對香豆酸改善嗅球切除小鼠抑郁樣行為及其AMPA受體機制

肖煦暉，李惠蓉，肖志勇，李金成，肖楚麗

(1. 邵陽學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2. 湘西南中藥開發(fā)利用湖南省工程研究中心，湖南 邵陽 422000；3. 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽 421001)

抑郁癥是一種常見的神經(jīng)精神疾病，約25%的人在其一生的某個時期遭受抑郁癥的困擾[1]。一線抗抑郁藥物存在起效慢、有效率低、毒副作用強等缺點，因此亟需開發(fā)低毒有效的抗抑郁藥物。

α-氨-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(AMPA受體)是一種離子型谷氨酸受體，通過快鈉離子通道的激活和失活介導(dǎo)哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性谷氨酸的快速傳遞。研究表明，AMPA受體與突觸可塑性密切相關(guān)，并且參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展[2]。NBQX是選擇性AMPA受體拮抗劑，可競爭性與AMPA受體結(jié)合，進而阻斷多種藥物的抗抑郁樣作用；CX546是AMPA受體選擇性激動劑，可增強抗抑郁藥物的作用，這些證據(jù)表明AMPA受體參與多種藥物的抗抑郁樣作用[3-4]。

對香豆酸(p-coumaric acid，p-CA)是一種衍生自芳香族氨基酸的苯丙酸，具有抗氧化、抗瘧原蟲和抗炎免疫作用[5-7]。越來越多的研究報道p-CA可改善腦缺血和記憶障礙[8-9],然而p-CA對抑郁癥中的作用卻研究甚少，特別地，在嗅球切除抑郁模型中的作用未見報道。該文擬建立嗅球切除(OBX)小鼠抑郁模型研究p-CA的抗抑郁作用，此外，考慮到p-CA可上調(diào)AMPA受體介導(dǎo)的場電位[10]，因此我們應(yīng)用AMPA受體拮抗劑NBQX和AMPA受體激動劑CX546，進一步研究其對p-CA抗抑郁樣作用的影響，以及明確AMPA受體對p-CA的抗抑郁樣行為有無關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6W ICR小鼠，♂，許可證號：SCXK(湘)2019-0004，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。(23±2) ℃，明暗周期12 h(其中7 ∶00-17 ∶00為明)的實驗動物房中，自由攝食和飲水。

1.2 主要藥物對香豆酸，購于阿拉丁公司，濃度為75 mg·kg-1[6]；NBQX購于Selleck公司，濃度為0.5 mg·kg[6]；CX546購于MCE公司，溶于生理鹽水中，劑量1 mg·kg-1,藥物和溶媒的注射體積為10 mL·kg-1。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1實驗1 p-CA對OBX小鼠抑郁樣行為的影響。小鼠隨機分成對照組(Control)，假手術(shù)組(SHAM)，嗅球切除組(OBX)和嗅球切除+p-CA組(OBX+ p-CA)，每組9只，其中嗅球切除小鼠進行嗅球摘除手術(shù)，假手術(shù)組小鼠除不摘除嗅球外其它手術(shù)過程相同，而對照組小鼠不進行手術(shù)，手術(shù)后各組小鼠恢復(fù)21 d。d 22-24小鼠每天腹腔注射溶媒(10%吐溫80)或p-CA(75 mg·kg-1)，共3次，最后一次注射后1 h進行曠場測試(OFT)，注射后3 h強迫游泳測試(FST)，藥物注射后24 h進行懸尾測試。觀察小鼠在行為測試中的表現(xiàn)。

1.3.2實驗2 NBQX對p-CA改善OBX小鼠抑郁行為的影響。小鼠隨機分成嗅球切除組(OBX)，嗅球切除+NBQX組(OBX+NBQX)，嗅球切除+p-CA組(OBX+ p-CA)，嗅球切除+NBQX+ p-CA組(OBX+ NBQX+ p-CA)，每組9只，各組小鼠進行嗅球摘除手術(shù)后小鼠恢復(fù)21 d。d 22-24 d小鼠每天腹腔注射溶媒1(10%吐溫80)或p-CA(75 mg·kg-1)，共3次，最后一次注射溶媒1或p-CA前30 min注射NBQX或溶媒2。P-CA注射后1 h進行曠場測試(OFT)，注射后3 h強迫游泳測試(FST)，藥物注射后24 h進行懸尾測試。觀察小鼠在行為測試中的表現(xiàn)。

1.3.3實驗3 CX546對p-CA改善OBX小鼠抑郁行為的影響。小鼠隨機分成嗅球切除組(OBX)，嗅球切除+CX546組(OBX+CX546)，嗅球切除+p-CA組(OBX+p-CA)，嗅球切除+CX546+p-CA組(OBX+ CX546+ p-CA)，每組9只，各組小鼠進行嗅球摘除手術(shù)后小鼠恢復(fù)21 d。d 22-24小鼠每天腹腔注射溶媒1(10%吐溫80)或p-CA(75mg/kg)，共3次，最后一次注射溶媒1或p-CA前30 min注射CX546或溶媒2。P-CA注射后1 h進行曠場測試(OFT)，注射后3 h強迫游泳測試(FST)，藥物注射后24 h進行懸尾測試。觀察小鼠在行為測試中的表現(xiàn)。

1.4 嗅球切除(OBX)小鼠麻醉后固定于腦立體定位儀上，剪毛后切開顱骨上皮膚，用雙氧水腐蝕并呈現(xiàn)前囟點，以前囟點為原點向前5 mm，左右旁開各1 mm，用直徑為2 mm顱骨鉆鉆孔，并搗碎嗅球，用真空泵吸出。用明膠海綿填塞孔，縫合皮膚并涂碘酒消毒。腹腔注射青霉素鈉，連續(xù)3 d以防止感染。OBX術(shù)后恢復(fù)時間各異，多數(shù)選擇14、21、30 d或45 d。當前研究選擇術(shù)后恢復(fù)21 d。

1.5 曠場測試(OFT)[11]曠場測試在長50 cm，寬50 cm，高60 cm的隔音箱中進行，LED燈提供50 LUX的光強，排風(fēng)扇提供30 Hz的背景噪音。將小鼠輕輕地放入隔音箱中10 min，通過行為分析軟件Anymaze 6.10統(tǒng)計小鼠10 min的運動距離。每次測試前，使用75%的乙醇溶液清潔隔音箱內(nèi)壁及底部[12]。

1.6 懸尾測試(TST)懸尾測試在隔音箱中進行，將小鼠鼠尾(在距尾尖1 cm處)用膠帶固定于細繩上并懸掛于隔音箱頂部6 min，小鼠頭部距箱底50 cm。攝像頭錄制該測試視頻并由實驗者雙盲離線分析后4 min內(nèi)小鼠的不動時間。

1.7 強迫游泳測試(FST)測試時將小鼠放于水深15 cm、水溫(25±1)℃的透明玻璃桶(15 cm×20 cm)內(nèi)被迫游泳6 min，每結(jié)束一次實驗，換水。攝像頭錄制該測試視頻并由實驗者雙盲離線分析后4 min內(nèi)小鼠的不動時間。

2 結(jié)果

2.1 p-CA改善OBX誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為Fig 1結(jié)果顯示，在FST中(Fig 1B)，與對照組相比，SHAM組小鼠不動時間差異無顯著性(P>0.05)，而與SHAM組相比，OBX組小鼠不動時間明顯增加(P<0.01)，此外，與OBX組相比，p-CA組小鼠不動時間明顯降低(P<0.05)。在TST中(Fig 1C), 與對照組相比，SHAM組小鼠不動時間差異無顯著性(P>0.05)，而與SHAM組相比，OBX組小鼠不動時間明顯增加(P<0.05)，此外，與OBX組相比，p-CA組小鼠不動時間明顯降低(P<0.05)。在OFT中(Fig 1A)，與對照組相比，SHAM組小鼠移動距離差異無顯著性(P>0.05)，而與SHAM組相比，OBX組小鼠移動距離明顯增加(P<0.01)，此外，與OBX組相比，p-CA組小鼠移動距離明顯降低(P<0.01)。這些結(jié)果表明，p-CA能有效改善小鼠抑郁樣行為。

Fig 1 Effect of p-CA on depression-like behaviors of OBX mice n=9)

2.2 NBQX阻斷了p-CA對 OBX小鼠抑郁樣行為的改善作用Fig 2結(jié)果顯示，在FST中(Fig 2B)，與OBX組相比，OBX+NBQX組小鼠不動時間差異無顯著性(P>0.05)而OBX+ p-CA組小鼠不動時間明顯減少(P<0.05)；此外，與OBX+ p-CA組相比，OBX+ NBQX+ p-CA組小鼠不動時間明顯增加(P<0.05)。在TST中(Fig 2C)，與OBX組相比，OBX+NBQX組小鼠不動時間差異無顯著性(P>0.05)而OBX+ p-CA組小鼠不動時間明顯減少(P<0.05)；此外，與OBX+ p-CA組相比，OBX+ NBQX+ p-CA組小鼠不動時間明顯增加(P<0.05)。在OFT中(Fig 2A)，與OBX+ Vehicle組相比，OBX+NBQX組小鼠移動距離差異無顯著性(P>0.05)而OBX+ p-CA組小鼠移動距離明顯減少(P<0.01)；此外，與OBX+ p-CA組相比，OBX+ NBQX+ p-CA組小鼠移動距離明顯增加(P<0.05)。以上提示，NBQX能對抗p-CA對小鼠抑郁樣行為改善作用。

Fig 2 Effect of NBQX on p-CA improved depression-like behaviors of OBX mice n=9)

如Fig 3所示，在FST中(Fig 3B)，與OBX組相比，OBX+CX546組小鼠不動時間差異無顯著性(P>0.05)而OBX+ p-CA組小鼠不動時間明顯減少(P<0.05)；此外，與OBX+ p-CA組相比，OBX+ CX546+ p-CA組小鼠不動時間明顯降低(P<0.05)。在TST中(Fig 3C)，與OBX組相比，OBX+CX546組小鼠不動時間差異無顯著性(P>0.05)，而OBX+ p-CA組小鼠不動時間明顯減少(P<0.05)；此外，與OBX+ p-CA組相比，OBX+ CX546+ p-CA組小鼠不動時間明顯增加(P<0.05)。在OFT中(Fig 3A)，與OBX+ Vehicle組相比，OBX+CX546組小鼠移動距離差異無顯著性(P>0.05)而OBX+ p-CA組和OBX+ CX546+ p-CA組小鼠移動距離明顯減少(分別為：P<0.05，P<0.01)；此外，與OBX+ p-CA組相比，OBX+ CX546+ p-CA組小鼠移動距離差異無顯著性(P>0.05)。以上表明，CX546促進了p-CA對小鼠抑郁樣行為的改善作用。

Fig 3 Effect of CX546 on p-CA improved depression-like behaviors of OBX n=9)

3 討論

目前研究顯示，OBX小鼠抑郁樣行為增加，注射p-CA可改善OBX小鼠抑郁樣行為,并且AMPA受體拮抗劑NBQX阻斷了p-CA的抗抑郁樣作用，而AMPA受體激動劑CX546增強了p-CA的抗抑郁樣作用。

之前研究分別采用50mg·kg-1、75 mg·kg-1、100mg·kg-1的p-CA在一次LPS注射前24 h腹腔給藥，并于LPS注射后2 h或6 h檢測大鼠的抑郁樣行為，結(jié)果顯示50mg·kg-1和75mg·kg-1的p-CA對一次LPS注射誘導(dǎo)大鼠抑郁樣行為具有預(yù)防作用[5]。為進一步驗證p-CA對抑郁行為的治療作用，進行了當前研究，OBX小鼠被注射75mg·kg-1的p-CA，連續(xù)注射3 d后檢測小鼠的抑郁樣行為。實驗結(jié)果表明，p-CA慢性給藥明顯改善OBX小鼠FST和TST中小鼠抑郁樣行為。此外，OBX小鼠常常出現(xiàn)激越行為，即曠場測試中活動度增加，這種激越行為是小鼠易激惹，應(yīng)激敏感性增加的表現(xiàn)，這與抑郁癥患者的敏感性相似。鑒于此，當前研究檢測了對各組小鼠曠場測試中的活動度，結(jié)果顯示與SHAM組小鼠相比，OBX小鼠OFT中活動度增加，而p-CA降低了這種活動度的增加。這些結(jié)果表明p-CA慢性給藥可治療OBX小鼠的抑郁樣行為。之前研究表明，p-CA可改善小鼠氧化應(yīng)激及腦缺血/再灌注損傷，改善東莨菪堿誘導(dǎo)大鼠被動回避和水迷宮測試中記憶障礙。當前研究進一步明確了p-CA對抑郁樣行為的治療作用，從而拓展了p-CA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮的神經(jīng)保護作用。

嗅球切除是一種經(jīng)典的嚙齒類抑郁模型，OBX小鼠表現(xiàn)出識別記憶、恐懼記憶和空間記憶障礙，絕望、快感缺失等抑郁樣行為，此外還具有高活動度、睡眠障礙、高攻擊性等異常行為[12-13]。此外，其可導(dǎo)致皮層和海馬神經(jīng)元退化和死亡，體積萎縮，突觸棘密度減少，突觸可塑性降低[14]。 嗅球切除抑郁模型與一次LPS注射誘導(dǎo)的抑郁模型相比在表面效度和預(yù)測效度上更具優(yōu)勢。嗅球切除抑郁模型抑郁樣行為可持續(xù)終生，而一次LPS注射誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為一般持續(xù)1-2 d。在評估藥物抗抑郁作用方面，嗅球切除抑郁模型可進行急性或慢性給藥，而一次LPS注射誘導(dǎo)的抑郁模型，只能進行急性給藥，無法評價藥物慢性給藥的作用。此外，鑒于一些抗炎藥物也可以改善LPS注射誘導(dǎo)的抑郁模型的抑郁樣行為，因此這種模型并無法排除一些不具有抗抑郁作用的抗炎藥物。并且LPS抑郁模型小鼠往往伴隨其他的炎癥引起的疾病行為，如體溫升高，活動度降低，攝食攝水減少等。

AMPA受體與突觸可塑性密切相關(guān)，并參與多種藥物的抗抑郁樣作用[3-4]。在慢性溫和應(yīng)激、慢性社會挫敗等抑郁模型中均觀察到腦中AMPA受體活性降低。一些抗抑郁藥物可增加AMPA受體在突觸的表達發(fā)揮抗抑郁樣作用。并且AMPA受體拮抗劑NBQX可阻斷抗抑郁藥物的抗抑郁作用[15-16]。為明確AMPA受體是否介導(dǎo)了p-CA的抗抑郁樣作用，本實驗探索了AMPA受體拮抗劑NBQX和AMPA受體激動劑CX546分別對p-CA的抗抑郁樣作用的影響。結(jié)果顯示當最后一次p-CA給藥前30min注射AMPA受體拮抗劑NBQX時，AMPA受體拮抗劑NBQX單獨給藥不影響OBX小鼠抑郁樣行為，而NBQX阻斷了p-CA對OBX小鼠抑郁樣行為的改善作用。這些結(jié)果表明p-CA改善OBX小鼠抑郁樣行為可能依賴于AMPA受體。當最后一次p-CA給藥前30min注射AMPA受體激動劑CX546時，AMPA受體激動劑CX546單獨給藥不影響OBX小鼠抑郁樣行為，而CX546增強了p-CA對OBX小鼠抑郁樣行為的改善作用。這些結(jié)果表明p-CA改善OBX小鼠抑郁樣行為依賴于AMPA受體。p-CA可能通過PKA、鈣調(diào)蛋白、ERK、mTOR等促進AMPA受體生成或磷酸化促進其遷移上膜的過程，最終促進突觸區(qū)域AMPA受體功能的增強進而介導(dǎo)其抗抑郁樣作用[17]。

綜上，當前研究表明p-CA改善OBX小鼠抑郁樣行為，并且其作用可能依賴于AMPA受體。然而當前研究，無法判斷在嗅球切除抑郁模型及p-CA處理中AMPA受體是否發(fā)生改變。因此在將來的研究中應(yīng)進一步檢測海馬、內(nèi)側(cè)前額葉皮層中AMPA受體蛋白的表達情況。