右美托咪定通過(guò)調(diào)控SIGIRR/NF-κB信號(hào)對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷的影響

王鵬程，王 震，代彥文，王 濤

(1. 黃淮學(xué)院直屬附屬駐馬店市中心醫(yī)院麻醉科，河南 駐馬店 463003；2.鄭州大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，河南 鄭州 450001)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是臨床上常見的急危重癥之一，其死亡率一直居高不下。研究證實(shí)ALI危害主要是由于機(jī)體炎癥反應(yīng)失衡引起肺組織破壞，主要表現(xiàn)為各組炎癥細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α等)的釋放增多，炎癥細(xì)胞因子過(guò)量釋放誘導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而加重肺組織損傷[1]。因此，通過(guò)有效的處理措施降低并抑制炎癥風(fēng)暴可能是預(yù)防和治療ALI的有效措施，但是目前有關(guān)其特異性炎癥治療仍然缺乏。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)被認(rèn)為是固有免疫系統(tǒng)中炎癥反應(yīng)的主要受體之一，TLR信號(hào)通路的過(guò)度激活是誘發(fā)機(jī)體炎癥失衡的重要機(jī)制[2-3]。

單免疫球蛋白白細(xì)胞介素1受體相關(guān)蛋白(single immunoglobulin interleukin-1 receptor related protein，SIGIRR)是近期新發(fā)現(xiàn)的TLR超家族成員之一，是TLR信號(hào)傳導(dǎo)中的負(fù)性調(diào)控分子[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，SIGIRR主要在肺泡及氣道上皮細(xì)胞中高表達(dá)，LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI肺組織SIGIRR表達(dá)下調(diào)[5]。過(guò)表達(dá)SIGIRR可以抑制LPS誘發(fā)的肺泡上皮細(xì)胞TLR4信號(hào)傳導(dǎo)，繼而減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮肺泡上皮細(xì)胞的保護(hù)作用[6]。以上研究均表明，SIGIRR在ALI的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)SIGIRR的表達(dá)對(duì)改善LPS誘導(dǎo)的ALI具有重要意義。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是臨床上常用的一種催眠、鎮(zhèn)靜以及鎮(zhèn)痛的麻醉藥物，其作為腎上腺素能受體的選擇性激動(dòng)劑，有文獻(xiàn)研究證實(shí)DEX能夠減輕LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺和腎損傷[7]。另外，DEX能夠通過(guò)降低TLR4表達(dá)，抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，進(jìn)而減輕LPS誘導(dǎo)的ALI肺損傷和炎癥反應(yīng)[8]。但是有關(guān)DEX對(duì)大鼠ALI肺損傷的分子作用機(jī)制尚不完全清楚。因此，該研究擬通過(guò)建立LPS誘導(dǎo)大鼠ALI模型，初步揭示DEX對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠ALI肺損傷的影響及其保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)，♂，4-6周齡，SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水，晝夜交替光照，溫度維持在(20-25)℃，相對(duì)濕度60%-70%。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 胎牛血清和細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)買于Gibco公司，SIGIRR小鼠單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司，貨號(hào)：8242)，NF-κB兔單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司，貨號(hào)：59674)；p-NF-κB兔單克隆抗體(Abcam公司，貨號(hào)：3786)，β-actin小鼠單克隆抗體(碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：AF5001)，山羊抗兔二抗(碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：A0409)，山羊抗小鼠二抗(碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：A0413)，Western blot一抗稀釋液(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：P0256)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：P0011)，ECL發(fā)光液(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：P0018FS)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋公司)，蛋白質(zhì)凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：ND11-GIS-300)，多功能酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio-Tek公司，型號(hào)：SuPerMax 3100)，熒光顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)：BX53)，高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀公司，型號(hào)：H2500R2)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物模型構(gòu)建與分組 實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，期間自由飲水。實(shí)驗(yàn)選取40只SD大鼠，每組各10只，并隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control)、DEX對(duì)照組(DEX)、LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI模型組(LPS)以及LPS+DEX處理組(LPS+DEX)。其中對(duì)于LPS組和LPS+DEX組大鼠采用腹腔注射LPS(5 mg·kg-1)構(gòu)建ALI大鼠損傷模型，Control組和DEX組大鼠給予等量的0.9%的氯化鈉注射。在DEX預(yù)處理實(shí)驗(yàn)中(DEX組和LPS+DEX組)，應(yīng)在LPS大鼠腹腔注射前1 h均給予DEX(25 μg·kg-1)大鼠腹腔注射。實(shí)驗(yàn)各組大鼠在確證LPS誘導(dǎo)ALI大鼠損傷模型構(gòu)建成功后，采用戊巴比妥鈉麻醉大鼠并對(duì)各組大鼠肺組織進(jìn)行病理學(xué)取材，檢測(cè)。

1.2.2各組大鼠肺濕/干質(zhì)量比(W/D)檢測(cè) 大鼠麻醉后，取出右肺中葉組織，快速利用PBS緩沖溶液沖洗組織表面的血液之后采用濾紙吸干組織表面的水分，稱取肺組織濕質(zhì)量(W)，之后將各組濕肺組織放置于75 ℃的恒溫烤箱中進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)12 h的烘烤，待烘干至質(zhì)量不變后測(cè)定肺組織干質(zhì)量(D)。

1.2.3蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變 采用4%的多聚甲醛固定大鼠右肺組織，石蠟包埋、病理學(xué)切片(5 μm)，按照HE染色規(guī)范操作步驟進(jìn)行HE病理學(xué)染色。

1.2.4ELISA檢測(cè)各組大鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中IL-1β、IL-6和TNF-α含量 分離大鼠氣管并夾閉右側(cè)肺支氣管，結(jié)扎肺門，將事先預(yù)冷的PBS從大鼠左側(cè)支氣管中進(jìn)行肺泡灌洗，收集左支氣管肺泡灌洗液，于4 ℃條件下，12 000 r·min-1，離心10 min，取上清液，之后按照對(duì)應(yīng)的ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5免疫組化檢測(cè)各組大鼠右肺組織SIGIRR表達(dá)、NF-κB活化情況 將大鼠右肺組織的石蠟切片置于60 ℃烤箱內(nèi)脫蠟，然后二甲苯浸洗，梯度乙醇溶液脫水。將右肺組織切片置于10 nmol·L-1的檸檬酸鹽緩沖溶液中，90 ℃抗原修復(fù)30 min。室溫條件下，自然冷卻并用去離子水緩慢沖洗。采用3%的H2O2溶液孵育10 min后，加入10%的BSA溶液封閉20 min。加入SIGIRR小鼠單克隆抗體和p-NF-κB兔單克隆抗體(工作液體積稀釋比例為1 ∶200)，4 ℃條件下孵育過(guò)夜。加入對(duì)應(yīng)山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗，室溫條件下孵育30 min。滴加DAB顯色液，顯色后拍照，觀察右肺組織中SIGIRR表達(dá)和NF-κB磷酸化水平。

1.2.6Western blot 檢測(cè)各組大鼠右肺組織中SIGIRR、NF-κB表達(dá) 取各組大鼠右肺組織，PBS潤(rùn)洗1-2次，離心，加入細(xì)胞組織裂解液(體積比為1 ∶5)，冰上裂解1 h；4 ℃、12 000×g離心15 min，收集上清液，采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度定量檢測(cè)；然后取各組大鼠右肺組織總蛋白30 μg，上樣至聚丙烯酰胺80 V凝膠電泳，80 V電泳30 min后，轉(zhuǎn)120 V、電泳60 min。選取目的膠條，采用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時(shí)長(zhǎng)2 h，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育SIGIRR小鼠單克隆抗體(1 ∶1 000)，NF-κB兔單克隆抗體(1 ∶1 000)，p-NF-κB兔單克隆抗體(1 ∶1 000)以及β-actin小鼠單克隆抗體(1 ∶2 000)，4 ℃過(guò)夜，孵育對(duì)應(yīng)的山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)1-2 h；搖床搖晃上加TPBS洗滌3次，5 min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織W/D、IL-1β、IL-6和TNF-α比較與Control組相比，LPS處理組大鼠肺組織W/D以及BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均明顯增加(P<0.01)，DEX組大鼠肺組織W/D以及BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量差異差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與LPS處理組相比，LPS+DEX組肺組織W/D以及BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均明顯降低(P<0.05或P<0.01)(Tab 1)。

Tab 1 Comparison of W/D in lung tissues and contents of IL-1β, IL-6 and TNF-α in BALF of rats in each group n=6)

2.2 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化Control組和DEX組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔輪廓光滑清晰，肺泡間隔無(wú)典型性的水腫現(xiàn)象，以及炎癥細(xì)胞過(guò)度浸潤(rùn)等情況改變。LPS處理組大鼠肺組織出現(xiàn)明顯的病理性損傷，肺泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)嚴(yán)重的破壞，肺泡壁明顯水腫，肺間質(zhì)增厚并伴有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。LPS+DEX組大鼠肺組織損傷程度減輕，但是肺泡結(jié)構(gòu)有部分損壞，間質(zhì)有少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并伴有肺泡腔液體滲出等(Fig 1)。

Fig 1 Effect of DEX on histopathological changes of lung tissues in LPS induced ALI rats (×400)A：Control；B：DEX；C：LPS；D： LPS+DEX

2.3 DEX降低LPS誘導(dǎo)大鼠肺組織SIGIRR蛋白降解與Control組相比，LPS處理組大鼠肺組織中SIGIRR表達(dá)明顯降低(P<0.01)，DEX組大鼠肺組織SIGIRR表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與LPS組相比，LPS+DEX組大鼠肺組織SIGIRR表達(dá)顯著增加(P<0.01)(Fig 2)。

2.4 DEX抑制大鼠肺組織NF-κB磷酸化與Control組相比，LPS處理組大鼠肺組織NF-κB磷酸化活化增強(qiáng)(P<0.01)，DEX處理組大鼠肺組織NF-κB磷酸化活化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與LPS組相比，LPS+DEX組大鼠肺組織NF-κB磷酸化活化降低(P<0.05)(Fig 3)。

Fig 2 Effect of DEX on expression of SIGIRR of lung tissues in LPS induced ALI rats n=6)

Fig 3 Effect of DEX on expression of NF-κB of lung tissues in LPS induced ALI rats n=6)

3 討論

ALI具有高發(fā)病率和高死亡率，是一種常見的肺部疾病，也是急性呼吸衰竭重要危險(xiǎn)因素。炎癥細(xì)胞因子過(guò)度激活以及促炎介質(zhì)的過(guò)量產(chǎn)生是導(dǎo)致ALI發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。其中炎癥性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α在ALI中發(fā)揮重要作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β能夠通過(guò)改變肺泡上皮細(xì)胞和血管的通透性，誘發(fā)肺部水腫并最終導(dǎo)致ALI[10]。以上研究均表明，炎癥反應(yīng)的失衡是引發(fā)ALI的關(guān)鍵因素。因此，通過(guò)探尋藥物有效調(diào)控炎癥因子的釋放對(duì)于改善ALI誘發(fā)的肺損傷具有重要作用。DEX臨床上具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、催眠，對(duì)呼吸作用幾乎無(wú)抑制作用等特點(diǎn)。新近研究發(fā)現(xiàn)，DEX能夠通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、降低炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，緩解炎癥反應(yīng)等作用[11]。在膿毒癥患者中，DEX能夠降低患者血清中炎癥因子水平，緩解機(jī)體炎癥[12]。另外，有研究報(bào)道DEX能夠減輕膿毒癥大鼠肺水腫程度，其可能通過(guò)降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[13]。

SIGIRR基因是位于11號(hào)染色體，p15.5號(hào)條帶上，其編碼的蛋白質(zhì)具有Ig細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域以及胞內(nèi)尾區(qū)組成[4]。既往文獻(xiàn)顯示SIGIRR在組織中廣泛表達(dá)，主要包括腎臟、消化道、肝臟以及肺組織等，廣泛參與了炎癥、腫瘤相關(guān)炎癥和自身免疫性疾病[14]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激的肺泡上皮細(xì)胞中SIGIRR蛋白表達(dá)下調(diào)[5]。過(guò)表達(dá)SIGIRR能夠抑制HMGB1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-1β，緩解ALI大鼠肺部損傷[15]。本研究首先通過(guò)大鼠腹腔注射LPS構(gòu)建ALI模型，探究DEX對(duì)ALI肺部損傷的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，與Control組相比，LPS處理組大鼠肺組織W/D以及BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均明顯增加，DEX組大鼠肺組織W/D以及BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量無(wú)明顯變化。病理學(xué)染色顯示Control組和DEX組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變，結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔輪廓清晰，肺泡間隔無(wú)明顯水腫以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況改變。LPS處理組大鼠肺組織出典型的病理學(xué)改變，以上結(jié)果表明ALI模型構(gòu)建成功。與LPS處理組相比，LPS+DEX組肺組織W/D以及BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均明顯降低，病理?yè)p傷減輕，表明DEX能夠通過(guò)降低肺部炎癥反應(yīng)，緩解LPS誘導(dǎo)的ALI肺部損傷。為進(jìn)一步探究DEX對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI的作機(jī)制涉及SIGIRR基因。本研究通過(guò)免疫組化和Western blot檢測(cè)各組大鼠肺組織SIGIRR蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與Control組相比，LPS處理組大鼠肺組織中SIGIRR表達(dá)明顯降低，DEX組大鼠肺組織SIGIRR表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與LPS組相比，LPS+DEX組大鼠肺組織SIGIRR表達(dá)明顯增加，表明DEX可能通過(guò)降低LPS誘導(dǎo)SIGIRR降解，降低IL-1β、IL-6和TNF-α，進(jìn)而緩解ALI肺損傷。NF-κB被研究證實(shí)作為炎癥反應(yīng)中心成員之一，能夠激活炎癥細(xì)胞因子。既往研究過(guò)表達(dá)SIGIRR可以抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞NF-κB活化，降低炎癥反應(yīng)，從而誘發(fā)肺泡保護(hù)作用[16]。而在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)LPS組大鼠肺組織NF-κB活化增加，LPS+DEX組肺組織NF-κB活化降低。TLR信號(hào)觸發(fā)后，可以通過(guò)MyD88依賴性途徑和MyD88肺依賴性途徑激活NF-κB。

綜上所述，DEX能夠降低IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，從而緩解ALI肺損傷，其機(jī)制可能與降低LPS誘導(dǎo)SIGIRR降解，從而抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。