甘藍(lán)黑腐病苗期抗性鑒定方法研究

張?chǎng)析? 張恩慧 吳云鋒 許忠民 蔡美杰 孫慶國(guó)

摘? ? 要：為了建立快速、準(zhǔn)確的甘藍(lán)黑腐病苗期抗性鑒定方法，以田間對(duì)黑腐病抗感差異表現(xiàn)明顯的5個(gè)供試材料作為鑒別寄主，噴霧接種黑腐病菌株，設(shè)置1葉1心、2葉1心、3葉1心、4葉1心、5葉1心等5個(gè)接種苗齡，1×105、1×106、1×108、1×1010 CFU·mL-1等4種菌液接種濃度，26 ℃/19 ℃、28 ℃/19 ℃、30 ℃/19 ℃等3種培養(yǎng)溫度，接種后0、12、24、36、48 h等5個(gè)保濕時(shí)間及接種后7、9、12、16 d等4個(gè)時(shí)間分別調(diào)查發(fā)病癥狀，確定影響抗性鑒定方法的關(guān)鍵因子。結(jié)果表明，上述處理組合能反映5個(gè)寄主材料的抗感特性，且高感與高抗材料的病情指數(shù)差值最大的分別為73.61、74.77和72.22。當(dāng)甘藍(lán)幼苗生長(zhǎng)至3葉1心期，噴霧法接種濃度為1×108 CFU·mL-1菌液，接種后90%濕度下保濕36 h，在14 h光照、溫度26 ℃/19 ℃培養(yǎng)下誘導(dǎo)病害發(fā)生，第12天調(diào)查幼苗發(fā)病程度，能夠鑒定甘藍(lán)材料的抗病性。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán);黑腐病;抗病性;苗期;鑒定方法

中圖分類號(hào)：S635 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2021）06-039-08

Study on the method of identification of resistance to black rot in cabbage at seedling stage

ZHANG Xinxin1， ZHANG Enhui1， WU Yunfeng2， XU Zhongmin1， CAI Meijie1， SUN Qingguo1

（1. State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas/College of Horticulture， Northwest A&F University， Yangling 712100， Shaanxi， China; 2. College of Plant Protection，Northwest A&F University， Yangling 712100， Shaanxi， China）

Abstract： In order to establish a rapid and accurate method for identification of resistance to black rot in cabbage at the seedling stage， we used 5 materials with significant differences in resistance to black rot in the field as identification hosts， sprayed inoculation with black rot strains， set 5 inoculation seedling ages （one leaf and one heart， two leaves and one heart， three leaves and one heart， four leaves and one heart， five leaves and one heart）， 4 kinds of inoculation concentrations （1×105 CFU·mL-1， 1×106 CFU·mL-1， 1×108 CFU·mL-1， 1×1010 CFU·mL-1）， 3 culture temperature treatments （26 ℃/19 ℃， 28 ℃/19 ℃， 30 ℃/19 ℃）， 5 moisturizing times （0 h， 12 h， 24 h， 36 h， 48 h） and 4 investigation time （7 d， 9 d， 12 d， 16 d） to determine the key factors of the identification method. The results show that the above treatment combination can reflect the anti-susceptibility characteristics of the five host materials， and the difference between the disease indices of the high-sensitivity and high-resistance materials is 73.61， 74.77 and 72.22， respectively. When the seedlings grew to the three leaves and one heart stage， the bacterial suspension with a concentration of 1×108 CFU·mL-1，was inoculated by spraying method， moisturized at 90% humidity for 36 hours after inoculation， and the disease was induced under 14 h light and 26 ℃/19 ℃， the incidence of seedlings was investigated on the 12th day， the disease resistance of cabbage material could be identified.

Key words： Cabbage; Black rot; Resistance; Seedling stage; Identification method

甘藍(lán)黑腐病是由野油菜黃單胞菌（Xanthomonas Campestris pv. campestris，Xcc）引起的一種細(xì)菌性病害[1]，是亞洲、歐洲、北美洲十字花科蔬菜的主要病害[2-4]。病斑從葉片邊緣的褪綠斑點(diǎn)逐漸向葉片的主脈擴(kuò)張，形成“V”形病斑，顏色從黃色逐漸變?yōu)楹稚?，最后變?yōu)楹谏玔5]。甘藍(lán)黑腐病野油菜黃單胞菌主要通過(guò)種子帶菌和幼苗移植進(jìn)行傳播，也可以通過(guò)昆蟲、灌溉用水、農(nóng)場(chǎng)設(shè)備及工人進(jìn)行農(nóng)事活動(dòng)等進(jìn)行傳播[6]。病菌也能在十字花科雜草寄主和土壤中受感染的作物殘茬中存活[7-8]。亞熱帶許多蔬菜生產(chǎn)區(qū)典型的溫暖潮濕氣候有利于疾病的流行[9]。

近年來(lái)，甘藍(lán)黑腐病在我國(guó)蔬菜主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，對(duì)甘藍(lán)生產(chǎn)造成了很大危害，使甘藍(lán)嚴(yán)重減產(chǎn)[10]。盡管市場(chǎng)上有一些用于防治黑腐病的農(nóng)藥，但由于病原菌對(duì)殺菌劑的抗藥性，黑腐病很難得到控制[11]，選育抗病品種是防治甘藍(lán)黑腐病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一，因此依據(jù)甘藍(lán)黑腐病發(fā)生條件、發(fā)病規(guī)律和作物的感病特性、發(fā)病特征，制定一套較為科學(xué)的苗期抗病性鑒定方法，對(duì)于抗源篩選和抗病品種選育非常重要。有研究表明，甘藍(lán)苗期和成株期抗病性基本一致[12-13]，苗期鑒定抗病性速度快，可在較短時(shí)間內(nèi)得到鑒定結(jié)果，并且苗期鑒定可在室內(nèi)進(jìn)行，條件容易控制[14-16]。因此，筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，從甘藍(lán)幼苗接種黑腐病菌保濕時(shí)間、病原菌接種濃度及溫度、甘藍(lán)接種苗齡和調(diào)查時(shí)間等主因入手進(jìn)行探究，旨在進(jìn)一步完善并制定出甘藍(lán)黑腐病苗期抗病性鑒定方法，以期為甘藍(lán)抗病育種提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株

供試甘藍(lán)材料為甘藍(lán)田間黑腐病自然病圃經(jīng)多年抗病性自然鑒定表現(xiàn)對(duì)黑腐病菌抗感差異顯著的5個(gè)材料（表1），均由西北農(nóng)林科技大學(xué)甘藍(lán)研究室提供。供試甘藍(lán)黑腐病菌株為致病力較強(qiáng)的甘藍(lán)黑腐病菌株YU[17]，該菌株由西北農(nóng)林科技大學(xué)甘藍(lán)研究室提供。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、酵母粉1 g、葡萄糖10 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L、pH 7.2;牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、酵母粉1 g、葡萄糖10 g、蒸餾水1 L、pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 幼苗培養(yǎng) 試驗(yàn)于2019年3—10月在西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)基地日光溫室進(jìn)行，將5個(gè)材料的種子先在75%酒精中處理1 min，再用滅菌蒸餾水沖洗2～3次后，于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)催芽2 d，選取發(fā)芽一致的種子播種于50孔穴盤（540 mm × 270 mm × 50 mm）基質(zhì)中，所用基質(zhì)提前進(jìn)行滅菌處理，育苗盤置于日光溫室中正常生長(zhǎng)。

1.2.2 病原菌接種方法和抗性類型劃分 接種材料準(zhǔn)備：供試甘藍(lán)材料幼苗長(zhǎng)至一定時(shí)期時(shí)，將幼苗澆透水并覆蓋塑料薄膜保濕24 h（25 ℃/19 ℃）。

黑腐病菌懸浮液制備：將4 ℃保存的菌株YU于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上活化24 h，挑取活化的菌株于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、190 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)18 h，用無(wú)菌水調(diào)節(jié)濃度用于接種。

接種：用小型噴霧器將配制好的菌液均勻噴灑到植株葉片上，每株幼苗平均噴施1 mL左右，以葉片無(wú)液滴滴落為宜，以噴施無(wú)菌水為空白對(duì)照，3次重復(fù)，每次重復(fù)16株。接種后繼續(xù)用薄膜保濕，之后除去薄膜將幼苗放置光照14 h、濕度90%下栽培生長(zhǎng)。整個(gè)試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，接種后數(shù)日開始調(diào)查發(fā)病情況（每株幼苗隨機(jī)選2片真葉進(jìn)行調(diào)查），統(tǒng)計(jì)發(fā)病級(jí)別，計(jì)算病情指數(shù)，進(jìn)行抗性類型劃分。

病情指數(shù)計(jì)算和抗性類型劃分：病情指數(shù)（Disease Index，DI）=Σ（病級(jí)葉數(shù)×該病級(jí)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高病級(jí)）×100?？剐灶愋停≧esistance Type，RT）劃分：依據(jù)甘藍(lán)材料的葉片病情級(jí)別，分別計(jì)算出DI平均值，進(jìn)而確定其抗性類型。

1.2.3 病原菌接種后最適保濕和發(fā)病調(diào)查時(shí)間確定 用小型噴霧器將濃度為1×108 CFU·mL-1的菌液均勻噴施到3葉1心期的供試甘藍(lán)幼苗上，分別設(shè)置塑料薄膜保濕0、12、24、36、48 h等5個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)16株幼苗。接種后的幼苗置于28 ℃/19 ℃光照14 h培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);接種后分別于7、9、12、16 d調(diào)查發(fā)病癥狀，比較5個(gè)材料的田間自然抗病性與苗期接種黑腐病的抗病性，篩選病原菌接種后的最適保濕條件和發(fā)病調(diào)查時(shí)間。

1.2.4 病原菌接種最適濃度和溫度確定 利用血球計(jì)數(shù)板分別配置1×105、1×106、1×108、1×1010 CFU·mL-1等4種濃度的黑腐病病原菌懸浮液，用小型噴霧器于3葉1心期的甘藍(lán)幼苗進(jìn)行噴霧接種，采用1.2.3確定的最適保濕時(shí)間和發(fā)病調(diào)查時(shí)間，將接種后除去薄膜的甘藍(lán)幼苗置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（光14 h/暗10 h），溫度分別設(shè)置26 ℃/19 ℃、28 ℃/19 ℃、30 ℃/19 ℃等3個(gè)處理，濕度90%下培養(yǎng);每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)16株。比較5個(gè)材料的田間自然抗病性與苗期接種黑腐病的抗病性，篩選病原菌接種后的最適濃度和溫度。

1.2.5 病原菌接種最適苗齡的確定 采用1.2.3和1.2.4確定的保濕時(shí)間、發(fā)病調(diào)查時(shí)間、接種濃度和溫度，設(shè)置1葉1心、2葉1心、3葉1心、4葉1心、5葉1心等5個(gè)接種苗齡處理。接種后幼苗于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，濕度90%，每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)16株。比較5個(gè)材料的田間自然抗病性與苗期接種黑腐病的抗病性，篩選病原菌接種的最適苗齡。

1.2.6 甘藍(lán)不同種質(zhì)資源材料的抗病性鑒定 采用本試驗(yàn)中建立的甘藍(lán)黑腐病苗期抗性鑒定方法，對(duì)國(guó)內(nèi)外引進(jìn)的44份甘藍(lán)種質(zhì)資源進(jìn)行苗期抗病性鑒定，以高抗材料QK2502和感病材料QG50作為對(duì)照，根據(jù)鑒定結(jié)果選擇有代表性的10份材料進(jìn)行重復(fù)鑒定與驗(yàn)證。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncans多重比較法分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)苗期感染黑腐病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)確定

甘藍(lán)苗期接種黑腐病菌的癥狀表現(xiàn)為病斑從葉片水孔處的褪綠斑點(diǎn)逐漸擴(kuò)展，顏色由黃色逐漸變?yōu)楹稚?，后期變?yōu)楹谏?。根?jù)癥狀特征分析，在國(guó)家甘藍(lán)攻關(guān)組“八五”確定甘藍(lán)苗期黑腐病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[18]的基礎(chǔ)上進(jìn)一步修改完善;建立如下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，接種葉片無(wú)任何癥狀;1級(jí)，接種葉片水孔處有黑色枯死斑點(diǎn)，無(wú)擴(kuò)展;3級(jí)，接種葉片病斑從水孔向外擴(kuò)展，占葉面積1/16以下;5級(jí)，接種葉片病斑從水孔向外擴(kuò)展，占葉面積1/16～1/4;7級(jí)，接種葉片病斑從水孔向外擴(kuò)展，占葉面積1/4～1/2;9級(jí)，接種葉片病斑從水孔向外擴(kuò)展，占葉面積1/2以上，見圖1。

2.2 甘藍(lán)黑腐病苗期接種鑒定最適保濕時(shí)間和發(fā)病調(diào)查時(shí)間的篩選

由表2可知，接種病菌后不同保濕和發(fā)病調(diào)查時(shí)間處理對(duì)5個(gè)材料病情指數(shù)的影響存在顯著差異。鑒定表現(xiàn)出隨著保濕時(shí)間的增加，5個(gè)材料的病情指數(shù)均呈現(xiàn)不同程度的增加趨勢(shì)，且在不同保濕時(shí)間內(nèi)均隨著調(diào)查時(shí)間的延長(zhǎng)，其幼苗的發(fā)病程度則相應(yīng)的加重。從5個(gè)材料田間自然抗、感黑腐病的真實(shí)性與苗期接種鑒定抗性的一致性分析，僅有保濕24 h和36 h處理下，接種后12 d調(diào)查，5個(gè)材料苗期接種鑒定的抗、感病癥狀與其田間自然抗感性呈現(xiàn)一致，分別表現(xiàn)為QK2502（HR）高抗、QG70（R）抗病、LQ66（MR）中抗、QG50（S）感病、B02（HS）高感。在每個(gè)保濕時(shí)間下7 d和0、12 h保濕時(shí)間下9 d調(diào)查時(shí)，5個(gè)材料均發(fā)病較輕，QG70（R）病情指數(shù)均 ≤ 9.49，表現(xiàn)為高抗;在36 h、48 h保濕時(shí)間下9 d調(diào)查時(shí)，B02（HS）病情指數(shù)分別為62.50和69.44，表現(xiàn)為感病;在0、12 h保濕時(shí)間下12、16 d調(diào)查時(shí)，材料B02（HS）病情指數(shù) ≤ 67.59，呈現(xiàn)偏小現(xiàn)象，表現(xiàn)為中抗或感病;在48 h保濕時(shí)間下12 d調(diào)查或24 h、36 h和48 h保濕時(shí)間下16 d調(diào)查時(shí)，感病QG50表現(xiàn)為高感;這些條件下的結(jié)果均不能真實(shí)地鑒定出5個(gè)材料的抗病性。即在篩選確定保濕24 h或36 h處理下第12天調(diào)查為適合苗期接種鑒定條件中，相比較5個(gè)材料中高感與高抗材料的病情指數(shù)差值，保濕24 h時(shí)差值為70.14、保濕36 h時(shí)差值為73.61。由此得出，苗期接種鑒定抗病性36 h和12 d時(shí)為最適保濕和發(fā)病調(diào)查時(shí)間。圖2為5個(gè)材料在接種后保濕36 h、12 d時(shí)的發(fā)病癥狀。

2.3 甘藍(lán)黑腐病苗期接種鑒定最適接種濃度和溫度的篩選

由表3可知，甘藍(lán)苗期黑腐病菌接種后不同接種濃度而相同溫度處理時(shí)，5個(gè)材料的病情指數(shù)均呈現(xiàn)出隨接種濃度的增大而增大的趨勢(shì);在接種濃度相同而溫度處理不同時(shí)，5個(gè)材料病情指數(shù)均呈現(xiàn)出隨處理溫度增高而增大的趨勢(shì)。從5個(gè)材料田間自然抗感黑腐病的真實(shí)性與苗期接種鑒定抗性的一致性分析，僅在接種濃度為1×108 CFU·mL-1、溫度為26 ℃/19 ℃和28 ℃/19 ℃時(shí)，5個(gè)材料苗期接種鑒定的抗、感病癥狀與其田間自然抗感性呈現(xiàn)一致，分別表現(xiàn)為QK2502（HR）高抗、QG70（R）抗病、LQ66（MR）中抗、QG50（S）感病、B02（HS）高感。而其他接種濃度和溫度處理下均存在不一致性差別，其中溫度為26 ℃/19 ℃時(shí)，接種濃度為1×105 CFU·mL-1和1×106 CFU·mL-1處理下，5個(gè)材料均發(fā)病較輕，QG70（R）表現(xiàn)為高抗，LQ66（MR）表現(xiàn)為抗病，QG50（S）表現(xiàn)為中抗或抗病，B02（HS）表現(xiàn)為中抗或感病;接種濃度為1×1010 CFU·mL-1處理下，QG50（S）發(fā)病較重，病情指數(shù)為71.53，表現(xiàn)為高感。在溫度為28 ℃/19 ℃時(shí)，接種濃度為1×105 CFU·mL-1和1×106 CFU·mL-1處理下，植株發(fā)病程度較輕，QG70（R）表現(xiàn)為高抗，LQ66（MR）表現(xiàn)為抗病，QG50（S）表現(xiàn)為中抗，B02（HS）表現(xiàn)為中抗或感病;接種濃度為1×1010 CFU·mL-1處理下，QK2502（HR）和QG50（S）發(fā)病較重，分別表現(xiàn)為抗?。≧）和高感（HS）。在溫度為30 ℃/19 ℃時(shí)，接種濃度為1×105 CFU·mL-1和1×106 CFU·mL-1處理下，B02（HS）發(fā)病較輕，表現(xiàn)為感病;接種濃度為1×108 CFU·mL-1和1×1010 CFU·mL-1處理下，QG50（S）發(fā)病較重，病情指數(shù)≥71.99，表現(xiàn)為高感，這些處理下的結(jié)果均不能真實(shí)地鑒定出5個(gè)材料的抗病性。由篩選確定溫度為26 ℃/19 ℃或28 ℃/19 ℃、接種濃度為1×108 CFU·mL-1處理為適合苗期接種鑒定條件中，相比較5個(gè)材料中高感與高抗材料的病情指數(shù)差值，接種溫度為26 ℃/19 ℃時(shí)差值為74.77、接種溫度為28 ℃/19 ℃時(shí)差值為73.84。由此得出，苗期接種鑒定抗病性1×108 CFU·mL-1和26 ℃/19 ℃為最適接種濃度和溫度。圖3為5個(gè)材料在溫度為26 ℃/19 ℃下培養(yǎng)至12 d時(shí)的發(fā)病癥狀。

2.4 甘藍(lán)黑腐病苗期接種鑒定最適接種苗齡的篩選

由表4可知，對(duì)甘藍(lán)不同苗齡的幼苗接種黑腐病菌，QK2502不同苗齡間病情指數(shù)存在極顯著差異，其他4個(gè)材料不同苗齡間病情指數(shù)差異水平不同。鑒定表現(xiàn)出5個(gè)材料的病情指數(shù)均呈現(xiàn)隨苗齡增大而減小的趨勢(shì)，即幼苗發(fā)病程度重。對(duì)照5個(gè)材料田間自然抗感黑腐病的真實(shí)性與苗齡接種鑒定抗性的一致性分析，接種選在幼苗3葉1心期或4葉1心期，5個(gè)材料苗期接種鑒定抗感病的癥狀與其田間自然抗感性呈現(xiàn)一致性，分別表現(xiàn)為QK2502（HR）高抗、QG70（R）抗病、LQ66（MR）中抗、QG50（S）感病、B02（HS）高感;而其他接種苗齡均存在不一致性差別，接種在1葉1心期或2葉1心期時(shí)，QG50（S）發(fā)病均較重，表現(xiàn)為高感;而接種在5葉1心期時(shí)，幼苗發(fā)病較輕，QG70（R）表現(xiàn)為高抗，LQ66（MR）表現(xiàn)為抗病。結(jié)果表明，這些苗齡下的鑒定結(jié)果均不能真實(shí)地判別出5個(gè)材料的抗病性。在由篩選得出適宜接種的苗齡即為3葉1心期或4葉1心期中，相比較5個(gè)材料中高感與高抗材料間病情指數(shù)差值，其3葉1心期接種時(shí)差值為72.22、4葉1心期接種時(shí)差值為71.99。由此得出，甘藍(lán)黑腐病苗期抗性鑒定接種的最適苗齡是3葉1心期。圖4為5個(gè)不同抗性甘藍(lán)材料在3葉1心期接種12 d時(shí)的發(fā)病癥狀。

2.5 甘藍(lán)種質(zhì)資源苗期黑腐病抗性鑒定與篩選

由表5可以看出，采用篩選確立的甘藍(lán)黑腐病苗期抗性鑒定方法對(duì)44份甘藍(lán)種質(zhì)資源材料進(jìn)行黑腐病抗性鑒定，結(jié)果表現(xiàn)出供試甘藍(lán)種質(zhì)資源材料間病情指數(shù)存在極大差別，各材料間抗感性分化非常明顯。對(duì)黑腐病抗性分類的結(jié)果為：高抗材料10份，抗病材料11份，中抗材料9份，感病材料8份，高感材料6份，分別占鑒定資源材料的22.73%、25%、20.45%、18.18%和13.64%;苗期接種鑒定所得結(jié)果與供試44份種質(zhì)資源材料歷年在田間黑腐病圃的自然鑒定抗感性結(jié)果基本一致。與此同時(shí)，從這44份資源材料的每個(gè)抗性級(jí)別中隨機(jī)選出2份材料進(jìn)行重復(fù)鑒定，2次鑒定結(jié)果完全吻合，并且2次鑒定的供試抗、感對(duì)照品種也均表現(xiàn)出典型的抗、感特征，由此得出，研究建立的甘藍(lán)黑腐病苗期抗性鑒定方法可行，其鑒定資源材料的抗病性結(jié)果準(zhǔn)確、真實(shí)。

3 討論與結(jié)論

建立甘藍(lán)苗期抗病性鑒定方法既要符合田間發(fā)病期病原菌的適宜發(fā)病環(huán)境，也要考慮甘藍(lán)植株自身生長(zhǎng)狀況與抗病性關(guān)系;并要接種鑒定選用致病力較強(qiáng)的病原菌和選擇甘藍(lán)幼苗的旺盛生長(zhǎng)期，才能真實(shí)地表現(xiàn)出甘藍(lán)資源的抗感性能。黑腐病是甘藍(lán)作物的主要病害，病原菌主要通過(guò)水孔和傷口侵入甘藍(lán)體內(nèi);甘藍(lán)感染病原菌自身也會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，抵抗病原菌危害并逐漸在侵入周圍表現(xiàn)感病癥狀。對(duì)于甘藍(lán)黑腐病苗期抗性鑒定接種方式，前人采用剪葉法[19]、針刺法[20-21]等，這是人為造成傷口有利于病原菌入侵，但某種程度會(huì)降低甘藍(lán)的抗御能力，傷口接種易導(dǎo)致植株感病加重。筆者在本研究中采用噴霧接種，模擬了田間黑腐病菌自然侵染途徑[22]，使甘藍(lán)植株處于自然生長(zhǎng)狀態(tài)，體內(nèi)防御體系健全，能使甘藍(lán)資源對(duì)黑腐病的抗感反應(yīng)表現(xiàn)出真實(shí)性。

甘藍(lán)黑腐病發(fā)病的重要條件是具有適宜的高溫和高濕環(huán)境，這樣才可能充分保證黑腐病菌的強(qiáng)致病力和保證病菌在葉面上的黏著性，同時(shí)也能保證甘藍(lán)葉面水孔的開放性，便于病原菌入侵;干旱或缺濕易導(dǎo)致甘藍(lán)葉面蠟粉增多，水孔關(guān)閉，病原菌不易侵染葉片。本研究得出，進(jìn)行甘藍(lán)黑腐病抗性苗期接種鑒定，接種病原菌后保濕36 h、12 d時(shí)調(diào)查幼苗感病程度才能客觀地判別甘藍(lán)資源的抗病性。如果保濕時(shí)間或幼苗感病癥狀調(diào)查時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短均會(huì)導(dǎo)致病害加重或減輕，從而影響甘藍(lán)資源抗病性真實(shí)性的鑒定;這與前人[23-25]研究的結(jié)果有所不同。

病原菌接種濃度直接決定著植物感染病害的發(fā)病程度，溫度是影響植物和微生物生活力的主要因子，二者共同決定著病原菌的致病力和植物受病菌的傷害程度。病原菌侵染寄主并不是濃度越高致病力就越強(qiáng)，對(duì)于不同作物它有一個(gè)致病力最強(qiáng)的濃度適宜范圍。本研究得出甘藍(lán)幼苗接種黑腐病菌抗性鑒定適宜濃度為1×108 CFU·mL-1，接種溫度為26 ℃/19 ℃時(shí)就能明顯地區(qū)別出抗感資源的抗性差異。這個(gè)結(jié)論也表明在適宜接種病原菌濃度下，26 ℃/19 ℃接種溫度正是野油菜黃單胞菌（Xcc）最適生長(zhǎng)溫度，同時(shí)此溫度對(duì)甘藍(lán)生長(zhǎng)也相對(duì)有利;如果溫度 ≥ 28 ℃，甘藍(lán)生長(zhǎng)減緩，抗逆性減弱，相應(yīng)的就加快了植株的發(fā)病進(jìn)程，此時(shí)會(huì)導(dǎo)致感病加重。筆者這種認(rèn)識(shí)與Staub T[26]在研究十字花科作物黑腐病抗性鑒定方法時(shí)認(rèn)為過(guò)高接種濃度和接種溫度會(huì)導(dǎo)致鑒定材料抗病性降低的觀點(diǎn)相同。田間甘藍(lán)黑腐病多發(fā)生在每年8—9月，此時(shí)溫度25～30 ℃，降水較多，這與筆者的研究結(jié)果相吻合。

病害抗性鑒定選擇的接種苗齡是影響甘藍(lán)抗病性鑒定真實(shí)表達(dá)的重要因素之一。筆者認(rèn)為甘藍(lán)不同苗齡接種黑腐病菌，導(dǎo)致幼苗發(fā)病程度的輕重差異不同;苗齡越小發(fā)病越重，苗齡越大發(fā)病越輕;而能真實(shí)地代表甘藍(lán)資源本身抗病特性的接種苗齡是幼苗生長(zhǎng)中期，即3葉1心期或4葉1心期。這也再次表明筆者認(rèn)為建立甘藍(lán)苗期抗病性接種鑒定方法除應(yīng)選用當(dāng)?shù)貜?qiáng)致病力的病原菌外，還需選在甘藍(lán)幼苗生長(zhǎng)的最旺盛期接種。甘藍(lán)一般分為2/5和3/8葉環(huán)，第1葉環(huán)為苗期，生長(zhǎng)5片或8片真葉代表苗期結(jié)束。也正因?yàn)?葉1心期或4葉1心期是2/5和3/8葉環(huán)幼苗生長(zhǎng)中期，此時(shí)甘藍(lán)幼苗根系發(fā)育健全，體內(nèi)代謝旺盛，生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng);而選擇此時(shí)接種病原菌鑒定抗病性也最具代表性。

綜上所述，當(dāng)幼苗生長(zhǎng)至3葉1心期時(shí)，選用當(dāng)?shù)貜?qiáng)致病力的黑腐病菌株YU，配制濃度為1×108 CFU·mL-1的病菌懸浮液，采用噴霧法接種，接種后90%濕度下保濕36 h，在光14 h/暗10 h、溫度26 ℃/19 ℃培養(yǎng)條件下誘發(fā)病害發(fā)生，于12 d時(shí)調(diào)查幼苗發(fā)病程度，依據(jù)甘藍(lán)資源材料的病情指數(shù)就能夠準(zhǔn)確、可靠地鑒定其抗病類型。

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