度修復(fù)[10]。肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是HSC的激活，形成肌成纖維細(xì)胞，后者分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）;同時(shí)，肝臟對(duì)ECM的降解相對(duì)或絕對(duì)不足，大量的ECM在肝臟沉積，從而導(dǎo)致肝纖維化[11-12]。當(dāng)肝臟受損時(shí)，出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并產(chǎn)生TNF-α、IL-6、TGF-β1等炎癥因子[13]。其中，TNF-α、IL-6為強(qiáng)促炎因子，能促使肝組織的炎癥反應(yīng)加劇并加重肝組織的損傷程度，從而加速肝纖維化的發(fā)展[14]。與此同時(shí)，TGF-β1可刺激靜止?fàn)顟B(tài)下的HSC，使其被激活并大量增殖，促使HSC向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)HSC合成ECM的能力并抑制ECM的分解，從而導(dǎo)致肝組織內(nèi)出現(xiàn)大量的ECM沉積[15]，且過(guò)度沉積的ECM可重新分割肝小葉，嚴(yán)重時(shí)使肝組織結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)形成假小葉[16]。

4.1 造模方法和陽(yáng)性藥物的選擇

CCl4可在肝臟氧化代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量的自由基，使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化而出現(xiàn)損傷或壞死，從而導(dǎo)致纖維化的發(fā)生[17]。用CCl4誘導(dǎo)動(dòng)物肝纖維化，已成為國(guó)內(nèi)外建立肝纖維化動(dòng)物模型的經(jīng)典方法[18-19]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠的肝指數(shù)顯著高于正常組，提示模型組小鼠出現(xiàn)了肝損傷[20];TPME可顯著降低模型小鼠的肝指數(shù)，提示TPME可減輕模型小鼠的肝損傷。秋水仙堿具有良好的抗炎作用，可通過(guò)減少細(xì)胞因子分泌、調(diào)節(jié)TGF-β1等蛋白的表達(dá)、減少膠原形成、促進(jìn)膠原分解等途徑來(lái)發(fā)揮抗肝纖維化作用，目前被作為陽(yáng)性藥物廣泛應(yīng)用于抗肝纖維化研究中[21-22]。基于此，本研究采用CCl4誘導(dǎo)建立肝纖維化小鼠模型，以秋水仙堿為陽(yáng)性藥物，對(duì)TPME的保肝作用及其機(jī)制進(jìn)行初步探索。

4.2 血清生化指標(biāo)的檢測(cè)及意義

ALT和AST是反映肝細(xì)胞損傷的靈敏指標(biāo)[23]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠血清中ALT和AST的活性均顯著升高，由此說(shuō)明模型組小鼠出現(xiàn)了肝損傷[23]。與模型組比較，TPME可顯著降低模型小鼠血清中AST和ALT的活性，說(shuō)明TPME可減輕CCl4所致小鼠的肝損傷程度。LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ是臨床上常用于反映肝臟受損程度和肝纖維化水平的指標(biāo)。其中，LN是非膠原性結(jié)構(gòu)糖蛋白，當(dāng)肝纖維化發(fā)生時(shí)，肝竇內(nèi)LN明顯沉積并被釋放入血，使血清中LN含量升高[24];PC-Ⅲ是在基底膜膠原纖維形成的過(guò)程中被氮末端酶裂解后釋放入外周血的氨基端前膠原肽，血清中PC-Ⅲ的含量會(huì)隨著纖維形成的增多而升高[25];C-Ⅳ為肝血竇基底膜的主要成分，在肝纖維過(guò)度增生時(shí)，C-Ⅳ的合成處于較高水平，血清中C-Ⅳ的含量隨之上升[26]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清中LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ的含量均顯著升高，提示該組小鼠出現(xiàn)了肝損傷和肝纖維化;TPME可顯著降低模型小鼠血清中LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ的含量，且高劑量組的LN、PC-Ⅲ降低更明顯，提示TPME可減輕模型小鼠的肝損傷和肝纖維化程度，有劑量依賴(lài)趨勢(shì)。

氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在肝纖維化發(fā)展進(jìn)程中有著重要作用，檢測(cè)血清中SOD活性、MDA含量可反映機(jī)體氧化損傷發(fā)生情況[27-28]，而血清中TNF-α、IL-6含量可反映機(jī)體炎癥反應(yīng)發(fā)生情況。本研究結(jié)果顯示，給予TPME治療后，模型小鼠血清中MDA、TNF-α、IL-6的含量均顯著升高，SOD的活性均顯著降低，且高劑量組的IL-6升高更明顯，說(shuō)明TPME能減輕肝纖維化模型小鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，有劑量依賴(lài)趨勢(shì)。

4.3 肝纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)及意義

α-SMA是HSC激活的特征標(biāo)志物，其表達(dá)水平與肝臟的纖維化程度呈正相關(guān)[29]。本研究結(jié)果顯示，TPME能夠顯著下調(diào)肝纖維化模型小鼠肝組織中α-SMA蛋白的表達(dá)水平，提示TPME抑制了HSC的活化。TGF-β1/Smad信號(hào)通路是介導(dǎo)HSC激活、促進(jìn)HSC增殖和產(chǎn)生ECM的主要信號(hào)通路，在肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中有重要作用，因此阻斷TGF-β1/Smad信號(hào)通路，對(duì)肝纖維化的治療有重要意義[4]。本研究結(jié)果顯示，TPME能夠顯著下調(diào)肝纖維化模型小鼠肝組織中TGF-β1和Smad3蛋白的表達(dá)水平，且作用強(qiáng)度與藥物劑量呈正相關(guān)，提示TPME能夠劑量依賴(lài)性地阻斷TGF-β1/Smad信號(hào)通路，這可能是TPME抑制HSC活化、減少膠原合成，進(jìn)而減輕模型小鼠肝纖維化程度的作用機(jī)制之一。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，TPME對(duì)CCl4致小鼠肝纖維化具有一定的改善作用，能減輕模型小鼠的肝損傷和纖維化程度，其作用可能與抑制膠原合成、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、降低炎癥因子含量、下調(diào)α-SMA和TGF-β1/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] PUCHE J E，SAIMAN Y，F(xiàn)RIEDMAN S L. Hepatic stellate cells and liver fibrosis[J].Compr Physiol，2013，3（4）：1473-1492.

[ 2 ] NAKANO Y，KAMIYA A，SUMIYOSHI H，et al. A deactivation factor of fibrogenic hepatic stellate cells induces regression of liver fibrosis in mice[J].Hepatology，2020，71（4）：1437-1452.

[ 3 ] 徐詩(shī)雨，郭惠婕，劉揭，等.肝纖維化治療靶標(biāo)研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2020，26（10）：1930-1934.

[ 4 ] 陳冠新，文彬，孫海濤，等.鱉甲煎丸對(duì)CCl4致大鼠肝纖維化模型中NF-κB信號(hào)通路的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2018，24（10）：161-167.

[ 5 ] 張定棋，徐瑩，楊海琳，等.不同制法下瘀血湯對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2020，26（5）：18-25.

[ 6 ] 王乾宇，王文佳，奚錦，等.杜仲多糖對(duì)肝纖維化模型大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，MMP-1，TIMP-1及TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2018，24（23）：153- 158.

[ 7 ] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草：第10卷[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2009：56-57.

[ 8 ] 劉慧，孟愛(ài)榮，彭春喜，等.黃水枝屬藥學(xué)研究概況[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（35）：12472-12473.

[ 9 ] 唐愛(ài)存，韋燕飛，劉喜華，等.葫蘆茶苷對(duì)四氯化碳致肝纖維化模型小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].中國(guó)藥房，2020，31（2）：190-195.

[10] 徐列明，劉平，沈錫中，等.肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南：2019年版[J].臨床肝膽病雜志，2019，35（7）：1444- 1449.

[11] HUANG Y，DENG X，LIANG J. Modulation of hepatic stellate cells and reversibility of hepatic fibrosis[J]. Exp Cell Res，2017，352（2）：420-426.

[12] 賈繼東，魏來(lái)，侯金林，等.《中國(guó)肝病診療管理規(guī)范》白皮書(shū)：節(jié)選[J].臨床肝膽病雜志，2014，30（3）：197-209.

[13] DU Q H，ZHANG C J，LI W H，et al. Gan shen fu fang ameliorates liver fibrosis in vitro and in vivo by inhibiting the inflammatory response and extracellular signal-regula- ted kinase phosphorylation[J]. World J Gastroenterol，2020，26（21）：2810-2820.

[14] CZAJA A J. Hepatic inflammation and progressive liver fi- brosis in chronic liver disease[J]. World J Gastroenterol，2014，20（10）：2515-2532.

[15] XU F，LIU C，ZHOU D，et al. TGF-β/SMAD pathway and its regulation in hepatic fibrosis[J]. Eur J Histochem，2016，64（3）：157-167.

[16] 吳姍姍，王振常，黎妍，等.中藥復(fù)方壯肝逐瘀煎對(duì)肝纖維化模型大鼠微循環(huán)的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2020，38（1）：151-156，277.

[17] WANG R，ZHANG H，WANG Y，et al. Inhibitory effects of quercetin on the progression of liver fibrosis through the regulation of NF-кB/IкBα，p38 MAPK，and Bcl-2/Bax signaling[J]. Int Immunopharmacol，2017，47：126-133.

[18] SUN H，CHEN G，WEN B，et al. Oligo-peptide I-C-F-6 inhibits hepatic stellate cell activation and ameliorates CCl4-induced liver fibrosis by suppressing NF-κB signa- ling and Wnt/β-catenin signaling[J]. J Pharmacol Sci，2018，136（3）：133-141.

[19] BU F T，CHEN Y，YU H X，et al. SENP2 alleviates CCl4-induced liver fibrosis by promoting activated hepatic stellate cell apoptosis and reversion[J]. Toxicol Lett，2018，289：86-98.

[20] CHEN Y，LI R，HU N，et al. Baihe Wuyao decoction ameliorates CCl4-induced chronic liver injury and liver fibrosis in mice through blocking TGF-β1/Smad2/3 signaling， anti-inflammation and anti-oxidation effects[J]. J Ethnopharmacol，2020，263：113227.

[21] 許瓊梅，李躍龍，曹后康，等.溪黃草水提物對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].中國(guó)藥房，2018，29（20）：2791-2796.

[22] ZHU Z，HU R，LI J，et al. Alpinetin exerts anti-inflammatory，anti-oxidative and anti-angiogenic effects through activating the Nrf2 pathway and inhibiting NLRP3 pathway in carbon tetrachloride-induced liver fibrosis[J]. Int Immunopharmacol，2021，96：107660.

[23] 李小俠.血清谷氨酸脫氫酶與其他肝功能指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)在肝病診斷中的臨床意義[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2020，49（12）：143-146.

[24] NALLAGANGULA K S，NAGARAJ S K，VENKATASWAMY L，et al. Liver fibrosis： a compilation on the biomarkers status and their significance during disease progression[J]. Future Sci OA，2018，4（1）：FSO250.

[25] GRESSNER O A，WEISKIRCHEN R，GRESSNER A M.Biomarkers of liver fibrosis： clinical translation of mole- cular pathogenesis or based on liver-dependent malfunction tests[J]. Clinica Chimica Acta，2007，381（2）：107-113.

[26] CEQUERA A，GARC?A DE LE?N M?NDEZ M C. Biomarkers for liver fibrosis： advances， advantages and disadvantages[J]. Rev Gastroenterol Méx，2014，79（3）：187- 199.

[27] GUO Y，LIANG X，MENG M，et al.Hepatoprotective effects of Yulangsan flavone against carbon tetrachloride （CCl4）-induced hepatic fibrosis in rats[J]. Phytomedicine，2017，33：28-35.

[28] 楊婧，賈彥，王蔚，等.膈下逐瘀湯對(duì)大鼠纖維化肝臟組織谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（17）：129-134.

[29] JIANG Y，XIANG C，ZHONG F，et al. Histone H3K27 methyltransferase EZH2 and demethylase JMJD3 regulate hepatic stellate cells activation and liver fibrosis[J]. The- ranostics，2020，11（1）：361-378.

（收稿日期：2021-03-31 修回日期：2021-05-27）

（編輯：鄒麗娟）