• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    丹參酮ⅡA通過調控Grp78/caspase-12通路改善小鼠內質網應激性肝損傷

    2021-08-10 00:37:34李曉明
    中國藥理學通報 2021年8期
    關鍵詞:勻漿丹參酮肝細胞

    李曉明,常 偉,劉 浩

    (蚌埠醫(yī)學院藥學院,安徽 蚌埠 233030)

    急性肝損傷是所有肝臟疾病共有的病理過程,其病因較為復雜[1]。大量研究發(fā)現,外源性物質誘發(fā)的肝細胞內質網應激與多種肝病的發(fā)生關系密切,也是急性肝損傷發(fā)生的新的機制[2]。本課題組前期利用衣霉素成功構建了內質網應激性急性肝損傷小鼠模型,為急性肝損傷機制研究提供了新的模型,但相關治療藥物仍缺乏研究[3]。丹參酮是一種臨床常用的抗炎消菌藥,其主要含有丹參酮Ⅱ A、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ等活性成分[4]。許多基礎和臨床研究表明,丹參酮多種活性成分對急性肝損傷均具有一定的預防和治療作用,如丹參酮Ⅱ A對利福平(rifampicin,RIF)、雷公藤甲素(triptolide, TP)、4-羥基壬烯酸(4-hydroxynonenal,4-HNE)等藥物誘導的多種急性肝損傷模型均具有較好的肝保護作用[5-9]。同時也有研究發(fā)現,丹參酮Ⅱ A對缺血/再灌注性肝損傷以及α-萘異硫氰酸酯(α-naphthyl isothiocyanate,ANIT)誘導的肝內膽汁淤積性肝損傷保護作用較好[10-11],但對衣霉素誘導的內質網應激性急性肝損傷的作用尚未見報道。為此,本研究通過建立衣霉素誘導的小鼠內質網應激性急性肝損傷模型,考察丹參酮Ⅱ A對衣霉素誘導小鼠急性肝損傷的保護作用及其部分機制,為臨床合理使用丹參酮Ⅱ A提供參考依據。

    1 材料與方法

    1.1 化學試劑衣霉素,購自美國Sigma公司,純度98%,每瓶10 mg,批號:654380-10MG;丹參酮Ⅱ A購自上海純優(yōu)生物科技有限公司,純度≥98%,每瓶10 mg,批號:568-72-9-10MG;聯苯雙酯滴丸(bifendate, Bif)購自萬邦德制藥集團股份有限公司,每丸含聯苯雙酯1.5 mg,批號:A02J180112。丙氨酸氨基轉移酶(ALT,批號:mI058577)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST,批號:mI016824)、超氧化物歧化酶(SOD,批號:mI643059)、丙二醛(MDA,批號:mI016824)等ELISA試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。葡萄糖調節(jié)蛋白78抗體(glucose regulated protein 78 ku,Grp78,鼠抗兔單克隆抗體,貨號:AF5366)購自江蘇Affinity Biosciences(LTD)公司;門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶12抗體(cysteine aspartic acid specific protease-12,caspase-12,鼠抗兔單克隆抗體,貨號:55238-1-AP)、caspase-3抗體(鼠抗兔單克隆抗體,貨號:19677-1-AP)等抗體均購自美國Proteintech公司;B淋巴細胞瘤-2基因抗體(B-cell lymphoma 2,Bcl-2,鼠抗兔單克隆抗體,貨號:3498S)、Bcl-2相關X蛋白抗體(Bcl-2-associated X protein,Bax,鼠抗兔單克隆抗體,貨號:2774S)等抗體均購自美國cell signaling technology(CST)公司;Grp78和caspase-12引物均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;TUNEL凋亡檢測試劑盒(顯色法,貨號:QIA33)購自美國Merck公司;實時定量PCR試劑盒購自貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司。

    1.2 主要儀器IX-73熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司);倒置顯微鏡圖像采集系統(日本Olympus公司);X1R低溫高速離心機(美國賽默斯世爾公司);MILLI-Q型純水機(武漢優(yōu)普純水設備有限公司);DYY-6C型電泳儀(北京六一);酶標儀(美國BioTke公司); Mini-Protena電泳系統(美國伯樂公司);CKX41-A32PH倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司);凝膠成像系統(美國biorad公司)。

    1.3 動物SPF級昆明種小鼠,♂,(18-22) g,5-6 周,由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供,合格證號:SCXK(魯)2019-0003。適應性飼養(yǎng)3 d,自由飲食飲水,維持光照和黑暗各12 h,溫度20 ℃-25 ℃,相對濕度(50±5)%。本研究經蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心和倫理委員會批準。

    1.4 動物分組及造模將60只小鼠,隨機分為6組:正常組、模型組、陽性藥組(Bif,150 mg·kg-1)、丹參酮Ⅱ A低劑量組(10 mg·kg-1)、中劑量組(20 mg·kg-1)、高劑量組(40 mg·kg-1),每組10只。用藥組小鼠按0.1 ml/10 g分別灌胃給予相應劑量丹參酮Ⅱ A或聯苯雙酯,正常組和模型組同法給予等量生理鹽水,1次/d,連續(xù)7 d。所有小鼠在末次給藥后禁食10 h,除正常組外,其余小鼠均單次灌胃給予衣霉素(1 mg·kg-1)進行造模[3],再禁食12 h。稱體質量,眼眶靜脈叢采血,靜置30 min后,離心(4 ℃,3 000 r·min-1×20 min),保留上清用于AST、ALT等生化指標檢測;頸椎脫臼處死小鼠,取肝臟、脾臟、胸腺稱質量,計算內臟指數 [內臟指數=肝臟/脾臟/胸腺質量/小鼠體質量],剪取肝臟相同部位制備組織勻漿和蛋白上樣樣品分別用于MDA、SOD含量以及Grp78、caspase-12、caspase-3、Bax、Bcl-2等蛋白水平測定,剩余肝臟置于10%甲醛中固定保存,用于組織病理學、TUNEL染色和免疫組化檢測。

    1.5 小鼠血清ALT、AST和肝組織SOD、MDA檢測嚴格按試劑盒說明書的操作,采用賴氏法測定血清ALT、AST活性和肝組織勻漿(按組織塊:生理鹽水=1 ∶9加入到勻漿器中,在冰上研磨,制備成10%肝勻漿)中SOD、MDA水平。

    1.6 小鼠肝組織病理形態(tài)學檢查取肝左葉組織,10%甲醛固定,經乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、5 μm連續(xù)切片、常規(guī)HE染色、中性樹脂封片后,光學顯微鏡下觀察肝組織病理學變化。

    1.7 小鼠肝組織免疫組化取肝左葉組織,10%甲醛固定,石蠟包埋、4 μm連續(xù)切片,60 ℃溫箱烘干,用抗原修復液(檸檬酸緩沖液)修復15 min,3% H2O2室溫避光孵育15 min,再分別加入抗 Grp78 抗體(1 ∶200)、抗 caspase-12 抗體(1 ∶200) 4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h,加入SABC 室溫反應 30 min,DAB 顯色,蘇木精復染,封片,顯微鏡下觀察并拍片。

    1.8 小鼠肝組織TUNEL染色充分脫蠟和水化,利用蛋白酶 k進行細胞通透10-30 min,加入TUNEL 反應液37 ℃反應1 h,加入DAB反應10 min,PBS 的充分清洗 5次,封片,顯微鏡下觀察并拍片。

    1.9 Western blot檢測每組隨機取6塊肝組織測定相關蛋白的表達量。剪取50 mg左右肝組織到2 mL玻璃勻漿器內,同時加入1 mL 蛋白裂解液,于冰上勻漿 5 min 至肉眼看不見纖維,冰上裂解30 min,轉移入預冷的1.5 mL Ep 管中,4 ℃,12 000×g離心 20 min,取上清,用BCA法測定蛋白質濃度,加入上樣緩沖液。取20 μg樣品蛋白經 SDS-PAGE 轉移電泳、抗體免疫、ECL 顯影、曝光等步驟檢測Grp78、caspase-12、caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白表達情況(GADPH 做內參)。

    1.10 實時定量 PCR(RT-PCR)RT-PCR 檢測肝組織中Grp78、caspase-12 mRNA 表達變化,提取肝臟組織總RNA,反轉錄成 cDNA,以 cDNA 為模板進行擴增,檢測 mRNA 表達量。引物序列如下:GRP78 正義鏈5′-ATGATGAAGTTCACTGTGGTGG-3′,反義鏈 5′-CTGATCGTTGGCTATGATCTCC-3′。caspase-12正義鏈5′-TGGCCCATGAATCACATCTAAT-3′ ,反義鏈5′-TGGACAAAGCTTCAGTGTATCT-3′。

    2 結果

    2.1 丹參酮Ⅱ A對衣霉素誘導的急性肝損傷小鼠血清ALT、AST和肝組織勻漿SOD、MDA的影響與正常組相比,模型組小鼠血清ALT、AST和肝組織勻漿MDA活性明顯升高,SOD水平明顯下降。與模型組相比,丹參酮Ⅱ A(20、40 mg·kg-1)和Bif(150 mg·kg-1)均能明顯降低小鼠ALT、AST和MDA活性、升高SOD水平,差異有顯著性(均P<0.05或P<0.01),見Tab 1。

    Tab 1 Effect of tanshinone ⅡA on ALT, AST, SOD and MDA in tunicamycin-induced mice n=10)

    2.2 丹參酮Ⅱ A對衣霉素誘導的急性肝損傷小鼠肝臟、脾臟、胸腺指數的影響與正常組相比,衣霉素模型組小鼠的肝、脾及胸腺指數均明顯升高。與模型組相比,丹參酮Ⅱ A不同劑量和Bif均能明顯降低衣霉素升高的小鼠肝、脾及胸腺指數,見Tab 2。

    Tab 2 Effect of tanshinone ⅡA on liver, spleen, thymus index in liver of tunicamycin-induced mice n=10)

    2.3 丹參酮Ⅱ A對急性肝損傷小鼠肝臟病理損傷和肝細胞凋亡的影響正常小鼠肝組織中肝小葉結構清晰,肝細胞索由中央靜脈向四周整齊排列(Fig 1A),肝組織細胞凋亡較少(Fig 1B),而灌胃衣霉素后小鼠肝小葉結構發(fā)生異常,細胞索結構紊亂,間質間可見較明顯的炎細胞浸潤和大量肝細胞凋亡。丹參酮Ⅱ A(10、20、40 mg·kg-1)和Bif(150 mg·kg-1)均能明顯減輕衣霉素誘導的炎細胞浸潤、細胞索紊亂和肝細胞凋亡(Fig 1)。

    2.4 免疫組化和RT-PCR結果鏡下可見陽性染色的細胞呈棕褐色,正常組小鼠肝組織內Grp78(Fig 2A)和caspase-12(Fig 2B) 蛋白和mRNA均表達較少,誘發(fā)急性肝損傷后,肝組織內 Grp78和caspase-12的蛋白和mRNA表達明顯增多,且主要位于受損肝組織部位。丹參酮Ⅱ A干預后肝組織內Grp78和caspase-12蛋白和mRNA表達明顯減少(Tab 3,Fig 2)。

    Fig 1 Effect of tanshinone ⅡA on pathological changes of liver of tunicamycin-treated mice (scale bar=50 μm)

    Tab 3 Level of Grp78, caspase-12 mRNA in liver of tunicamycin-treated mice n=10)

    2.5 Western blot結果與正常組相比,模型組Grp78、caspase-12、caspase-3、Bax表達明顯增加,Bcl-2明顯減少。丹參酮Ⅱ A干預后肝組織內Grp78、caspase-12、caspase-3、Bax表達水平明顯減少,Bcl-2明顯增加(Fig 3A, 3B)。

    Fig 2 Effect of tanshinone ⅡA on Grp78 and caspase-12 protein expression in liver of tunicamycin-treated mice (scale bar=50 μm)

    Fig 3 Effect of tanshinone ⅡA on Grp78, caspase-9, caspase-3, Bax and Bcl-2 protein levels in liver of tunicamycin-treated mice

    3 討論

    內質網(endoplasmic reticulum,ER)是真核細胞蛋白質合成、鈣離子貯存以及脂質生成的主要場所,是維持細胞正常功能的重要細胞器,當細胞穩(wěn)態(tài)改變時會干擾內質網功能而引起內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[12]。ERS是真核細胞的一種自我保護機制,在ERS早期階段細胞可對抗不良刺激,恢復內質網穩(wěn)態(tài),發(fā)揮自我保護作用,但是ERS反應時間過長或過強時,會激活ERS特異性凋亡程序,以清除受損細胞[12]。衣霉素是一種常用的ERS誘導劑,可通過抑制內質網糖基化,過度激活ERS,介導細胞調亡。已有許多研究報道了使用衣霉素建立小鼠、大鼠、胃癌細胞、成骨細胞、神經細胞、脂肪細胞等ERS體內和體外模型[2,14-15],如衣霉素體外刺激小鼠成骨細胞MC3T3-E1誘導ERS[16]。最近也有研究發(fā)現,采用衣霉素體內給藥還可激活肝細胞ERS導致肝臟損傷和肝細胞調亡,但相關報道較少,仍有待進一步驗證。

    為進一步考察衣霉素誘導ERS小鼠肝損傷的效果和機制,本研究采用衣霉素1 mg·kg-1單次灌胃給藥24 h,誘導小鼠ERS急性肝損傷模型。HE染色結果顯示,模型組小鼠肝組織細胞明顯腫脹,肝小葉界限模糊,并存在少量炎細胞浸潤和肝細胞壞死;同時模型組小鼠肝指數、脾指數及胸腺指數均明顯增加,血清中AST、ALT水平和肝組織勻漿中MDA活性明顯升高、SOD活性明顯下降,以上結果提示造模小鼠已發(fā)生肝損傷。葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78kD,Grp78),又名免疫球蛋白重鏈結合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein,Bip)是ERS發(fā)生的重要標志物,Grp78/Bip水平可直接反映細胞的ERS水平,本研究結果顯示,模型組小鼠肝組織中Grp78/Bip蛋白表達明顯增加,表明衣霉素成功激活了小鼠肝細胞ERS反應。門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶12(cysteine aspartic acid specific protease-12,caspase-12)是內質網特異性的凋亡效應蛋白,其可通過切割Bid 蛋白,促使活性的 p15 Bid 蛋白釋放和堆積,激活凋亡執(zhí)行因子caspase-3,從而抑制或活化 Bax、Bcl-2等凋亡相關蛋白的表達,誘導細胞凋亡[17]。本研究Western blot結果顯示,模型組小鼠肝組織中caspase-12、caspase-3及Bax表達明顯升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯下降,表明衣霉素可能是通過過度激活ERS觸發(fā) Grp78/caspase-12 信號通路誘導了肝細胞的凋亡。因此,通過阻斷ERS觸發(fā) Grp78/caspase-12 信號通路的活化可能是防治肝損傷的全新思路。

    丹參酮是從中藥丹參中提取的脂溶性菲醌化合物。大量研究發(fā)現,丹參酮Ⅱ A具有抗微生物、抗炎、抗腫瘤、降血糖等多種藥理作用[18]。許多研究證實,丹參酮Ⅱ A可通過調節(jié)PPARα、Nrf2/ARE、MEK/ERK/mTOR 等通路有效改善急性肝損傷小鼠的病理損傷[3-5],但丹參酮Ⅱ A能否通過通路調控ERS觸發(fā)的caspase-12/caspase-3信號通路而發(fā)揮抗肝損傷的作用,尚未見報道。本研究將聯苯雙酯和不同濃度丹參酮Ⅱ A對衣霉素誘導的ERS小鼠進行預先給藥后發(fā)現,與模型組相比,聯苯雙酯和丹參酮Ⅱ A均能明顯減輕衣霉素誘導的炎細胞浸潤、細胞索紊亂和肝細胞凋亡,降低小鼠血清中 AST、ALT水平,升高肝組織中SOD含量,而減少 MDA 含量,提示丹參酮Ⅱ A對衣霉素誘導的小鼠急性肝損傷具有較好的保護作用。同時Western blot結果顯示,與模型組相比,丹參酮Ⅱ A治療組小鼠肝組織中Grp78/Bip、caspase-12、caspase-3及Bax表達明顯下降,而抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯升高,表明丹參酮Ⅱ A可能是通過下調 Grp78/Bip 蛋白表達,拮抗ERS 觸發(fā) Grp78/caspase-12 通路的激活,發(fā)揮其抗凋亡的作用。

    綜上表明,丹參酮Ⅱ A對衣霉素引起的損傷肝細胞具有一定的保護作用,其機制可能與其抑制 ERS 觸發(fā)的 Grp78/caspase-12 信號通路活化有關。本文為解釋急性肝損傷的發(fā)病機制提供了新的思路,也進一步驗證了丹參酮Ⅱ A對急性肝損傷的治療作用。此外,抑制Grp78/caspase-12 通路激活也有望成為臨床治療急性肝損傷的新策略及藥物研發(fā)的新思路。

    猜你喜歡
    勻漿丹參酮肝細胞
    外泌體miRNA在肝細胞癌中的研究進展
    Systematic Review and Meta-analysis of Tanshinone Capsule in the Treatment of Polycystic Ovary Syndrome
    Medicinal Plant(2020年2期)2020-05-14 12:11:26
    勻漿法提取沙棗果總黃酮工藝研究
    植物研究(2018年4期)2018-07-24 00:52:26
    丹參酮ⅡA提取工藝的優(yōu)化
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:45
    丹參酮Ⅱ A 保護大鼠腎移植術后缺血再灌注損傷的機制研究
    不同誘導方式制備的大鼠肝勻漿代謝酶活性及凍儲方式的比較
    肝細胞程序性壞死的研究進展
    肝細胞癌診斷中CT灌注成像的應用探析
    前列安丸對瓊脂所致慢性前列腺炎模型大鼠前列腺勻漿中IgG和血清Zn的影響
    SIAh2與Sprouty2在肝細胞癌中的表達及臨床意義
    又黄又粗又硬又大视频| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 大片电影免费在线观看免费| 黄色片一级片一级黄色片| 婷婷色综合大香蕉| 中文欧美无线码| 99热国产这里只有精品6| 99精品久久久久人妻精品| 国产亚洲欧美精品永久| 丰满迷人的少妇在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产亚洲精品第一综合不卡| 天天添夜夜摸| 亚洲欧洲国产日韩| 99久久综合免费| 午夜视频精品福利| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 色婷婷av一区二区三区视频| 电影成人av| 操美女的视频在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 极品人妻少妇av视频| 波多野结衣一区麻豆| 黄色视频不卡| 欧美黑人精品巨大| 国产xxxxx性猛交| 亚洲国产精品国产精品| tube8黄色片| 悠悠久久av| 丝袜在线中文字幕| 欧美日韩黄片免| 97在线人人人人妻| 久久精品国产a三级三级三级| 超碰97精品在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 人妻人人澡人人爽人人| 欧美日韩av久久| 亚洲三区欧美一区| 一区福利在线观看| 精品人妻在线不人妻| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 晚上一个人看的免费电影| 男人添女人高潮全过程视频| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 欧美变态另类bdsm刘玥| 最新的欧美精品一区二区| 伦理电影免费视频| 老汉色∧v一级毛片| 99re6热这里在线精品视频| 香蕉国产在线看| 国产成人av激情在线播放| 亚洲精品在线美女| 亚洲精品美女久久av网站| 一区在线观看完整版| 免费在线观看日本一区| 午夜视频精品福利| 国产成人精品在线电影| 精品久久蜜臀av无| 丝袜美足系列| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 精品免费久久久久久久清纯 | 久热这里只有精品99| 国产成人精品无人区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 在现免费观看毛片| 国产av一区二区精品久久| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日本av手机在线免费观看| 黄色 视频免费看| 久久av网站| 两性夫妻黄色片| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 18禁国产床啪视频网站| 午夜激情av网站| 少妇人妻 视频| 欧美日韩视频精品一区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 少妇的丰满在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产精品免费大片| 美国免费a级毛片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美在线一区亚洲| 亚洲免费av在线视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美国产精品va在线观看不卡| 老司机靠b影院| 另类亚洲欧美激情| 岛国毛片在线播放| 亚洲av国产av综合av卡| 大码成人一级视频| 国产在视频线精品| 亚洲av在线观看美女高潮| 黄色一级大片看看| 大香蕉久久成人网| 91麻豆av在线| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 超色免费av| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 搡老乐熟女国产| 精品福利观看| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲第一青青草原| 日韩av不卡免费在线播放| 观看av在线不卡| 国产成人av激情在线播放| 一级黄色大片毛片| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲第一青青草原| av网站免费在线观看视频| 国产成人91sexporn| 国产成人a∨麻豆精品| 久久久久国产精品人妻一区二区| www.自偷自拍.com| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产亚洲欧美精品永久| 一区二区三区乱码不卡18| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久精品国产亚洲av涩爱| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲视频免费观看视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 麻豆av在线久日| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产成人a∨麻豆精品| 热re99久久精品国产66热6| 久久天堂一区二区三区四区| 免费观看人在逋| 午夜老司机福利片| 99国产精品99久久久久| 一二三四在线观看免费中文在| 国产片特级美女逼逼视频| 国产高清视频在线播放一区 | 午夜福利一区二区在线看| 亚洲人成77777在线视频| 少妇人妻久久综合中文| av国产久精品久网站免费入址| 午夜视频精品福利| 亚洲国产日韩一区二区| 久久精品亚洲av国产电影网| 欧美大码av| 狂野欧美激情性bbbbbb| 精品一区二区三卡| 色网站视频免费| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲av片天天在线观看| 成年av动漫网址| av有码第一页| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 高清av免费在线| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲人成77777在线视频| h视频一区二区三区| 欧美日韩综合久久久久久| 桃花免费在线播放| www日本在线高清视频| 超碰97精品在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 婷婷色综合大香蕉| 国产成人精品久久二区二区免费| 成年av动漫网址| 亚洲成色77777| 国产国语露脸激情在线看| 丁香六月欧美| 自线自在国产av| 精品国产乱码久久久久久男人| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 欧美日韩精品网址| 一区福利在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| 国产97色在线日韩免费| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 在线观看人妻少妇| 女人久久www免费人成看片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 久久精品久久精品一区二区三区| 久久久久久久国产电影| 黄色视频不卡| 少妇人妻 视频| 日韩免费高清中文字幕av| 在线观看www视频免费| 欧美人与善性xxx| 1024视频免费在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 老司机靠b影院| 欧美人与善性xxx| 深夜精品福利| 免费看十八禁软件| 久久热在线av| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 夫妻性生交免费视频一级片| 性高湖久久久久久久久免费观看| 成在线人永久免费视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品 欧美亚洲| 97精品久久久久久久久久精品| 日本91视频免费播放| 国产成人一区二区在线| 久久精品国产亚洲av涩爱| 大陆偷拍与自拍| 亚洲av成人精品一二三区| av一本久久久久| 亚洲五月色婷婷综合| 久久av网站| 亚洲天堂av无毛| 免费一级毛片在线播放高清视频 | h视频一区二区三区| 亚洲精品一二三| 国产男女超爽视频在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 老司机午夜十八禁免费视频| 精品一区在线观看国产| av国产久精品久网站免费入址| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| av国产久精品久网站免费入址| 一二三四在线观看免费中文在| 精品人妻1区二区| 在线观看一区二区三区激情| 两个人免费观看高清视频| 欧美日韩综合久久久久久| 日韩伦理黄色片| 丁香六月欧美| 十八禁高潮呻吟视频| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲精品美女久久av网站| 黑丝袜美女国产一区| 人人妻人人澡人人看| av网站在线播放免费| 亚洲国产精品一区三区| 大片免费播放器 马上看| 青青草视频在线视频观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 日本色播在线视频| 男女边吃奶边做爰视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 9热在线视频观看99| 欧美在线黄色| cao死你这个sao货| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品国产乱码久久久久久男人| 少妇人妻久久综合中文| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲男人天堂网一区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 五月天丁香电影| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 97在线人人人人妻| 日韩av不卡免费在线播放| 免费在线观看日本一区| 丝瓜视频免费看黄片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 色视频在线一区二区三区| 亚洲伊人色综图| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 成人三级做爰电影| 国产精品一区二区精品视频观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久免费观看电影| 制服人妻中文乱码| 国产精品久久久久久精品古装| 久久精品国产亚洲av涩爱| 成人黄色视频免费在线看| 伦理电影免费视频| 欧美日韩av久久| 日韩视频在线欧美| 亚洲黑人精品在线| 免费不卡黄色视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 天堂8中文在线网| 精品人妻1区二区| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美日韩视频精品一区| svipshipincom国产片| 亚洲精品日本国产第一区| 午夜福利乱码中文字幕| 欧美精品一区二区大全| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品国产国语对白av| 精品亚洲成a人片在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| bbb黄色大片| 99久久99久久久精品蜜桃| 午夜视频精品福利| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日韩一本色道免费dvd| 国产视频首页在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 婷婷色综合www| 极品少妇高潮喷水抽搐| 精品人妻在线不人妻| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲国产中文字幕在线视频| 一区二区三区乱码不卡18| 国产深夜福利视频在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 少妇人妻 视频| 午夜福利视频精品| videos熟女内射| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 在线观看免费午夜福利视频| 中文字幕高清在线视频| 五月天丁香电影| 午夜免费男女啪啪视频观看| 欧美精品一区二区大全| 在线av久久热| 91九色精品人成在线观看| 在线观看人妻少妇| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 日本一区二区免费在线视频| 精品国产国语对白av| 国产精品久久久av美女十八| 伊人亚洲综合成人网| 两个人看的免费小视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区三 | 青春草视频在线免费观看| 日本a在线网址| 国产成人91sexporn| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 免费观看av网站的网址| 国产男女内射视频| 午夜激情av网站| 在线观看免费视频网站a站| 久久精品成人免费网站| 日韩av免费高清视频| 97人妻天天添夜夜摸| 一区福利在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| 大码成人一级视频| 国产精品免费视频内射| 午夜福利,免费看| 麻豆国产av国片精品| 国产av国产精品国产| 97在线人人人人妻| 永久免费av网站大全| 亚洲精品av麻豆狂野| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲天堂av无毛| 老司机影院成人| 看免费成人av毛片| 两人在一起打扑克的视频| 手机成人av网站| 黄色一级大片看看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久亚洲精品不卡| 男女免费视频国产| 十分钟在线观看高清视频www| 在线 av 中文字幕| 久久av网站| 色婷婷av一区二区三区视频| 97人妻天天添夜夜摸| 成人午夜精彩视频在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 一区二区三区四区激情视频| 在线观看人妻少妇| 亚洲精品自拍成人| 日日爽夜夜爽网站| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 麻豆av在线久日| 亚洲精品久久午夜乱码| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 大陆偷拍与自拍| 最新在线观看一区二区三区 | 性色av一级| 五月开心婷婷网| 亚洲一区中文字幕在线| 丝袜喷水一区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 操美女的视频在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲国产日韩一区二区| 久久久国产一区二区| 国产成人欧美| 亚洲av日韩在线播放| 高清不卡的av网站| 黄片小视频在线播放| 国产精品人妻久久久影院| 老熟女久久久| 超色免费av| 精品福利观看| 亚洲av电影在线进入| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 999精品在线视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 一级毛片电影观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 99国产精品一区二区蜜桃av | 日韩av不卡免费在线播放| 搡老乐熟女国产| 国产在线一区二区三区精| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 精品少妇内射三级| 国产真人三级小视频在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 青春草亚洲视频在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 日本五十路高清| 两性夫妻黄色片| 亚洲国产欧美网| 亚洲精品一二三| 在线av久久热| 婷婷色av中文字幕| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 黄片播放在线免费| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产成人精品无人区| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 一级毛片电影观看| 美女午夜性视频免费| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 一区二区三区激情视频| 真人做人爱边吃奶动态| 日韩 亚洲 欧美在线| 老汉色av国产亚洲站长工具| 麻豆国产av国片精品| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久 成人 亚洲| 超碰97精品在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 丰满迷人的少妇在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 九草在线视频观看| 成人国产av品久久久| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲九九香蕉| 一边亲一边摸免费视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产高清国产精品国产三级| 欧美成人午夜精品| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品人妻久久久影院| 99热全是精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 一级片'在线观看视频| 欧美日韩av久久| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲成人免费电影在线观看 | 亚洲 国产 在线| 日本一区二区免费在线视频| 波多野结衣av一区二区av| 成人三级做爰电影| 18禁国产床啪视频网站| av在线播放精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 日韩免费高清中文字幕av| 久久99一区二区三区| 少妇 在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 老熟女久久久| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 蜜桃在线观看..| 亚洲精品久久午夜乱码| 午夜福利在线免费观看网站| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产深夜福利视频在线观看| 大码成人一级视频| 免费在线观看完整版高清| 黄色毛片三级朝国网站| 国产伦人伦偷精品视频| 一级黄色大片毛片| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲成人免费av在线播放| 美女扒开内裤让男人捅视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产免费视频播放在线视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久性视频一级片| 乱人伦中国视频| 亚洲综合色网址| 亚洲成人国产一区在线观看 | 永久免费av网站大全| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 日韩伦理黄色片| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 在线精品无人区一区二区三| 99九九在线精品视频| 人成视频在线观看免费观看| 麻豆乱淫一区二区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 97在线人人人人妻| 国产精品 欧美亚洲| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久久精品区二区三区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 我的亚洲天堂| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 97人妻天天添夜夜摸| 麻豆国产av国片精品| 欧美精品高潮呻吟av久久| 成人影院久久| 亚洲成色77777| 欧美日韩av久久| 最黄视频免费看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 精品第一国产精品| 色网站视频免费| 国产黄色视频一区二区在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲国产精品一区三区| 免费高清在线观看日韩| 一级a爱视频在线免费观看| 少妇精品久久久久久久| 男女国产视频网站| 国产成人精品在线电影| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产精品免费大片| 欧美激情极品国产一区二区三区| 在现免费观看毛片| 制服诱惑二区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 精品第一国产精品| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产精品一二三区在线看| 亚洲av男天堂| 亚洲av美国av| 一本综合久久免费| 只有这里有精品99| 涩涩av久久男人的天堂| 9色porny在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 七月丁香在线播放| 深夜精品福利| 我要看黄色一级片免费的| 中文欧美无线码| 在线观看人妻少妇| 久久国产精品人妻蜜桃| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产成人欧美在线观看 | 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲av国产av综合av卡| 国产亚洲精品第一综合不卡| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 日韩av免费高清视频| 国产在线免费精品| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 1024香蕉在线观看| 超碰成人久久| 一区在线观看完整版| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲色图综合在线观看| 美女大奶头黄色视频| 老熟女久久久| 9色porny在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 美女视频免费永久观看网站| 一级片'在线观看视频| 女人久久www免费人成看片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 两人在一起打扑克的视频| 午夜福利,免费看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 视频区图区小说| 国产91精品成人一区二区三区 | 在线观看免费高清a一片| a级毛片在线看网站| 97在线人人人人妻| 黄色a级毛片大全视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 首页视频小说图片口味搜索 | 搡老乐熟女国产| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲熟女毛片儿| 女警被强在线播放| 免费少妇av软件| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日本五十路高清| 黄色片一级片一级黄色片| 婷婷色av中文字幕| 日韩av不卡免费在线播放| 又黄又粗又硬又大视频| 国产熟女欧美一区二区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美在线一区亚洲|